不同烹飪方式下烹飪時間對西蘭花中蘿卜硫苷和蘿卜硫素的影響

盧 旭，馬紹英，李 勝,，張聰聰，包金玉，張秀民

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，甘肅 蘭州 730070）

西蘭花（Brassica oleraceavar.italica）是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，含有多種有益化合物，例如硫代葡萄糖苷（簡稱為硫苷）、蛋白質(zhì)和VC等[1]。硫苷是十字花科蔬菜中一種重要的次生代謝物質(zhì)。西蘭花中主要的硫苷有蘿卜硫苷（glucoraphanin，GRA）、屈曲花苷、3-吲哚基甲基硫苷和1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷[2-4]，其中GRA占西蘭花中總硫苷含量的50%以上[5-6]。GRA本身并無生物活性[7]，當(dāng)植物受到機械損傷或被食用時，GRA與內(nèi)源芥子酶（myrosinase，MYR）發(fā)生酶解反應(yīng)生成一系列產(chǎn)物，包含異硫氰酸鹽（isothiocyanates，ITC）、硫氰酸鹽和腈[8-10]。GRA的酶解產(chǎn)物蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）被認為是最有效的天然抗癌化合物之一[11]，研究表明SFN能夠抑制體內(nèi)I相致癌酶的產(chǎn)生，誘導(dǎo)產(chǎn)生II相解毒酶，如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、苯醌氧化還原酶和血紅素氧化酶I等，并增強其活性和競爭性，抑制CYP2EI化學(xué)致癌基因的表達，從而保護DNA、RNA、蛋白質(zhì)等體內(nèi)大分子不受損傷[12-15]。

日常生活中，大多數(shù)蔬菜在食用前一般都會經(jīng)過烹飪加工，研究發(fā)現(xiàn)烹飪不僅會引起蔬菜中化學(xué)成分的顯著變化，而且會影響化學(xué)預(yù)防化合物的生物利用度和含量[1]。一些研究表明選擇適當(dāng)?shù)呐腼兎椒梢栽鰪娀衔锏目捎眯?，從而改善健康狀況。Rungapamestry等[16]研究發(fā)現(xiàn)食用微波加熱2 min的西蘭花后，人體對SFN的吸收提高了大約3 倍。Tabart等[17]用不同烹飪方式處理西蘭花，微波烹飪的第1分鐘SFN含量增加了4～6 倍，第5分鐘SFN含量增加了1.7 倍。目前，大多數(shù)家庭主要采取蒸、煮、炒和微波的烹飪方式加工蔬菜。許多研究表明，煮、炒和微波這3 種烹飪方式會造成西蘭花中硫苷和ITC的大量損失[18-20]；相比之下，蒸制對其造成的損失最小，因此很多學(xué)者認為蒸制是較好的選擇。然而這4 種烹飪方式都會對西蘭花中的內(nèi)源MYR活性造成不可逆的損失和抑制，導(dǎo)致GRA-SFN轉(zhuǎn)化和人體對SFN的吸收降低。為了增加人體對SFN的吸收，可以考慮在食用過程中添加外源MYR來提高GRA-SFN的轉(zhuǎn)化率。本實驗主要研究了4 種常用的家庭烹飪方式（蒸、煮、炒和微波）及烹飪時間對西蘭花中GRA和SFN含量的影響，以及添加外源MYR對西蘭花中GRA-SFN轉(zhuǎn)化率的影響，以期為人們選擇適宜的烹飪方法、提高西蘭花有益化合物的獲取量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以蘭州桃海市場購買的新鮮‘瑞農(nóng)’西蘭花為實驗材料，用蒸餾水沖洗干凈，晾干后置于4 ℃冰箱待用。

甲醇（色譜純）、乙酸乙酯、體積分數(shù)95%乙醇溶液、四甲基溴化銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、丙三醇、硫酸銨、抗壞血酸、二硫蘇糖醇、聚乙二醇6000 甘肅中瑞化工有限公司；黑芥子硫苷酸鉀、GRA、SFN標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能電熱鍋 山東淄博周村楠北電器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DS-8510DTH型超聲波振蕩儀 上海生析超聲儀器有限公司；雷磁DDSJ-308F電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司； DW-86L390低溫保存箱 青島澳柯瑪股份有限公司； BCD-642WDVMU1冰箱 青島海爾股份有限公司； CTO-15C高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 烹飪方法

