表皮生長因子受體19、21 外顯子突變豐度與NSCLC 患者臨床特征及吉非替尼療效的關(guān)系

李蘇霞 蔣亦燕 陳細(xì)秀 王鵬飛 楊曉蕾

靶向治療是目前非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的重要治療方法，其中吉非替尼是臨床應(yīng)用最廣的NSCLC 靶向治療藥物[1]。吉非替尼是表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor -tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），能夠競爭性地與表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶結(jié)合，通過抑制其活性而阻斷EGFR 下游信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮抑制腫瘤惡性增殖、轉(zhuǎn)移等作用[2]。多項(xiàng)臨床研究已證實(shí)，EGFR 基因突變狀態(tài)是EGFR-TKI 療效的重要預(yù)測指標(biāo)[3-4]。近年臨床發(fā)現(xiàn)，同為攜帶EGFR 基因敏感突變的NSCLC 患者，EGFR-TKI 治療的中位無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）差異明顯[5]。這可能與EGFR 基因突變豐度有關(guān)。本研究檢測NSCLC 患者EGFR19、21外顯子突變類型及突變豐度，探討EGFR19、21 外顯子突變豐度與NSCLC 患者臨床病理特征及吉非替尼療效的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2013 年10 月—2016 年11 月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的NSCLC 患者94例，其中男53 例，女41 例，年齡（60.58±10.16）歲；吸煙史42 例（44.68%）；病理類型：腺癌75 例，非腺癌19 例；臨床分期：Ⅱ期24 例，Ⅲ期56 例，Ⅳ期14 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為NSCLC 且符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期[6]；（2）臨床病理資料完整；（3）病理組織EGFR 突變?yōu)殛栃?；?）進(jìn)行吉非替尼治療；（5）患者均對本研究知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非EGFR 突變；（2）合并其他可能危及患者生命安全的嚴(yán)重疾??；（3）合并控制性差的嚴(yán)重糖尿病、心血管疾病、高血壓等；（4）無法進(jìn)行生存隨訪；（5）合并其他器官惡性腫瘤。

2 方 法

2.1 EGFR19 和21 外顯子突變檢測 收集NSCLC患者血液，使用DP318-02 血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號20130921）提取血液DNA，測定A260nm/280nm 吸光度。參照GenBank 數(shù)據(jù)庫中人EGFR 基因序列，設(shè)計(jì)EGFR19、21 外顯子檢測引物：EGFR19 正向5'-GTGCATCGCTGGTAACATCC-3'，反向5'-TGTGGAGATGAGCAGGGTCT-3'；EGFR21 正 向5'-GCTCAGAGCCTGGCATGAAC-3'，反向5'-CATCCTCCCCTGCATGTGTT-3'。引物合成由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用PCR 擴(kuò)增目的片段，程序：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，40 個(gè)循環(huán)；72℃，10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20130826）回收純化DNA 產(chǎn)物。將回收純化的DNA 產(chǎn)物送至華大基因，使用IIIumina 高通量測序平臺直接測序，結(jié)果于GenBank 數(shù)據(jù)庫中人EGFR 基因序列比對，檢測EGFR19、21 外顯子突變情況。同時(shí)采用ARMS 法定性定量檢測EGFR19、21外顯子突變。將直接測序法和ARMS 法同時(shí)檢測為EGFR 突變，且突變類型一致的病例，定義為高豐度組；直接測序法未檢出EGFR 突變但ARMS 法檢測出突變的患者，定義為低豐度組。

2.2 治療方法及療效評價(jià) 采用吉非替尼片（AstraZeneca UK Limited，規(guī)格：0.25g/片，批 號20130911）口服進(jìn)行靶向治療，每天1 片。治療4 周后，行胸部CT、外周血腫瘤標(biāo)志物等檢查。

2.3 療效標(biāo)準(zhǔn) 參照實(shí)體瘤療效評估標(biāo)準(zhǔn)（version 1.1）評估治療效果[7]，完全緩解（complete response，CR）：所有靶病灶消失，無新病灶出現(xiàn)，且腫瘤標(biāo)志物正常，至少維持4 周；部分緩解（partial response，PR）：靶病灶最大徑之和減少≥30%，至少維持4 周；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）：靶病灶最大徑之和縮小未達(dá)PR，或增大未達(dá)PD；疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）：靶病灶最大徑之和至少增加≥20%，或出現(xiàn)新病灶。疾病控制率=（CR+PR+SD）/總例數(shù)×100%。

2.4 生存隨訪 對患者生存期進(jìn)行隨訪，截止時(shí)間2018 年12 月31 日。PFS 為第1 次使用吉非替尼片治療開始至病情發(fā)生進(jìn)展或死亡的總時(shí)間，總生存率（overall survival，OS）為截止隨訪時(shí)間患者病情未進(jìn)展或死亡的例數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)兩組間差異性，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)組間差異性，繪制高豐度組和低豐度組Kaplan-Meier 生存曲線，采用Log Rank 法檢驗(yàn)兩組生存率差異，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 EGFR19、21 外顯子突變情況 94 例患者經(jīng)直接測序法或ARMS 法檢測結(jié)果，EGFR19 外顯子片段性缺失突變59 例（62.77%），EGFR21 外顯子L858R 點(diǎn)突變35 例（37.23%），EGFR19 外顯子片段性缺失+EGFR21 外顯子L858R 點(diǎn)雙突變2 例（2.13%）。其中被2 種方法同時(shí)檢測到突變且突變類型一致的48 例，為高豐度組；直接測序法未檢出突變而ARMS 法檢測為突變的46 例，為低豐度組。

