源自輕腌大黃魚的特定腐敗菌特性及腐敗能力

郭全友，單 珂,，姜朝軍，李保國(guó)

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

大黃魚（Pseudosciaena crocea）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類，其體色金黃、味道鮮美、蛋白豐富，深受消費(fèi)者喜愛[1]。鹽制大黃魚是以大黃魚為原料，經(jīng)剖片、清洗、鹽漬（調(diào)味）、干燥或不干燥和包裝等工藝制成，分為鹽漬（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于60%，鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于6%）、半干（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)40～60%，鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于6%）和干（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于40%，鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于11%）大黃魚，其中鹽漬和半干大黃魚符合輕腌加工的消費(fèi)要求[2]，避免了傳統(tǒng)腌制加工高鹽、色澤易氧化和口感不佳等問題，滿足人們對(duì)低鹽和健康飲食的需求，但由于其高水分和高蛋白等特點(diǎn)，在貯藏過程中易腐敗變質(zhì)，產(chǎn)品貨架期縮短，造成經(jīng)濟(jì)損失。

研究表明微生物活動(dòng)是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的最主要因素[3]，魚類剛死亡時(shí)魚體菌群復(fù)雜多樣，不同種類的細(xì)菌具有不同的耐受能力，在魚體內(nèi)在和外在因子的影響下，魚體中只有部分適合生存和繁殖的菌群參與腐敗過程，并產(chǎn)生腐敗臭味和異味代謝產(chǎn)物，最終成為該產(chǎn)品的特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）[4-5]。水產(chǎn)品種類、棲息環(huán)境、包裝及貯藏方式等差異導(dǎo)致SSO亦不相同，如假單胞菌是有氧冷藏淡水魚的SSO[6-7]，葡萄球菌屬是高鹽加工水產(chǎn)品的SSO[8]。輕腌大黃魚低溫（5 ℃）貯藏貨架期終點(diǎn)的SSO為普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌[9]，研究顯示兩者多源于土壤和水體，是冷藏及真空包裝水產(chǎn)品和肉制品的主要腐敗菌[10-11]，易導(dǎo)致肉制品腐敗及造成食物中毒，因此對(duì)于腐敗菌的監(jiān)控、保障產(chǎn)品質(zhì)量及減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

每種水產(chǎn)品SSO的腐敗范圍和腐敗能力不同，通常將菌株接回?zé)o菌魚塊或魚汁中，測(cè)定菌落總數(shù)、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、生物胺含量和腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子等作為其腐敗能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。許振偉等[12]以感官評(píng)價(jià)、TVB-N含量、三甲胺（trimethylamine，TMA）含量及腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU和YTMA/CFU等為指標(biāo)，定量分析冷藏大黃魚優(yōu)勢(shì)菌（腐敗希瓦氏菌和假單胞菌等）的腐敗能力，發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌的腐敗能力強(qiáng)于假單胞菌及其復(fù)合菌。Wang Hang等[13]把嗜水氣單胞菌、杜氏假單胞菌和腐敗希瓦氏菌等接種于魚塊中，測(cè)定4 ℃貯藏中的TVB-N含量、硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物值、生物胺和揮發(fā)性物質(zhì)含量等變化，分析比較草魚中這3 種腐敗菌的腐敗能力。

目前，研究者對(duì)輕腌大黃魚低溫和常溫貯藏下的貨架期及腐敗菌進(jìn)行了研究[9]，但鮮有針對(duì)該產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗能力進(jìn)行探究，因此本實(shí)驗(yàn)以輕腌大黃魚優(yōu)勢(shì)腐敗菌（普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌）為對(duì)象，分別將其接種到無(wú)菌魚塊中，分析低溫（5 ℃）貯藏中接種魚塊感官品質(zhì)、微生物和理化（pH值、TVB-N含量、生物胺含量和揮發(fā)性成分）特征等變化，評(píng)價(jià)和比較兩者的腐敗能力，為輕腌大黃魚的工藝優(yōu)化及靶向抑菌、延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