本實驗采用了蒸、煮、炒和微波4 種烹飪方法，實驗樣品處理方法如下，所有處理均重復(fù)3 次。

蒸：準(zhǔn)確稱取西蘭花5 g，稱取6 份，按料液比1∶100在蒸鍋內(nèi)加入3 000 mL蒸餾水，800 W下加熱至沸騰后，將稱好的西蘭花放置在蒸盤上分別蒸制0、1、2、4、6、8 min，處理完成后室溫下冷卻，吸液紙吸干表面的水后液氮速凍，置于低溫冰箱（－70 ℃）待用。

煮：準(zhǔn)確稱取西蘭花5 g，稱取6 份，按料液比1∶100在蒸鍋內(nèi)加入3 000 mL蒸餾水，800 W下加熱至沸騰后，將稱好的西蘭花放置在蒸鍋內(nèi)分別煮制0、1、2、4、6、8 min，處理完成后室溫下冷卻，吸液紙吸干表面的水后液氮速凍，置于低溫冰箱（－70 ℃）待用。

炒：準(zhǔn)確稱取西蘭花5 g，稱取6 份，在蒸鍋內(nèi)加入10 mL菜籽油，油熱后將西蘭花倒入鍋內(nèi)進行翻炒。分別炒制0、1、2、4、6、8 min后室溫下冷卻，吸油紙吸干材料表面的油后液氮速凍，置于低溫冰箱（－70 ℃）待用。

微波：準(zhǔn)確稱取西蘭花5 g，稱取6 份，將稱好的西蘭花放置在微波爐內(nèi)，在700 W（中火）下分別加熱0、1、2、4、6、8 min，處理完成后室溫下冷卻，液氮速凍，置于低溫冰箱（－70 ℃）待用。

1.3.2 GRA提取及檢測

1.3.2.1 GRA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

20 mg純度為99%的GRA標(biāo)準(zhǔn)品溶解于20 mL去離子水中，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，配制5、20、40、80、120、160、200 μg/mL梯度溶液，建立GRA標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Y＝5 975.6X－6 995.9（R2＝0.999），式中，X為GRA質(zhì)量濃度，Y為峰面積。

1.3.2.2 GRA的提取

參考葉珊珊[21]的方法并略作改進。取1.3.1節(jié)制備的樣品5 g，以料液比1∶4加入20 mL 80%（體積分數(shù)，下同）乙醇溶液，80 ℃下水浴20 min。過濾并收集濾液，將樣品研磨成糊狀，按料液比1∶12加入60 mL 80%乙醇溶液，80 ℃下水浴20 min，超聲處理15 min，過濾并收集濾液，重復(fù)兩次。合并濾液，55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀。用甲醇溶解并定容至10 mL。

1.3.2.3 HPLC法測定GRA含量

利用HPLC儀檢測GRA含量，采用Hypersil BDS C18柱（250 mmh 4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（體積比4∶96，含質(zhì)量分數(shù)0.1%四甲基溴化銨）；流速 0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長226 nm；進樣量20 μL。測得峰面積代入1.3.2.1節(jié)回歸方程計算GRA含量。

1.3.3 SFN的提取及檢測

1.3.3.1 SFN的提取

參考胡翠珍等[22]的方法。黃芥子粉碎，過篩。稱取5 g芥子粉按料液比1∶20加入蒸餾水100 mL，25 ℃超聲振蕩30 min后，抽濾除雜得粗MYR液，其中MYR活性為0.7 U/g（干質(zhì)量）。取1.3.1節(jié)制備的樣品5 g，以料液比1∶5加入25 mL MYR液（以相同體積蒸餾水作為對照），37 ℃水浴60 min后以料液比1∶20加入100 mL 95%乙醇溶液，超聲處理30 min，過濾。收集濾液，65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至液體完全蒸干，10 mL蒸餾水沖洗蒸餾瓶，以體積比1∶3加入30 mL乙酸乙酯，萃取兩次，合并乙酸乙酯相，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶液至膏狀，用甲醇溶解并定容至10 mL。

1.3.3.2 SFN標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

20 mg純度為99%的SFN標(biāo)準(zhǔn)品溶解于20 mL去離子水中，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，配制5、20、60、120、180、250 μg/mL梯度溶液，建立SFN標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Y＝3h 10－5X－0.510 4（R2＝0.999），式中，X為峰面積，Y為SFN質(zhì)量濃度。

