辛基功能化離子液體鍵合硅膠固相萃取海水中貝類毒素的方法研究

孫曉杰　丁海燕　譚杰　邢鈞　郭萌萌　邢麗紅　李兆新　翟毓秀

摘 要 貝類毒素（Shellfish toxins）是重點(diǎn)監(jiān)控的海洋污染物。本研究通過將辛基功能化離子液體接枝到硅膠表面，制備了一種混合模式的共價鍵合硅膠材料 （Silica-[SOIM＼][PF6＼]），利用紅外光譜、核磁共振和元素分析進(jìn)行了表征。采用自制材料填制固相萃取柱，通過固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPE-LC-MS/MS）技術(shù)對海水中貝類毒素（大田軟海綿酸毒素（OA）、鰭藻毒素-1 （DTX-1）和鰭藻毒素-2 （DTX-2））進(jìn)行富集檢測。研究發(fā)現(xiàn)，此固相萃取材料與目標(biāo)貝類毒素可能存在疏水作用和離子交換作用等多重相互作用。分別對進(jìn)樣溶液的體積和pH值、淋洗劑和洗脫劑的種類、用量以及pH值范圍等因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，此固相萃取材料對海水中3種貝類毒素具有良好的萃取效果，優(yōu)于或與商用化萃取材料性能相當(dāng)，檢出限（LOD）為0.01 μg/L，定量限（LOQ）為0.05 μg/L，在0.02～2.50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.995），回收率在93.0%～116%之間。同時，材料具有良好的重現(xiàn)性，批內(nèi)和批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡便、可靠，可用于實(shí)際樣品中貝類毒素的萃取檢測。

關(guān)鍵詞 離子液體; 固相萃取; 混合模式; 貝類毒素; 海水

1 引 言

我國是世界上最大的貝類養(yǎng)殖國。海洋中有毒微藻或微生物產(chǎn)生的貝類毒素，可污染海洋水體和海洋生物，并主要在雙殼貝類中富集，可經(jīng)食物鏈濃縮放大上萬倍，最終危害人類的生存和健康[1～5]。貝類毒素已成為發(fā)達(dá)國家制定貿(mào)易和技術(shù)壁壘的重要指標(biāo)。歐盟指令（EC）No.15/2011規(guī)定小鼠生物法測定貝類毒素含量作為官方標(biāo)準(zhǔn)于2014年以后停用，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）作為取代方法，可對單個組分分別進(jìn)行定性和定量分析，已成為監(jiān)測貝類毒素的重點(diǎn)發(fā)展方法[6～12]，并建立了相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)[13]。然而，由于貝類毒素結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類較多，提取富集等前處理技術(shù)成為限制其準(zhǔn)確定量分析的主要瓶頸。為更好地評價貝類毒素對海洋生態(tài)的影響，監(jiān)控赤潮等有毒藻類爆發(fā)，保障貝類等水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，亟需開發(fā)更有效的前處理方法和更靈敏的檢測技術(shù)。

固相萃取是復(fù)雜樣品富集凈化的常用前處理技術(shù)，目前，用于污染物富集純化的商用固相萃取柱與萃取對象作用模式單一。針對復(fù)雜樣品中的多種組分分別提取純化，步驟繁多， 耗時費(fèi)力， 成本較高，同時耗用大量有機(jī)試劑，造成嚴(yán)重環(huán)境污染。因此，亟需研發(fā)含多種官能團(tuán)的混合模式固相萃取材料，實(shí)現(xiàn)對樣品中復(fù)雜多組分同時富集純化， 提高分離檢測效率。離子液體（Ionic liquids， ILs）是一種新型的萃取材料，憑借良好的熱穩(wěn)定性、低可燃性、不易揮發(fā)及低毒性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于色譜樣品的前處理[14，15]。經(jīng)過多年研究，離子液體色譜材料的選擇性能得到了逐步改善。將離子液體鍵合固定到載體上，可得到具有離子液體功能結(jié)構(gòu)的固相萃?。⊿olid phase extraction， SPE）新材料。目前，固定化的離子液體多用于液相色譜柱[16～18]、氣相色譜柱[19，20]及毛細(xì)管電色譜柱[21，22]的固定相，極少作為固相萃取吸附劑使用。Tian等[23] 于2009年首先提出了離子液體固相吸附劑的研究方案，與離子液體-液液萃取相比，可有效克服離子液體粘度大、不易操作等缺點(diǎn)，同時增大了被分離物質(zhì)與離子液體的接觸面積，在痕量組分的分離富集中具有良好的應(yīng)用前景。固定化離子液體的相關(guān)研究起步較晚，主要用于萃取分離常見有機(jī)污染物[24，25]。離子液體固相萃取材料可在保留原有固相載體性質(zhì)的基礎(chǔ)上，同時發(fā)揮離子液體的特異選擇性。另外，萃取材料可再生重復(fù)利用，將有效減少離子液體的使用量，增加萃取材料的使用率，降低前處理成本。因而，制備新型的離子液體固相萃取材料，是發(fā)展高效萃取技術(shù)的重要途徑之一。