菌株分離自5 ℃貯藏貨架期終點(diǎn)的輕腌大黃魚，經(jīng)Sherlock MIS微生物鑒定系統(tǒng)鑒定后，采用16S rRNA測(cè)序確認(rèn)普通變形桿菌（Proteus vulgaris，序列號(hào)：KY684257）和蜂房哈弗尼菌（Hafnia alvei，序列號(hào)：KY684258）為優(yōu)勢(shì)菌，菌相比例分別為58.9%和35.9%[9]。

輕腌大黃魚（真空包裝）購(gòu)自寧德市蔡氏水產(chǎn)有限公司，其鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（2.00f 0.12）%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（60.79f 2.24）%，水分活度為0.96f 0.02，pH值為6.20f 0.04，冷藏運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，－18 ℃冷凍備用。

高氯酸、硼酸、氫氧化鈉、酚酞、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；M035-硫化氫細(xì)菌微量生化鑒定管 北京 陸橋技術(shù)股份有限公司；GEN III板、BUG培養(yǎng)基 美國(guó)BIOLOG公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZM-100全自動(dòng)不銹鋼反壓高溫蒸煮鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；MIR-153型高精密度低溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FB超凈臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KDN-103F自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；微生物半自動(dòng)鑒定儀 美國(guó)BIOLOG公司；Sherlock MIS微生物鑒定系統(tǒng) 美國(guó)MIDI公司；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、1200型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；漩渦混合器QT-2 上海琪特分析儀器有限公司；HI2216 pH計(jì) 哈納沃德儀器（北京）有限公司；DVB-PDMS 65 μm萃取頭 美國(guó)Supelco公司；GC-MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜（GC-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司；YO2G-03微波殺菌器 深圳市蘭博特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌特性測(cè)定

1.3.1.1 菌懸液制備

普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌保藏于－80 ℃冰箱中。用時(shí)將普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24 h，活化后在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面劃線，25 ℃培養(yǎng)24～48 h得到單菌落，挑取單菌落于10 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24～48 h，菌落數(shù)約108CFU/mL，備用。

1.3.1.2 生理生化特性分析

根據(jù)GEN III板操作說明進(jìn)行，兩株菌在BUG培養(yǎng)基上劃線25 ℃培養(yǎng)24 h，用棉簽挑取單一菌落，接種到IF-A接種液中，逐步調(diào)整菌懸液濃度，依據(jù)濁度儀使用說明，透光率為90%～98%即為合適的接種量，將調(diào)整好的菌懸液加至微孔板中，每孔100 μL，25 ℃恒溫培養(yǎng)，使用OmniLog讀數(shù)儀讀取數(shù)據(jù)，以顯色反應(yīng)的劇烈程度（陰/陽(yáng)性）表示菌株對(duì)該底物的耐受性和敏感程度。

GEN III微孔板中包含71 種碳源，參照鄭華等[14]的方法將其分為6 類，分別為糖類（25 種）、羧酸類（17 種）、氨基酸類（10 種）、胺/酰胺類（6 種）、脂肪酸/脂類（6 種）和其他類（7 種）；微孔板包含pH值（為5和6）和NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、4%和8%）耐受性測(cè)試孔。另外進(jìn)行pH 7耐受性測(cè)試，配制pH 7的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別接種兩種菌，25 ℃培養(yǎng)24～48 h，菌液混濁即為陽(yáng)性。

硫化氫測(cè)試：使用細(xì)菌微量生化鑒定管，根據(jù)說明書挑取單菌落接種于安瓿瓶中，置于25 ℃培養(yǎng)24 h，瓶?jī)?nèi)出現(xiàn)黑色沉淀，說明菌株能夠產(chǎn)生硫化氫。

1.3.1.3 磷脂脂肪酸組成分析

采用Sherlock MIS微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞磷脂脂肪酸分析，依據(jù)使用手冊(cè)，將兩種菌分別進(jìn)行破壁、皂化、脂肪酸甲基化、萃取和堿洗等步驟，獲取細(xì)菌磷脂脂肪酸萃取液，置于GC儀進(jìn)行測(cè)定。色譜條件如下：氣路設(shè)置H2流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min， N2流速25 mL/min；19091B-102毛細(xì)管柱（25 mh 200 μm，0.33 μm），柱溫250 ℃，流量4 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，分流比1 0∶1；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)儀，溫度 為250 ℃。