1.3.3.3 HPLC法測定SFN含量

利用HPLC儀檢測SFN含量，采用WondaSil C18柱（150 mmh 4.6 mm，5 μm），有機相為甲醇，水相為超純水，二元高壓洗脫程序為：0.01 min 35%甲醇，12 min 35%甲醇，20 min 100%甲醇，25 min 35%甲醇；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長201 nm；進樣量20 μL。將測得峰面積代入1.3.3.2節(jié)回歸方程計算SFN含量。

1.3.4 西蘭花中MYR的提取與測定

1.3.4.1 材料處理方法

準(zhǔn)確稱取西蘭花2 g，稱取6 份，按1.3.1節(jié)步驟分別制備蒸、煮、炒和微波制樣品。所有處理均重復(fù)3 次。

1.3.4.2 MYR的提取及活性的測定

參考丁艷等[23]的方法提取MYR并測定活性，略作改進。取1.3.4.1節(jié)制備的樣品2 g，加入20 mL 10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（其中添加1 mmol/L EDTA、3 mmol/L二硫蘇糖醇、質(zhì)量分數(shù)5%甘油，pH 7.2），冰浴研磨，4 層紗布過濾除濾渣，濾液在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，加入固體硫酸銨使上清液飽和度達到55%，4 ℃放置30 min，12 000 r/min冷凍離心15 min，使MYR聚集，取沉淀溶于4 mL去離子水中，并用去離子水透析4 ℃過夜，透析袋取出后表面擦干，放入盛有質(zhì)量分數(shù)10%聚乙二醇溶液的燒杯內(nèi)，4 ℃放置0.5 h，得到MYR提取濃縮液。在試管中加入1.50 mL磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）、500 μL抗壞血酸溶液（1 mmol/L）、50 μL黑芥子硫苷酸鉀溶液（25.18 mmol/L）和20 μL MYR提取液，分別在37 ℃條件下保溫，混合平衡1 min。置于1 cm光路石英比色皿中，37 ℃反應(yīng)30 min，測定227 nm波長處吸光度，按公式（1）計算酶活力。在pH 6.5、37 ℃條件下，以每分鐘催化1 μmol黑芥子硫苷酸鉀所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。

式中：n為反應(yīng)時間內(nèi)MYR降解黑芥子硫苷酸鉀的物質(zhì)的量/μmol；t為反應(yīng)時間/min；VE為酶液體 積/mL；VEX為提取液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 細胞膜透性測定

細胞膜透性測定參考林毅雄等[24]的方法。取1.3.4節(jié)中冷凍前蒸、炒和微波處理的樣品2 g，置于25 mL試管內(nèi)，加入20 mL去離子水，讓樣品完全浸在水中，將試管放置在干燥器用內(nèi)真空泵抽真空30 min，電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率R1，然后將試管沸水浴加熱15 min，取出冷卻至室溫后測定電導(dǎo)率R2，相對電導(dǎo)率用公式（2）計算。

煮制樣品電導(dǎo)率的測定：取1.3.4節(jié)冷凍前的煮制樣品2 g，放置在加入20 mL去離子水的試管內(nèi)，封口膜封口后放入蒸鍋內(nèi)分別加熱0、1、2、4、6、8 min，取出試管室溫下冷卻，測定相對電導(dǎo)率。

以上處理均重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理并繪圖，用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并進行Duncan’s差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同烹飪方式下烹飪時間對西蘭花中GRA含量的影響

圖 1 不同烹飪方式下烹飪時間對西蘭花中GRA含量的影響Fig. 1 Effect of cooking time on GRA content in broccoli cooked by different methods

GRA是SFN的前體物質(zhì)，烹飪過程中GRA的損失會影響SFN的獲取量。4 種烹飪方式下，烹飪時間對西蘭花內(nèi)源GRA含量的影響如圖1所示。未處理的西蘭花GRA含量（168.14 μg/g）最高，隨著烹飪時間的延長西蘭花內(nèi)源GRA含量呈下降趨勢，各處理組差異明顯。由圖1可知，與0 min相比，2 min蒸制、煮制、炒制和微波處理使GRA含量分別減少了35.93、61.41、74.41 μg/g和70.69 μg/g；8 min時GRA含量分別減少了65.48%、65.92%、82.91%和71.85%。由此可見蒸制處理時GRA損失較少，炒制處理時GRA損失最大。這說明蒸制相對其他3 種烹飪方式較為溫和，烹飪材料內(nèi)保留了較多的GRA。