本研究通過接枝方法將辛基功能化離子液體固定到硅膠載體上，即形成離子液體共價鍵合硅膠材料，是具有混合模式的功能化萃取材料，可實(shí)現(xiàn)對樣品中多性質(zhì)組分分離純化的目標(biāo)。由于離子液體具有大體積的陽離子和小體積的陰離子，與偏酸性目標(biāo)物可能存在陰離子交換作用。因此，選擇3種弱酸性貝類毒素（大田軟海綿酸毒素（Okadaic acid， OA）、鰭藻毒素-1 （Dinophysistoxin-1， DTX-1）和鰭藻毒素-2 （Dinophysistoxin-2， DTX-2））作為目標(biāo)物，將ILs-SPE技術(shù)應(yīng)用于海水樣品中OA、DTX-1和DTX-2的富集和凈化。優(yōu)化了進(jìn)樣溶液的體積和pH值、淋洗劑和洗脫劑的種類、用量及pH值等條件，考察了各種因素對萃取效果的影響，評價了檢測方法的可行性和重現(xiàn)性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

TSQ Quantum AccessTM 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）; Kinetex XB C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm，4 μm，美國Phenomenex公司）; XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠）; Milli-Q型超純水儀（美國Millipore公司）; Thermo Sorvall Biofuge Primo型離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）; Karlsruhe紅外光譜儀、Avance II spectrometer核磁共振儀（德國Brucker公司）; Vario EL cube元素分析儀（德國Elementar公司）。Oasis HLB固相萃?。⊿PE）柱（3 mL， 60 mg，美國Waters公司）和C18固相萃取柱（3 mL，60 mg，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

OA和DTX-1標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，臺灣Algal Science公司）; DTX-2標(biāo)準(zhǔn)溶液（（4.7±0.3） μg/mL， 加拿大海洋生物科學(xué)研究所）; 甲醇 （色譜純，德國Merck公司）; 乙腈（色譜純，德國CNW公司）; 甲酸、甲酸銨（色譜純，德國Fluka公司）; 1-芐基咪唑（色譜純，F(xiàn)luka公司）; 六氟磷酸鉀（色譜純，J&K Chemical公司）。 其余溶劑和試劑均為分析純， 實(shí)驗(yàn)用水為來自Milli-Q超純水系統(tǒng)的超純水。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別稱取適量的OA和DTX-1標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容，配制成10.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃避光保存。準(zhǔn)確吸取適量的OA、DTX-1和DTX-2標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇配制1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18℃避光保存。

2.2 儀器條件和參數(shù)

柱溫：35℃; 流速：0.3 mL/min; 進(jìn)樣量：10 μL; 流動相，A：2 mmol/L 甲酸銨溶液，B：乙腈-2 mmol/L甲酸銨溶液 （95∶5， V/V），梯度洗脫程序：0 min，30% B; 0～3.00 min，30%～90% B; 3.00～6.00 min，90% B; 6.00～6.01 min， 90%～30% B; 6.01～8.00 min， 30% B 。

電噴霧電離源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子模式; 負(fù)離子監(jiān)測; 噴霧電壓為4000 V; 鞘氣和輔助氣體均為高純氮?dú)猓蕷鈮毫Γ?6 L/min，輔助氣壓力：10 L/min，碰撞氣為氦氣; 離子傳輸桿溫度為350℃。碰撞能（Collision energy）及其它相關(guān)質(zhì)譜條件見表1。

2.3 辛基離子液體鍵合硅膠（Silica-[SOIM＼][PF6＼]）的制備

離子液體及鍵合硅膠的制備過程參照圖1。

2.3.1 辛基咪唑的合成 將體積分?jǐn)?shù)為36%甲醛（8.35 g）和體積分?jǐn)?shù)為32%乙二醛（18.1 g）加入250 mL三口燒瓶中，攪拌加熱至50℃回流，然后分別將體積分?jǐn)?shù)28%氨水（6.05 g）和辛胺的甲醇溶液（12.9 g溶于50 mL甲醇）逐滴加入到三口燒瓶，加完后繼續(xù)回流反應(yīng)4 h，純化干燥得到淡黃色辛基咪唑產(chǎn)品。

