TJ-5 抑制ubch5c 介導(dǎo)NEMO 泛素化調(diào)控NF-κB 通路對MHD 患者體內(nèi)微炎癥的影響

姚書東 吳 佳 羅文榮

維持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）是終末期腎衰竭（ESRD）患者主要的治療手段[1]。在腎衰竭患者中普遍存在炎癥狀態(tài)，血液透析患者的不良后果部分歸因于該人群中普遍存在的炎癥狀態(tài)，并且相互影響，造成患者病癥加重及死亡[2]。近年來，雖然血液透析技術(shù)不斷更新，但最佳治療方案尚不確定，且需要長期持續(xù)治療，給患者及其家庭帶來持續(xù)性的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。本研究探討倍半萜內(nèi)酯化合物TJ-5 對維持性血液透析患者微炎癥因子的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018 年2 月—2019 年2 月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院收治的選擇采用自體動靜脈內(nèi)瘺為血管通路的維持性血液透析患者60例，所選患者均無心臟病史，無明顯心衰表現(xiàn)，為首次行動靜脈內(nèi)瘺術(shù)。所有患者均給予常規(guī)降壓、糾正貧血等治療，透析液流量500mL/min，透析血流速200～300mL/min，鈣離子濃度1.5mmol/L，抗凝藥物為肝素鈉，使用低分子肝素抗凝，1 個月內(nèi)治療方案固定，未行常規(guī)血液透析以外的血液凈化治療，每周2～3 次，每次4～4.5h。另選擇我院體檢中心健康體檢者20 名作為健康對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）參照2006 年美國腎臟病基金會制定的腎臟病生存質(zhì)量指導(dǎo)指南（III.NKF-K/DOQI）[4]臨床明確診斷為終末期腎衰竭患者；（2）所有患者血清肌酐水平均＞707μmol/L，腎小球濾過率＜10%，符合尿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；（3）符合維持性血液透析診斷標(biāo)準(zhǔn)者且采用自體動靜脈內(nèi)瘺為血管通路；（4）接受常規(guī)血液透析治療，患者臨床情況穩(wěn)定，非透析時間血壓＞90/60mmHg（1mmHg=0.133kPa），透析齡＞3 個月；（5）無明顯肺部感染，血管通路感染。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（2）維持性血液透析采用帶隧道帶滌綸套導(dǎo)管（TCC）及人工移植血管為血管通路；（3）MHD 治療＜3 個月；（4）臨床資料不全，失訪；（5）伴隨有嚴(yán)重感染，嚴(yán)重心、肺、肝臟疾病，心力衰竭、厭食癥以及惡性腫瘤患者；（6）因其他各種原因療程未結(jié)束退出試驗或死亡的病例；（7）療程中更換血液透析方式或透析器類型。

1.4 標(biāo)本采集 透析結(jié)束后，清晨空腹留取受試者靜脈血，分別分離MHD 患者和健康志愿者外周血單一核細(xì)胞（PBMC），T 細(xì)胞分選試劑盒分離純化得到CD4+T 細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定。CD4+T 細(xì)胞使用不同濃度TJ-5 處理，將60 例MHD 患者血樣本分離純化得到的CD4+T 細(xì)胞分為空白組（0μM/mL TJ-5 處理）和高、低濃度組（10、5μM/mL TJ-5 處理），每組20 份，健康對照組20 份。

1.5 儀器及試劑 ELISA 試劑盒，批號kl-deim-05399，上?？吕咨锟萍加邢薰?；細(xì)胞培養(yǎng)箱，型號：BC-J80/160S，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；流式細(xì)胞儀，型號：CytoFLEX LX，美國貝克曼庫爾特；蛋白印跡儀，型號：PROFIBLOT 48，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；移液槍（移液器套裝）；RPMI-1640 培養(yǎng)基，批號507767，GIBCO 公司；胎牛血清，批號11011-8613，杭州億楓生物公司。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測MHD 患者外周血Th17/Treg比例 取清晨空腹留取受試者靜脈血，采用流式細(xì)胞儀檢測受試者外周血單核細(xì)胞Th17/Treg 比例，取受試者靜脈血分離單個核細(xì)胞，洗滌，離心后，分別加 入CD25-PE 抗 體、CD4-FITC 抗 體、CD127-PECY5 抗體及CD3-eFluor 660、CD8-FITC 抗體，避光、孵育、洗滌、離心，0.1%多聚甲醛固定液150μL 重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀射門檢測，分選分析CD4+、CD25+、CD127low Treg 和CD3+、CD8-、IL17+TH17細(xì)胞比例。流式細(xì)胞儀按操作說明檢測，數(shù)據(jù)使用FlowJo 軟件分析。