3.2 EGFR19、21 外顯子突變豐度與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系 EGFR19、21 外顯子突變豐度在性別、年齡、吸煙史、TNM 分期等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腺癌患者EGFR19、21 外顯子突變高豐度比例高于非腺癌患者（P＜0.05），組織中高分化患者EGFR19、21 外顯子突變高豐度比例高于低分化患者（P＜0.05）；EGFR19、21 外顯子突變豐度在病理類型、組織分化程度等方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3.3 EGFR19、21 外顯子突變豐度與吉非替尼療效的關(guān)系 EGFR19、21 外顯子突變高豐度組疾病控制率89.58%，低豐度組疾病控制率63.04%，兩組疾病控制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 EGFR19、21 外顯子突變豐度與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

表2 EGFR19、21 外顯子突變豐度與吉非替尼療效的關(guān)系[例（%）]

3.4 EGFR19、21 外顯子突變豐度與生存期的關(guān)系94 例患者截止至隨訪時(shí)間，死亡45 例，生存49 例，OS 為52.13%，PFS 為（14.06±3.57）個(gè)月。其中高豐度組OS 為64.58%（31/48），低豐度組OS 為39.13%（18/46），兩組OS 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.098，P=0.014）。高豐度組中位PFS 為（15.98±3.24）個(gè)月，低豐度組中位PFS 為（12.06±2.87）個(gè)月，兩組中位PFS 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.199，P=0.000）。見圖1。

4 討論

研究表明，EGFR 主要分布于細(xì)胞膜表面，為跨膜糖蛋白，包括胞內(nèi)酪氨酸激酶活化區(qū)、跨膜區(qū)和胞外配體結(jié)合區(qū)[8]。EGFR 基因是重要的腫瘤驅(qū)動基因之一，在促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程中發(fā)揮重要作用，是NSCLC 臨床靶向治療的重要靶點(diǎn)[9]。

圖1 高豐度組和低豐度組Kaplan-Meier 生存函數(shù)分析

吉非替尼靶向治療NSCLC 的療效取決于EGFR基因突變[10]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，同為攜帶EGFR 基因敏感突變的NSCLC 人群，一部分患者規(guī)范服用EGFR-TKI 類藥物6 個(gè)月左右便出現(xiàn)疾病進(jìn)展，而另一部分患者EGFR-TKI 治療的PFS 可長達(dá)1～2年[11]。針對這一問題，部分學(xué)者研究認(rèn)為與EGFR 突變類型有關(guān)，即EGFR19 外顯子片段化缺失突變的臨床療效優(yōu)于EGFR21 外顯子L858R 突變[12]。但相關(guān)研究的樣本量往往偏小，而在一些大型臨床實(shí)驗(yàn)中未能證實(shí)此論斷。有學(xué)者[13]提出EGFR 基因突變豐度存在個(gè)體差異可能是影響吉非替尼（EGFR-TKI）療效的重要原因，并證實(shí)EGFR 基因高突變豐度組患者EGFR-TKI 治療的PFS 明顯長于低突變豐度組患者。

研究表明，血漿EGFR 突變檢測可作為早期NSCLC 的生物標(biāo)志物[14]。本研究選擇94 例EGFR 基因突變患者血液為樣本，進(jìn)行直接測序法和ARMS法檢測EGFR 基因突變類型及突變豐度，結(jié)果EGFR19 外顯子片段性缺失突變率62.77%，EGFR21外顯子L858R 點(diǎn)突變率37.23%，EGFR19、21 外顯子雙突變率2.13%。48 例患者同時(shí)被直接測序和ARMS 法檢測到同一類型突變，表明EGFR 突變豐度相對較高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，EGFR 突變豐度在NSCLC 病理分型、組織分化程度之間存在差異，主要表現(xiàn)為腺癌、組織中高分化患者EGFR 突變豐度相對較高，與高寧等[15]、婁沖等[16]研究結(jié)果相似。

Wang 等[17]研究表明，EGFR 基因突變的豐度較高的NSCLC 患者PFS 較低突變豐度患者改善；Li等[18]研究表明，EGFR 基因突變豐度與EGFR-TKI 治療療效顯著相關(guān)，EGFR 基因突變低豐度可能對NSCLC 患者PFS 產(chǎn)生不利影響。本研究結(jié)果顯示，EGFR 基因突變高豐度組使用吉非替尼治療的疾病控制率89.58%，而低豐度組疾病控制率63.04%，高豐度組使用吉非替尼治療的疾病控制率顯著高于低豐度組。分析兩組患者PFS 和OS 發(fā)現(xiàn)，高豐度組患者PFS 較低豐度組明顯延長，OS 明顯高于低豐度組，說明EGFR 基因突變豐度與NSCLC 患者吉非替尼治療療效及預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，NSCLC 患者EGFR 基因突變豐度的高低與臨床病理分型、組織分化程度及吉非替尼治療療效有關(guān)，突變豐度高的患者吉非替尼治療療效相對較好，患者PFS 和OS 明顯延長。本研究不足之處在于應(yīng)用直接測序法和ARMS 法檢測EGFR 基因突變豐度存在一定局限性，而本研究重點(diǎn)在于驗(yàn)證EGFR 基因突變豐度與NSCLC 患者臨床病理特征及吉非替尼療效的關(guān)系，因此仍需進(jìn)一步探索新的定量檢測EGFR 基因突變豐度的方法。