2.3.2 硅烷基辛基咪唑氯鹽的合成 將γ-氯丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液（0.08 mol， 15.9 g，溶于25 mL甲苯）加入三口燒瓶中， 將2.3.1節(jié)制得的辛基咪唑（0.08 mol， 14.4 g）加入溶解并攪拌均勻，在氮?dú)鈿夥障禄亓?8 h，產(chǎn)物純化干燥得到粘稠狀淡黃色液體， 即硅烷基辛基咪唑氯鹽（[SOIM＼][Cl＼]）。

2.3.3 硅烷基辛基咪唑六氟磷酸鹽的合成 將硅烷基辛基咪唑氯鹽的甲醇溶液（0.05 mol， 18.9 g， 溶于25 mL甲醇中）加入圓底燒瓶中，同時將等摩爾的KPF6溶于甲醇（0.05 mol， 9.20 g， 溶于10 mL甲醇），將兩種溶液混合，室溫攪拌反應(yīng)24 h，得到淡黃色沉淀; 純化干燥得到粘稠狀淡黃色液體， 即硅烷基辛基咪唑六氟磷酸鹽（ [SOIM＼][PF6＼] ）。

2.3.4 離子液體鍵合硅膠的制備 選擇粒徑200～300目的硅膠粉，通過一定濃度的HCl或甲烷磺酸酸化，使硅膠外表面帶有羥基，調(diào)節(jié)pH至中性后高溫干燥，備用。稱取約2 g辛基離子液體[SOIM＼][ PF6]溶于10 mL乙腈，再加入HCl處理的硅膠（40～60目）約4 g，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)24 h后; 將反應(yīng)液過濾，用乙腈和去離子水沖洗去除殘留物，80℃真空干燥5 h，得到淡黃色離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM＼][PF6＼]，產(chǎn)率約80%。

2.4 離子液體鍵合材料性能分析

通過多種儀器分析商用硅膠和離子液體鍵合硅膠的結(jié)構(gòu)、構(gòu)型以及二者的差異。首先通過紅外光譜表征比較鍵合離子液體前后硅膠材料官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化; 其次，采用核磁共振技術(shù)于確定功能化離子液體的結(jié)構(gòu); 然后，通過元素分析，得到離子液體鍵合硅膠材料中C、H、N元素的百分含量，并計算硅膠表面離子液體的鍵合含量。

2.5 固相萃取柱的制備

選用固相萃取柱的柱管體積為3 mL，柱管材料為聚丙烯，進(jìn)出口篩板選用高純度聚乙烯材料（直徑6.4 mm，孔徑20 μm，厚度1.5 mm），內(nèi)部填充固相萃取填料選用自制的Silica-[SOIM＼][PF6＼]（50 mg，粒徑40～60 μm）。先在空柱管底部放入出口篩板，然后裝入自制離子液體鍵合硅膠層，輕輕敲打使其分布均勻，其上垂直壓入進(jìn)口篩板，最后用甲醇沖洗填實(shí)，并保證所有小柱填充后，填料高度保持（5±0.05）mm。

2.6 樣品處理

海水水樣用0.45 μm濾膜過濾，除去懸浮顆粒。固相萃取柱使用前，分別用2.0 mL甲醇和2.0 mL 50 mmol/L乙酸銨活化，棄去流出液。取20 mL過濾后的海水樣品，以約5.0 mL/min流速通過活化的固相萃取小柱進(jìn)行富集。用2.0 mL 50 mmol/L乙酸銨淋洗，減壓抽干后， 用3.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的NH4OH-甲醇洗脫，洗脫液在40℃下氮?dú)獯蹈桑?用0.5 mL初始流動相復(fù)溶，充分渦旋溶解殘?jiān)?濾液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜分析

紅外光譜（IR）是提供結(jié)構(gòu)和構(gòu)象信息的有力工具[26，27]。 對離子液體[SOIM＼][PF6＼]的紅外光譜表征發(fā)現(xiàn)，3127和3059 cm-1對應(yīng)于咪唑環(huán)上CH的伸縮振動，2958、2932和2868 cm-1對應(yīng)于甲基和亞甲基的伸縮振動，1156 cm-1對應(yīng)于SiC的伸縮振動，1083 cm-1和1023 cm-1對應(yīng)于SiO的伸縮振動，證明存在硅烷基。