1.6.2 ELISA 法檢測MHD 患者外周血CD4+T 細(xì)胞經(jīng)TJ-5 處理后TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10 表達(dá)水平 按各研究分組，裂解外周血CD4+T 細(xì)胞，試劑盒平衡至室溫（20～25℃）后，具體操作按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行實驗，讀出OD450 值，計算外周血CD4+T 細(xì)胞腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及白介素-10（IL-10）水平。檢測3 次，取平均值計算結(jié)果。

1.6.3 Western Blot 法檢測MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞P65、I-κB 及磷酸化P65、磷酸化I-κB 蛋白含量 裂解細(xì)胞后，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，凝膠轉(zhuǎn)膜加一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)。按說明書進(jìn)行具體操作，測定外周血CD4+T 細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（P65）及磷酸化P65（p-P65）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，I-κB）及磷酸化I-κB（p-I-κB）蛋白含量，設(shè)置內(nèi)參β actin 蛋白，進(jìn)行分析。檢測3次，取平均值計算結(jié)果。

1.6.4 體外泛素化實驗檢測泛素連接酶（ubch5c）活性變化 參考文獻(xiàn)[4]的方法，裂解細(xì)胞后，取上清液，采用鎳柱親和純化獲得目的蛋白u(yù)bch5c，透析保存ubch5c，并檢測ubch5c 的純度，通過體外泛素化實驗檢測泛素連接酶ubch5c 活性變化情況。

1.6.5 免疫共沉淀法檢測NF-κB 必須調(diào)節(jié)蛋白（NEMO）線性泛素化 裂解CD4+T 細(xì)胞，離心等到蛋白后，加入anti-NEMO 抗體進(jìn)行免疫共沉淀，根據(jù)Western Blot 法，加一抗anti-linear polyuiquitin 抗體進(jìn)行免疫印跡，加anti-rabbit 熒光二抗后，用Odyssey檢測條帶，觀察NEMO 發(fā)生線性泛素化的情況[5]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 每個反應(yīng)體系一式三份作為平行重復(fù)。實驗結(jié)束后，采用2-ΔΔCT 法計算待測目的基因的相對表達(dá)量。應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 MHD 組60 例，男34 例，女26 例，年齡（52.50±7.61）歲，其中慢性腎小球腎炎33 例，高血壓腎損害12 例，糖尿病腎病9 例，梗阻性腎病4 例，多囊腎2 例；血液透析時間均＞3 個月。健康對照組20 名，男11 名，女9 名，年齡（51.2±4.9）歲，血常規(guī)白細(xì)胞計數(shù)4～12×109，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例正常，均有詳細(xì)病史，體格檢查、心電圖、胸部透視等檢查均無異常發(fā)現(xiàn)，無急慢性感染、高血壓、肝腎臟疾病、惡性腫瘤等疾病。兩組性別、年齡等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17/Treg 比例比較 與健康對照組比較，MHD 患者外周血Th17、Treg 水平增高，單核巨噬Th17/Treg 比例顯著上升（P均＜0.05）。見表1、圖1。

表1 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17/Treg比例比較（%，）

表1 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17/Treg比例比較（%，）

注：MHD 為維持性血液透析；Th17 為輔助性T 細(xì)胞17；Treg 為調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞；與健康對照組比較，aP＜0.05

圖1 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17 及Treg 比例

2.3 各組MHD 患者外周血TNF-α、Th17、IL-6、IL-10 及TFG-α 因子表達(dá) 與低濃度組比較，高濃度組TNF-α、IL-1β、IL-6 明顯下調(diào)（P 均<0.05），IL-10 明顯上調(diào)（P<0.05）；高、低濃度組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)量低于空白組，高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均<0.05）；IL-10 表達(dá)量高于空白組和健康對照組（P 均<0.05）。見表2。

表2 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD 4+T 細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)量比較（）

表2 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD 4+T 細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)量比較（）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白介素-1β；IL-6 為白介素-6；IL-10 為白介素-10；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

2.4 各組MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞p65 和I-κB 表達(dá)及其磷酸化 與低濃度組比較，高濃度組CD4+T 細(xì)胞p65 蛋白表達(dá)及p-p65 明顯下調(diào)（P<0.05），I-κB 蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05），p-I-κB明顯下調(diào)（P<0.05）；高、低濃度組p65 蛋白表達(dá)及pp65 低于空白組，高于健康對照組（P 均<0.05）；I-κB蛋白表達(dá)高于空白組，低于健康對照組（P 均<0.05），p-I-κB 低于空白組，高于健康對照組（P 均<0.05）。見表3、圖2。

表3 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞p65和I-κB 表達(dá)及其磷酸化比較（）