1.3.2 兩種菌的腐敗能力測(cè)定

1.3.2.1 無(wú)菌魚塊制備及魚塊接種

無(wú)菌魚塊制備：參照許振偉等[15]的方法并做一定的修改，即取冷凍輕腌大黃魚，平放于覆有保鮮膜的無(wú)菌不銹鋼臺(tái)面上，用剪刀從魚鰓處切開，剝?nèi)ヴ~皮，取背脊處魚肉，修整魚塊至大小形狀一致，每塊25～30 g，放入無(wú)菌包裝袋中，置于微波殺菌器中殺菌即至無(wú)菌狀態(tài)。

魚塊接種：取菌懸液，稀釋至106～107CFU/mL，將無(wú)菌魚塊浸入菌液中20 s，魚塊菌數(shù)達(dá)到約104CFU/mL， 即為初始接種量，未接種的無(wú)菌魚塊作為空白對(duì)照。分別放入無(wú)菌袋中封口，低溫（5 ℃）貯藏，每隔2 d，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、菌落總數(shù)、pH值和TVB-N含量等測(cè)定；取初始點(diǎn)（0 d）、中間點(diǎn)和腐敗終點(diǎn)，測(cè)定魚塊生物胺種類和含量；另取初始點(diǎn)和近腐敗終點(diǎn)魚塊測(cè)定揮發(fā)性成分。

1.3.2.2 感官評(píng)價(jià)

挑選5 名專業(yè)人員，組成感官評(píng)價(jià)小組，以新鮮輕腌大黃魚產(chǎn)品為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合輕腌大黃魚的外觀、質(zhì)構(gòu)、氣味和滋味等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采取5 分制，1 分為最高分，5 分為感官拒絕點(diǎn)，即腐敗終點(diǎn)，取平均值。表1為感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

表 1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.2.3 菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)建模與評(píng)價(jià)

參照GB 4789.2ü 2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定菌落總數(shù)，取接種魚塊10 g到無(wú)菌研缽中，加90 mL無(wú)菌生理鹽水，充分研勻，10 倍梯度稀釋，選擇合適梯度，涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋度涂2 塊平板，25 ℃培養(yǎng)24～48 h后計(jì)數(shù)。模型建立采用修正的Gompertz方程擬合菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線[16]，具體見式（1）。

式中：t表示貯藏時(shí)間/h；Nt表示t時(shí)刻對(duì)應(yīng)的菌 數(shù)/（CFU/g）；N0表示初始菌數(shù)/（CFU/g）；Nmax表示最大菌落數(shù)/（CFU/g）；μmax表示最大比生長(zhǎng)速率/h－1；Lag表示延滯期/h。

模型評(píng)價(jià)采用決定系數(shù)R2、準(zhǔn)確度Af、偏差度Bf和均方根誤差（root mean squared error，RMSE）等對(duì)模型擬合優(yōu)度進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中R2、Af和Bf越接近于1，RMSE越接近于0，表明預(yù)測(cè)效果越好，評(píng)價(jià)方程見公 式（2）～（4）。其中Xcal為菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值，Xobs為菌落總數(shù)實(shí)測(cè)值，n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

1.3.2.4 魚塊pH值測(cè)定

取10 g魚肉于研缽中，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水，充分研磨均勻，使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)兩次，取平均值。

1.3.2.5 魚塊TVB-N含量和腐敗能力定量分析

TVB-N含量的測(cè)定參照GB 5009.228ü 2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》進(jìn)行。

《形形色色的植物》這一篇課文，學(xué)生們只是通過課文的介紹，知道植物世界是一個(gè)龐大的、復(fù)雜的世界。但是只是通過簡(jiǎn)單的文字介紹還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，可以通過讓學(xué)生親自去植物園中去觀察各種各樣的植物，讓學(xué)生切實(shí)的感受到植物世界的紛繁。讓學(xué)生通過觀察，去感受這個(gè)世界，進(jìn)而進(jìn)一步的理解課文上所講解的內(nèi)容。