與未修飾的商用硅膠材料相比，制備的離子液體鍵合硅膠在1570 cm-1處出現(xiàn)了一個弱峰（圖2）。因?yàn)轷０坊奶卣鞣逄幱?500～1600 cm-1之間[28]，這說明一些帶有CN基團(tuán)的離子液體與商用硅膠有效的化學(xué)鍵合生成了新的物質(zhì)。上述結(jié)果表明成功制備了功能化離子液體鍵合硅膠。

3.2 核磁共振譜分析

離子液體[SOIM＼][PF6＼]核磁共振分析結(jié)果如下： 1H-NMR （DMSO， 不含TMS; 400 MHz; δ ppm）： 9.16 （s， 1H）， 7.78 （m， 2H）， 4.15 （m， 4H）， 3.47 （m， 9H）， 1.85 （m， 4H）， 1.25 （m， 10H）， 0.86 （t， 3H）， 0.54（m， 2H）。其中， 9.16和7.78對應(yīng)咪唑環(huán)上的H的位移， 4.15對應(yīng)與咪唑環(huán)相連的兩個亞甲基上H的位移，3.47對應(yīng)硅烷基上H的位移， 1.85對應(yīng)與咪唑環(huán)相連的第二個亞甲基H的位移，1.25對應(yīng)辛基取代基上5個亞甲基H的位移，0.86對應(yīng)辛基取代基上甲基H的位移，0.54對應(yīng)于與硅烷基相連的亞甲基H的位移。結(jié)果表明，成功制備了辛基功能化離子液體。

3.3 元素分析

對修飾前后的硅膠材料進(jìn)行元素分析，未修飾硅膠中只測得H元素的含量（0.983%），辛基功能化離子液體修飾后，N、C和H元素的質(zhì)量百分含量分別為2.73%、9.65%和2.07%，說明離子液體成功修飾到硅膠上，并可根據(jù)N元素的含量推算出1 g硅球表面有機(jī)基團(tuán)鍵合量，對應(yīng)辛基功能化離子液體的鍵合量為1.95 mmol。

3.4 固相萃取條件優(yōu)化

采用制備的辛基離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM＼][PF6＼]填制固相萃取柱（3 mL，50 mg），用于富集凈化水中3種貝類毒素OA、DTX-1和DTX-2。采用空白基質(zhì)加標(biāo)方式（0.5 μg/L），對影響萃取效率和回收率的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，包括樣品預(yù)處理?xiàng)l件、樣品溶液進(jìn)樣條件、雜質(zhì)淋洗條件和目標(biāo)物洗脫條件，每個條件下做6個平行實(shí)驗(yàn)。

3.4.1 進(jìn)樣溶液體積的影響 固相萃取填料有載樣上限，超負(fù)荷進(jìn)樣，會影響目標(biāo)物的回收率和凈化效果。取適量貝類毒素（OA、DTX-1和DTX-2）混合加標(biāo)濃度為0.5 μg/L的海水進(jìn)行分析，研究不同進(jìn)樣體積（5、10、20、30和50 mL）對萃取效果的影響（本研究部分均采用2.0 mL純水淋洗，2.0 mL甲醇洗脫），結(jié)果見圖3。

根據(jù)公式（1）計算富集倍數(shù)（EFs）：

EFs =Ct/C0 = （nt/Vt）/C0（1）

其中，Ct為最終樣品溶液中目標(biāo)物濃度，C0為初始樣品溶液中目標(biāo)物濃度，nt為目標(biāo)物最終摩爾量，Vt為最終定容溶液體積。

當(dāng)最終定容溶液體積Vt和初始樣品溶液濃度C0確定后，進(jìn)樣量越大，對應(yīng)最終摩爾量nt越大，富集倍數(shù)越高，方法靈敏度越好。然實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著進(jìn)樣體積增大，引入雜質(zhì)增多，對目標(biāo)物的干擾增大，且進(jìn)樣速度變緩，50 mL整體進(jìn)樣時間超過0.5 h， 增大了凈化難度。綜合考慮方法的前處理效率和靈敏度，最終選擇進(jìn)樣體積為20 mL。