表3 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞p65和I-κB 表達(dá)及其磷酸化比較（）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；p65 為轉(zhuǎn)錄因子NF-kB 成員之一；p-p65 為磷酸化p65；I-κB 為核因子κB 的抑制蛋白；p-I-κB 為磷酸化核因子κB 抑制蛋白；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

圖2 MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞p65 和I-κB 表達(dá)及其磷酸化

2.5 各組MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞ubch5c 活性抑制率比較 TJ-5 高濃度組CD4+T細(xì)胞ubch5c 活性抑制率明顯高于低濃度組、空白組和健康對照組（P 均<0.05）。見表4、圖3。

2.6 各組MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞NEMO 泛素化率比較 與低濃度組比較，高濃度組CD4+T 細(xì)胞NEMO 泛素化率明顯下調(diào)（P 均<0.05）；高、低濃度組CD4+T 細(xì)胞NEMO 泛素化率低于空白組，高于健康對照組（P 均<0.05）。見表5、圖4。

表4 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞ubch5c 活性抑制率比較（%，）

表4 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞ubch5c 活性抑制率比較（%，）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

圖3 MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞ubch5c 活性變化

表5 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞NEMO 泛素化率比較（%，）

表5 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞NEMO 泛素化率比較（%，）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；NEMO 為NF-κB必須調(diào)節(jié)蛋白；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

圖4 MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細(xì)胞NEMO 線性泛素化

3 討論

微炎癥狀態(tài)是指人機(jī)體在各種內(nèi)毒素、免疫復(fù)合物等刺激下，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活，表達(dá)和分泌促炎癥細(xì)胞因子，緩慢發(fā)生并持續(xù)存在的免疫性炎癥，是導(dǎo)致MHD 患者發(fā)生并發(fā)癥的主要因素，且減弱患者腎功能和透析充分性[6-7]。張倫等[8]研究也表明淋巴細(xì)胞比例影響MHD 患者的健康狀況。

本實驗發(fā)現(xiàn)，通過與健康志愿者進(jìn)行比較，MHD患者外周血Th17、Treg 水平增高，單核巨噬Th17/Treg 顯著上升（P 均<0.05），且各炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10 均升高（P 均<0.05）。經(jīng)過倍半萜內(nèi)酯化合物TJ-5 處理可有效抑制CD4+T 細(xì)胞促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌，并促進(jìn)抗炎性因子IL-10 上調(diào)，減弱免疫性炎癥。

當(dāng)CD4+T 細(xì)胞受到外界因素刺激后，I-κB 被磷酸化并降解，激活CD4+T 細(xì)胞經(jīng)典的NF-κB 信號通路，P65 在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中可被磷酸化，磷酸化的P65 更容易與特異性啟動的靶基因結(jié)合促進(jìn)IL-6、TNFα、IL-1β 等炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，并抑制IL-10 等抑炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮協(xié)同作用，對于炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展相當(dāng)重要[9-10]。實驗表明，經(jīng)過倍半萜內(nèi)酯化合物TJ-5 處理后，CD4+T 細(xì)胞p65 表達(dá)及其磷酸化明顯下調(diào)（P 均<0.05），I-κB 表達(dá)上調(diào)（P<0.05），其磷酸化明顯下調(diào)（P<0.05），CD4+T 細(xì)胞NF-κB 信號通路被抑制，但還無法恢復(fù)到正常水平。

核因子NF-κB 必需調(diào)節(jié)劑（NEMO）是NF-κB 信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過傳遞細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號，可以控制NF-κB 調(diào)節(jié)的基因[11-12]。ubch5c 是TNF-α 觸發(fā)的核因子κB（NF-κB）激活過程中催化NEMO 泛素化的關(guān)鍵泛素酶之一[13-14]。α-santonin 衍生的ubch5c 抑制劑TJ-5 是一種先導(dǎo)化合物，用于炎性和自身免疫疾病的治療，TJ-5 通過與ubch5c 活性位點Cys85 形成共價加合物而優(yōu)先結(jié)合并滅活ubch5c[15-18]。本研究表明，倍半萜內(nèi)酯化合物TJ-5 抑制ubch5c 酶活性，減弱NEMO 線性泛素化，調(diào)控CD4+T 細(xì)胞NF-κB 通路表達(dá)分泌IL-6、TNFα、IL-1β 等炎性細(xì)胞因子。

倍半萜內(nèi)酯化合物TJ-5 現(xiàn)主要以體外及動物實驗為主，臨床研究還較少，對于具體療效及安全程度尚未知悉，需要更深入研究調(diào)查，以望為血液透析患者提供更優(yōu)質(zhì)、經(jīng)濟(jì)實惠的治療方案，提高透析患者的生存質(zhì)量。