腐敗能力以腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU作為腐敗能力定量指標(biāo)，具體見式（5），每組平行測(cè)定2 次，取平均值。

1.3.2.6 生物胺含量測(cè)定

生物胺含量參考GB 5009.208ü 2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》高效液相色譜法進(jìn)行，測(cè)定接種兩株菌株的魚塊和空白對(duì)照魚塊的生物胺組成及含量，每組平行兩次，取平均值。

1.3.2.7 揮發(fā)性成分測(cè)定

取初始和近腐敗終點(diǎn)的接種魚塊，空白魚塊作為對(duì)照，按料液比1∶3（m/V）加入飽和食鹽水，冰水浴勻漿，倒入樣品瓶中，在萃取溫度60 ℃下平衡20 min，將65 μm DVB/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部位，萃取溫度60 ℃，平衡10 min，頂空萃取40 min后取出萃取頭，迅速用GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析。

G C 條 件： 色 譜 柱： D B - 5 M S 毛 細(xì) 管 柱（30 mh 0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：毛細(xì)管柱初溫40 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升高到200 ℃保持3 min，再以10 ℃/min上升到250 ℃保持3 min；載氣：氦氣，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；采用恒線速率，分流比1∶20；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍50～400m/z；溶劑切除時(shí)間2 min；傳輸線溫度270 ℃。

定性和定量：與NIST Library（10.7萬(wàn) 種化合物）和Wiley Library（32萬(wàn) 種化合物，Version 6.0）進(jìn)行匹配，取匹配度85%以上物質(zhì)，結(jié)合保留時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行定性，按峰面積歸一化法，計(jì)算化合物相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株表型、生理生化與碳源利用特征

表 2 普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌生理生化和碳源利用特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics and carbon source utilization profiles of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌為革蘭氏陰性、短桿菌、兼性厭氧，均屬腸桿菌科，多存在于人和動(dòng)物的腸道、水和土壤中，皆為條件致病菌，可造成食物中 毒[17-18]。菌株生理生化和碳源利用特征見表2。普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌分別在pH 5、6、7時(shí)均能生長(zhǎng)，表明兩株菌對(duì)低酸性環(huán)境具有一定耐受性；NaCl耐受性結(jié)果表明在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和4%時(shí)兩株菌生長(zhǎng)良好，8%時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，而輕腌大黃魚鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于6%，說明兩株菌在輕腌大黃魚中均能正常生長(zhǎng)。普通變形桿菌產(chǎn)硫化氫，蜂房哈弗尼菌不產(chǎn)硫化氫，硫化氫是細(xì)菌分解含硫氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸后產(chǎn)生的，會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)品產(chǎn)生令人難以接受的腐敗氣味。

碳源是微生物生長(zhǎng)的主要能源，魚類腐敗初期碳水化合物被腐敗微生物氧化成CO2和H2O，當(dāng)簡(jiǎn)單的和可利用的碳水化合物被消耗完后，才會(huì)發(fā)生腐敗[19]，腐敗產(chǎn)物和代謝速率與菌種、環(huán)境（如鹽分、溫度）和能源等差異性有關(guān)。由表2可知，普通變形桿菌能利用糖類7 種、氨基酸4 種、羧酸類3 種以及酯類1 種；蜂房哈弗尼菌能夠利用糖類7 種、氨基酸類4 種、羧酸類5 種以及酯類1 種。兩株菌利用的碳源物質(zhì)種類較為相似，具體物質(zhì)略有差異。微生物對(duì)碳源的利用與其代謝能力相關(guān)，研究顯示，添加0.5%的NaCl能夠提高普通變形桿菌對(duì)葡萄糖的利用程度[20]；微生物能夠代謝氨基酸，在食品中會(huì)生成氨和含硫物質(zhì)等，如谷氨酸的氧化/還原可以產(chǎn)生乙酸、丁酸、二氧化碳、氨和氫，導(dǎo)致食物產(chǎn)生令人討厭的腐臭氣味[19]。