2.2 不同烹飪方式下烹飪時間以及添加外源MYR對西蘭花中SFN含量的影響

圖 2 不同烹飪方式下烹飪時間以及添加外源MYR對 西蘭花中SFN含量的影響Fig. 2 Effect of cooking time and exogenous myrosinase addition on SFN content in broccoli cooked by different methods

研究表明加熱可以提高SFN提取量[25-26]，但鮮見關(guān)于添加外源MYR效應(yīng)的報道。如圖2所示，4 種烹飪方式下，西蘭花SFN含量隨著烹飪時間的延長呈先升后降的趨勢，添加外源MYR使各處理組SFN含量均增加，且各處理組間差異明顯。鮮西蘭花中SFN含量為10.59 μg/g，蒸制和煮制處理時SFN含量在第4分鐘達到最大值，分別為25.07 μg/g和17.43 μg/g，分別比鮮西蘭花增加了14.48 μg/g和6.84 μg/g；添加外源MYR蒸制和煮制熱處理4 min時SFN含量分別為48.10 μg/g和 35.56 μg/g，分別比鮮西蘭花增加了23.03 μg/g和18.13 μg/g。 炒制和微波處理時SFN含量均在第2分鐘達到最大值，分別為16.69 μg/g和20.96 μg/g，分別比鮮西蘭花增加了6.10 μg/g和10.37 μg/g；添加外源MYR炒制和微波處理2 min時SFN含量分別為36.93 μg/g和40.70 μg/g，分別比鮮西蘭花增加了20.24 μg/g和19.74 μg/g。這說明短時間熱處理和添加外源酶可提高西蘭花中GRA-SFN轉(zhuǎn)化率，增加SFN獲取量。

2.3 不同烹飪方式下烹飪時間對西蘭花內(nèi)源MYR活力的影響

圖 3 不同烹飪方式下烹飪時間對西蘭花內(nèi)源MYR活力的影響Fig. 3 Effect of cooking time on MYR activity in broccoli cooked by different methods

4 種烹飪方式下，烹飪時間對西蘭花內(nèi)源MYR活力的影響如圖3所示。隨著烹飪時間的延長，西蘭花內(nèi)源MYR活力呈減弱的趨勢，各處理組差異明顯。鮮西蘭花內(nèi)源MYR活力為0.681 U/g，蒸、煮、炒和微波處理1 min時內(nèi)源MYR活力分別下降至0.325、0.314、0.276 U/g 和0.315 U/g；8 min時分別為0.112、0.108、0.103 U/g和0.105 U/g，各處理組差異較小。

2.4 不同烹飪方式下烹飪時間對西蘭花細胞膜透性的影響

圖 4 不同烹飪方式下烹飪時間對西蘭花細胞膜透性的影響Fig. 4 Effect of cooking time on cell membrane penetrability in broccoli cooked by different methods

烹飪加工過程中加熱或機械損傷會造成蔬菜細胞膜受損，從而引起GRA和SFN的流失，檢測相對電導(dǎo)率有助于了解細胞膜的受損程度。4 種烹飪方式下，烹飪時間對西蘭花細胞膜透性的影響如圖4所示。鮮西蘭花相對電導(dǎo)率為2%，經(jīng)過烹飪處理后細胞膜透性增大，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率增大，與0 min相比，蒸制、煮制、炒制和微波處理8 min時西蘭花相對電導(dǎo)率分別增加至20%、85%、74%和66%，蒸制、炒制和微波處理組在8 min內(nèi)差異顯著，煮制處理組2 min后差異不顯著。與蒸制相比，煮制、炒制和微波在8 min內(nèi)對細胞膜損傷較大。