2.2 細(xì)菌磷脂脂肪酸組成特征

表 3 普通變形桿菌與蜂房哈弗尼菌磷脂脂肪酸組成Table 3 PLFA compositions of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

磷脂脂肪酸是生物體的基本構(gòu)成成分之一，在細(xì)胞中絕大部分脂肪酸以結(jié)合形式存在，構(gòu)成生物膜的重要成分，與細(xì)胞識(shí)別和種族特異性密切相關(guān)，具有結(jié)構(gòu)多樣性和高生物學(xué)特異性[21]，例如郭全友等[22]對(duì)大黃魚腐敗菌進(jìn)行磷脂脂肪酸分析，將16∶0、16∶1ω6c和16∶1ω7c作為大黃魚腐敗細(xì)菌的生物標(biāo)記物。由表3可知，普通變形桿菌含有21 種磷脂脂肪酸成分，主要包括16∶0（29.78%）、Sum In Feature 3（28.96%）、Sum In Feature 8（10.74%）、Sum In Feature 2（8.93%）、17∶0 cyclo（8.90%）、14∶0（6.48%）和12∶0（3.45%）。蜂房哈弗尼菌含有18 種磷脂脂肪酸成分，主要包括Sum In Feature 3（30.19%）、16∶0（29.52%）、Sum In Feature 8（13.58%）、Sum In Feature 2（8.08%）、14∶0（5.64%）、17∶0cyclo（5.62%）、12∶0（3.15%）?？梢姡瑑芍昃膬?yōu)勢(shì)磷脂脂肪酸成分較為相似，均為16:0和Sum In Feature 3。

2.3 腐敗能力分析結(jié)果

2.3.1 冷藏過程中接種魚塊感官評(píng)分變化

圖 1 冷藏過程中接種魚塊感官評(píng)分變化Fig. 1 Sensory quality changes of fish pieces isolated with different bacteria during storage

由圖1可知，初始貯藏時(shí)，接種魚塊具有輕腌大黃魚的咸香和清香、質(zhì)地緊實(shí)、富有彈性；冷藏2 d內(nèi)，感官良好，之后隨著菌數(shù)總數(shù)增加和代謝加快，蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)降解，魚肉產(chǎn)生腐敗異味，魚肉表面出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)、肉質(zhì)松散、色澤暗淡發(fā)灰、有汁液流出，感官品質(zhì)急劇下降。接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊分別在貯藏的第12天和14天，感官評(píng)分達(dá)到5 分，分別達(dá)到貯藏終點(diǎn)，此時(shí)魚塊肉質(zhì)松軟、具有強(qiáng)烈異臭和腐敗氣味，表明普通變形桿菌腐敗速率快于蜂房哈弗尼菌。

2.3.2 菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)比較結(jié)果

圖 2 冷藏過程中接種魚塊菌落總數(shù)生長(zhǎng)曲線Fig. 2 Change in total bacterial count of fish fillets inoculated with different bacteria during storage

表 4 魚塊冷藏過程中細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及模型評(píng)價(jià)Table 4 Kinetic parameters and model evaluation of spoilage bacterial growth during storage

圖2和表4分別為5 ℃貯藏過程中接種魚塊菌落總數(shù)生長(zhǎng)曲線和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌生長(zhǎng)曲線整體呈典型“S”形持續(xù)上升趨勢(shì)，模型評(píng)價(jià)中R2均大于0.975，Af在1.000～1.060之間，Bf皆在1.000～1.080之間，RMSE在0.000～0.100之間，表明模型擬合度良好。

普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的延滯期分別為（1.11f 0.01）d和（1.36f 0.01）d，表明1～2 d內(nèi)菌株生長(zhǎng)緩慢，μmax分別為（0.52f 0.00）d－1和（0.42f 0.00）d－1， 表明普通變形桿菌生長(zhǎng)快于蜂房哈弗尼菌。至穩(wěn)定期時(shí)，普通變形桿菌Nmax為（8.90f 0.73）（lg（CFU/g））， 蜂房哈弗尼菌Nmax為（8.70f 0.92）（lg（CFU/g）），兩者差異不明顯。輕腌大黃魚貨架期終點(diǎn)分離出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌中，普通變形桿菌（58.9%）比例要高于蜂房哈弗尼菌（35.9%）[9]，同時(shí)生長(zhǎng)速率亦大于蜂房哈弗尼菌，可能是由于兩株菌共存時(shí)，兩者間會(huì)存在相互作用，但對(duì)兩者之間具體的拮抗或促進(jìn)作用仍需深入研究。

2.3.3 冷藏過程中接種魚塊pH值變化

圖 3 冷藏過程中接種魚塊pH值變化Fig. 3 Change in pH of fish pieces inoculated with different bacteria during storage

由圖3可知，接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊在貯藏過程中pH值呈先升后降趨勢(shì)，魚塊初始pH值為6.35f 0.03，接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊pH值在第4天達(dá)到最高，分別為6.41f 0.01和6.46f 0.04，這可能是由于腐敗菌生長(zhǎng)引起了蛋白質(zhì)的分解以及堿性物質(zhì)的生成[23]，隨后逐漸下降，腐敗終點(diǎn)時(shí)，pH值分別為5.89f 0.05和5.82f 0.03，可能是隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，兩種菌數(shù)量急劇上升，且由前面兩種菌對(duì)糖類碳源的利用結(jié)果可知，普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌都能利用葡萄糖和甘露糖等發(fā)酵產(chǎn)酸，從而引起pH值下降，與其他關(guān)于腌制水產(chǎn)品貯藏過程中觀察到的趨勢(shì)[24-25]相一致。

2.3.4 冷藏過程中接種魚塊TVB-N含量和產(chǎn)量因子

圖 4 冷藏過程中接種魚塊TVB-N含量變化Fig. 4 Change in TVB-N content of fish pieces inoculated with different bacteria during storage

TVB-N的產(chǎn)生是由于蛋白質(zhì)的腐敗降解形成鹽基氮積聚在制品中，是魚體腐敗變質(zhì)的重要特征產(chǎn)物，其含量變化與水產(chǎn)品腐敗程度明顯相關(guān)[26]。通常TVB-N含量達(dá)到30.00 mg/100 g時(shí)即為水產(chǎn)品貨架期終點(diǎn)。 由圖4可知，冷藏過程中，未接種魚塊的TVB-N含量幾乎未發(fā)生變化，維持在5.50～10.30 mg/100 g之間。接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊初始TVB-N含量分別為（7.70f 0.65）mg/100 g和（10.50f 0.78）mg/100 g， 冷藏前2 d 變化不大，之后隨著菌落總數(shù)的增加，T V B-N 含量迅速增加，在腐敗終點(diǎn)分別達(dá)到 （30.38f 0.89）mg/100 g（12 d）和（30.52f 0.93）mg/100 g （14 d），接種普通變形桿菌的魚塊TVB-N含量增長(zhǎng)快于蜂房哈弗尼菌，可能由于蜂房哈弗尼菌在數(shù)量較多時(shí)才開始產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物[27]。

水產(chǎn)品TVB-N含量與菌落總數(shù)、感官評(píng)分有良好的相關(guān)性[28]，能很好地反映其腐敗程度，常用產(chǎn)量因子YTVB-N/CFU作為腐敗菌致腐能力評(píng)價(jià)指標(biāo)。貯藏終點(diǎn)時(shí)，普通變形桿菌組的YTVB-N/CFU為3.61h 10－8mg/CFU，蜂房哈弗尼菌組的YTVB-N/CFU為3.71h 10－8mg/CFU，兩者差異不大。李學(xué)英等[29]將腐敗希瓦氏菌和假單胞菌接種于無(wú)菌大黃魚魚塊中，在5 ℃貯藏終點(diǎn)時(shí)，接種這兩株菌的魚塊YTVB-N/CFU分別為1.38h 10－10mg/CFU和 1.18h 10－10mg/CFU，確定腐敗希瓦氏菌為大黃魚低溫貯藏中的SSO，由此可知本實(shí)驗(yàn)中兩株菌的腐敗能力相同，均為輕腌大黃魚的SSO。