3 討 論

加熱是生活中烹飪蔬菜的常用方式，例如蒸、煮、炒和微波處理都會對蔬菜中的硫苷含量及其水解產(chǎn)物的形成和生物利用度產(chǎn)生較大影響[27]。大量研究表明，在加熱處理時蔬菜中的硫苷含量會減少，烹飪時間越長硫苷損失越多，然而蒸制是一種較為溫和的烹飪方式，可以使蔬菜保留更多的硫苷[1]。Yuan Gaofeng等[28]研究結(jié)果表明炒制、微波和煮制3 種方式使西蘭花脂肪族硫苷含量分別顯著降低了55%、60%和41%，蒸制處理時幾乎沒有變化。Tabart等[17]研究結(jié)果表明蒸制15 min和煮制20 min時西蘭花中總硫苷含量保留較多，微波處理19 min時總硫苷含量幾乎沒有變化。本研究結(jié)果表明相同處理時間內(nèi)蒸制西蘭花可以保留更多的GRA，煮制、炒制和微波處理造成硫苷的損失量高于蒸制。Soares等[1]認為蒸制過程中西蘭花和水之間接觸面積較小，導(dǎo)致硫苷損失較少。本研究結(jié)果表明蒸制相對于其他3 種烹飪方式對細胞膜損傷較小，這或許也是蒸制處理下硫苷損失較少的部分原因。

MYR和表皮硫特異蛋白（epithiospecifier protein，ESP） 對GRA酶解產(chǎn)物類型和含量有較大的影響。正常情況下，西蘭花中GRA在MYR作用下生成SFN，ESP會抑制SFN的生成，使GRA向無抗癌活性的蘿卜硫腈方向水解[29]。Matusheski等[25]的研究表明西蘭花中ESP耐熱性較MYR差，加熱后易失活，西蘭花芽苗在60 ℃水浴10 min后ESP完全失活，SFN生成量顯著增加。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)汽蒸1～3 min可以生成較多的SFN和較少的蘿卜硫腈，推測原因是該條件既能使ESP失活，還能保持較高的MYR活力。Hanschen等[27]研究了在煮制蕓薹屬蔬菜過程中硫苷浸出和降解的動力學(xué)以及硫苷降解產(chǎn)物的形成，結(jié)果表明鮮苤藍、白菜和紫甘藍中ITC類物質(zhì)4-甲硫基丁基異硫氰酸鹽、2-丙烯基異硫氰酸鹽和3-丁烯基異硫氰酸鹽含量隨烹飪時間的延長呈先升后降的變化趨勢，MYR活力呈下降趨勢。本研究結(jié)果表明4 種烹飪方式下隨著烹飪時間的延長SFN含量呈先升后降的趨勢，MYR活力隨著烹飪時間的延長呈下降的趨勢。

人體能夠從十字花科蔬菜中攝取有益ITC化合物的含量取決于蔬菜中硫苷含量、MYR和ESP活性以及烹飪條件等因素。蔬菜在烹飪加熱過程中硫苷含量會隨著烹飪時間的延長下降，同時MYR和ESP活性也會隨著烹飪時間的延長降低。已有報道稱硫苷可以被人體腸道細菌中的MYR水解生成ITC，但是腸道中MYR的作用微弱，因此植物的內(nèi)源MYR活力對于硫苷的酶解至關(guān)重要[30]。李瑞敏[31]對十字花科芽苗的聯(lián)合水解進行研究，結(jié)果表明西蘭花芽苗與蘿卜屬蘿卜、芝麻菜屬芝麻菜芽苗和油菜芽苗進行聯(lián)合水解后，SFN的含量分別增加至2.03、2.32、1.95 倍。通過對芽苗聯(lián)合水解機制初步探測得知，將西蘭花芽苗與蕓薹屬以外的十字花科芽苗或與ESP活性較低的蕓薹屬芽苗聯(lián)合水解均能促進SFN的生成，使人體從十字花科植物芽苗中獲取更高含量的抗癌活性物質(zhì)。本研究結(jié)果表明通過添加外源MYR使各處理組SFN含量都得到了提高，這說明添加適宜的外源MYR可以補充加熱造成西蘭花中MYR的損失，提高西蘭花中 GRA-SFN轉(zhuǎn)化率，增加SFN獲取量。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在4 種家庭常用烹飪方式（蒸制、煮制、炒制和微波處理）下隨著烹飪時間的延長，‘瑞農(nóng)’西蘭花中GRA含量呈下降趨勢，SFN含量呈先升后降趨勢，MYR活力減弱。4 種烹飪方式中蒸制相對于其他3 種烹飪方式可保留更多的GRA，從而可以獲得更多的抗癌有益化合物SFN。因此，從健康角度建議人們在食用西蘭花時選擇蒸制的烹飪方法。