2.3.5 冷藏過程中接種魚塊生物胺含量變化

水產(chǎn)品中腐敗微生物能夠使游離氨基酸發(fā)生脫羧作用，產(chǎn)生大量具有生物活性的生物胺，因此生物胺含量與水產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)[30]。腐胺和尸胺是腌制水產(chǎn)品中的常見生物胺，也是腐敗魚肉的優(yōu)勢(shì)生物胺[31]，其含量常作為確定魚類安全性和質(zhì)量的指標(biāo)[32]。雖然與組胺相比，腐胺和尸胺沒有明顯的毒副作用，但是它們能夠與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌物亞硝基胺[33]，且當(dāng)其與組胺同時(shí)存在時(shí)能夠增強(qiáng)組胺的毒性[34]，因此對(duì)水產(chǎn)品腐胺、尸胺和組胺等生物胺的監(jiān)控非常重要。

圖 5 冷藏過程中接種魚塊腐胺（A）和尸胺（B）含量變化Fig. 5 Changes in putrescine (A) and cadaverine (B) contents in fish pieces during storage

由圖5可知，初始、冷藏過程和終點(diǎn)均檢出腐胺和尸胺。由圖5A可知，接種普通變形桿菌的魚塊，第7天腐胺含量增長(zhǎng)到（8.47f 1.33）mg/kg，與第14天含量差異不明顯；而接種蜂房哈弗尼菌的魚塊，呈先升后降趨勢(shì)，第7天增至（14.70f 4.95）mg/kg，第14天時(shí)僅為（5.08f 0.53）mg/kg。由圖5B可知，接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌魚塊，尸胺含量均呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)，第14天時(shí)，前者約后者的1.28 倍。第14天時(shí)，接種普通變形桿菌的魚塊腐胺和尸胺含量均高于接種蜂房哈弗尼菌魚塊，其中腐胺含量與空白對(duì)照組相比略有上升，但尸胺含量則分別升至（31.00f 5.94）mg/kg和（24.3f 1.71）mg/kg，說明尸胺為主要生物胺成分，對(duì)輕腌大黃魚的腐敗貢獻(xiàn)更大。馮杰等[35]研究得出腐胺和尸胺為4 ℃和25 ℃貯藏大黃魚的主要生物胺成分，其他生物胺含量在貯藏中變化不大，與本研究結(jié)果相似，同時(shí)有研究顯示這兩株菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)尸胺能力[36]。

2.3.6 冷藏過程中接種魚塊揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果

揮發(fā)性物質(zhì)多由醇、醛、酮類等揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成，能影響魚肉的氣味，其含量是影響消費(fèi)者評(píng)價(jià)食品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。接種不同菌株的魚塊在初始和近腐敗終點(diǎn)（第14天）的揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量和種類見表5。 共檢出18 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類（7 種）、醛類（6 種）、酮類（1 種）、酯類（1 種）、其他（烷烴和烯烴等，共3 種），其中醇類物質(zhì)是主要的揮發(fā)性成分。魚肉在內(nèi)源酶、脂肪氧化以及微生物的作用下產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，受產(chǎn)品類型、自身性質(zhì)和外界條件等影響產(chǎn)生自身特征性揮發(fā)性物質(zhì)[37]。初始時(shí)，空白對(duì)照組魚塊中相對(duì)含量最高的是醇類（63.03%），其次是醛類、烷烴和酮類，而翁麗萍[38]對(duì)養(yǎng)殖和野生大黃魚的風(fēng)味物質(zhì)比較分析中得出風(fēng)味物質(zhì)均以醛類為主，此差異可能是原料、腌制、加工和貯藏條件等差異造成的。腐敗終點(diǎn)與初試的空白魚塊相比，接種了普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊的醇類物質(zhì)相對(duì)含量增加，分別為78.84%和81.34%，醛類物質(zhì)與空白對(duì)照組相比有所下降，接種兩種菌的魚塊揮發(fā)性物質(zhì)成分比例差異不明顯，說明兩者代謝產(chǎn)物代謝能力相似。

表 5 冷藏過程中接種不同菌株魚塊揮發(fā)性物質(zhì)及其相對(duì)含量Table 5 Changes in types and contents of volatile compounds in fish pieces inoculated with different bacteria during storage

由表5可知，腐敗終點(diǎn)時(shí)，兩組魚塊醇類物質(zhì)種類與對(duì)照組相同，接種兩株菌的魚塊之間醇類物質(zhì)相對(duì)含量差異不大。3-甲基-1-丁醇是重要的醇類物質(zhì)，其在接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊中的相對(duì)含量分別為30.33%和19.84%，主要源于亮氨酸和異亮氨酸的氧化分解，具有堅(jiān)果的氣味；1-戊烯-3-醇是鹽腌魚有效的風(fēng)味物質(zhì)，與魚腥味的產(chǎn)生有關(guān)[39]；1-辛烯-3-醇來自不飽和脂肪酸氧化，是淡水魚和海水魚中普遍存在的揮發(fā)性氣味成分[40]。醇類物質(zhì)多來源于脂肪氧化分解及醛類物質(zhì)的還原，其閾值較高，對(duì)食品風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。醛類物質(zhì)的閾值較低，且能夠與其他許多物質(zhì)產(chǎn)生重疊風(fēng)味效應(yīng)，對(duì)食品的風(fēng)味影響較大[41]。到腐敗終點(diǎn)時(shí)，接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊，均能檢測(cè)到己醛、壬醛、庚醛、3-甲基丁醛和(E)-2-己烯醛，己醛已被證明是魚腥味的主要物質(zhì)[42]，壬醛則具有較強(qiáng)的類似柑橘或油脂的氣味，庚醛具有魚腥味、脂肪味和刺激性氣味，接種兩種菌魚塊的醛類物質(zhì)相對(duì)含量基本相同。

腐敗期終點(diǎn)還檢測(cè)到酮類、酯類和烷烴類，酮類由多不飽和脂肪酸的熱降解、氨基酸降解或微生物氧化產(chǎn)生[41]，可與醛類物質(zhì)相互作用，增強(qiáng)魚肉的腥味[43]。酯類化合物一般由酸和醇酯化作用縮合而成，是肉類香味的重要來源。烴類物質(zhì)來源于脂肪酸烷氧自由基的自氧化，閾值較高，對(duì)魚肉氣味貢獻(xiàn)較小。

3 結(jié) 論

以源自冷藏輕腌大黃魚的普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌為對(duì)象，分析兩種菌的表型、生理生化、碳源代謝和細(xì)胞磷脂脂肪酸等特征，并將兩種菌分別接回到無(wú)菌魚塊中，測(cè)定接種魚塊冷藏（5 ℃）過程中感官、微生物和理化（pH值、TVB-N含量、生物胺含量和揮發(fā)性成分）等指標(biāo)，評(píng)價(jià)和比較兩種菌的腐敗能力。兩種菌在低鹽（NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高于4%）和pH 5～7條件下均能生長(zhǎng)。

接種普通變形桿菌和蜂房哈弗尼菌的魚塊在冷藏過程中分別在第12、14天到達(dá)腐敗終點(diǎn)，此時(shí)TVB-N含量均超過30 mg/100 g；YTVB-N/CFU分別為3.61h 10－8、3.71h 10－8mg/CFU；接種魚塊中共檢測(cè)到尸胺和腐胺兩種生物胺，其中尸胺是導(dǎo)致腐敗的主要生物胺成分；貯藏初期初始魚塊揮發(fā)性物質(zhì)主要成分為醇類，腐敗終點(diǎn)時(shí)接種兩種菌的魚塊揮發(fā)性成分主要為醇類和醛類，且其相對(duì)含量無(wú)明顯差異。