3.4.2 進(jìn)樣溶液pH值的影響 辛基離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM＼][PF6＼]含有陰陽離子基，可能與目標(biāo)貝類毒素發(fā)生疏水作用、離子交換作用和靜電作用等多種模式作用。如圖4所示，3種貝類毒素的結(jié)構(gòu)中都含有羧基，在不同pH值條件下穩(wěn)定態(tài)不同，可能影響其回收率。分別通過甲酸和氨水調(diào)整進(jìn)樣海水pH值，取20 mL海水進(jìn)樣，比較了pH 5.5（5%甲酸）、pH 10.5（5%氨水）、pH 7.0和8.0（常規(guī)海水pH值為7.5～8.3）的貝毒加標(biāo)海水樣品（0.5 μg/L）的回收率（均采用2.0 mL純水淋洗，2.0 mL甲醇洗脫）。結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣液pH值為7.0和8.0時，目標(biāo)貝類毒素的回收率均大于80%（圖5），明顯高于弱酸（pH 5.5）和弱堿（pH 10.5）條件，說明離子交換作用可能不是Silica-[SOIM＼][PF6]型小柱與貝類毒素間的主要作用力。為操作方便和方法的可重復(fù)性，海水樣品可采取直接萃取富集，不調(diào)整pH值的方式。

3.4.3 淋洗溶劑的影響 對復(fù)雜基質(zhì)樣品，為排除基質(zhì)干擾及提高檢測靈敏度，洗脫目標(biāo)物之前需增加淋洗步驟。由于硅膠表面修飾了離子液體，同時檢測對象為海水樣品，沸點(diǎn)高且鹽含量較高，為避免對質(zhì)譜儀器造成污染，固相萃取過程的第一步淋洗劑采用純水，可去除大量水溶性干擾物。取20 mL貝類毒素（OA、DTX-1和DTX-2）混合加標(biāo)濃度為0.5 μg/L的海水進(jìn)樣，分別評價了30%甲醇、純水和50 mmol/L乙酸銨溶液作為淋洗液的凈化效果和回收率（2.0 mL甲醇洗脫）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30%甲醇和純水淋洗時，3種貝類毒素都有不同程度損失，說明離子交換作用可能不是自制Silica-[SOIM＼][PF6＼]柱與目標(biāo)貝類毒素間的主要作用力。當(dāng)使用50 mmol/L乙酸銨作為淋洗液時，目標(biāo)貝類毒素的回收率最高、損失最小。此外，為確定淋洗液的用量，考察了不同體積（1.0～6.0 mL）淋洗液的效果，當(dāng)體積小于2.0 mL時，隨淋洗液用量增加，洗出液的干擾量逐漸增大; 當(dāng)淋洗液大于2.0 mL后，不再出現(xiàn)干擾峰。因此，選擇2 mL 50 mmol/L乙酸銨作為后續(xù)研究的淋洗劑。

3.4.4 洗脫溶劑的影響 如圖4所示，3種目標(biāo)貝類毒素結(jié)構(gòu)中都含有羧基基團(tuán)，屬于弱酸性物質(zhì)。考慮到Silica-[SOIM＼][PF6＼]上咪唑基的弱堿性，適當(dāng)pH值的洗脫溶劑可使辛基離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM＼][PF6＼]或目標(biāo)貝類毒素變?yōu)橹行裕瑥亩赡艽蚱莆絼┡c目標(biāo)分子間的相互作用力。因此，洗脫溶劑pH值可能是影響貝類毒素從Silica-[SOIM＼][PF6＼]柱上洗脫效果的重要因素。以5% NH4OH-甲醇、2% HAc-甲醇和純甲醇作為洗脫溶劑進(jìn)行了初步測試。結(jié)果表明（表2），采用純甲醇洗脫時，3種貝類毒素的回收率均大于85%，推測Silica-[SOIM＼][PF6＼]材料的保留性能同反相C18小柱相似，與目標(biāo)貝類毒素間存在疏水作用力; 另外，5% NH4OH-甲醇洗脫不僅能得到無色、澄清的流出液體，而且回收率優(yōu)于2% HAc-甲醇和純甲醇，推測Silica-[SOIM＼][PF6＼]材料與3種貝類毒素間同時存在陰離子交換作用，部分以陰離子狀態(tài)存在的貝類毒素轉(zhuǎn)化成分子形式被洗脫下來。

因此，選擇含有NH4OH的甲醇溶劑洗脫分析物。在此基礎(chǔ)上，考察甲醇中NH4OH含量（0%、2%、5%和10%）對回收率的影響。結(jié)果表明，NH4OH含量從0增加到5%，3種分析物的回收率迅速增加，當(dāng)濃度進(jìn)一步增加

[FQ（72。242，Y-WZ][HT5”SS][HJ*4]表2 不同洗脫溶劑對貝類毒素各組分回收率的影響到10%時，回收率增大幅度變慢。因此，選擇5% NH4OH-甲醇作為洗脫溶劑。對洗脫劑體積進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明， 3 mL 5% NH4OH-甲醇即可充分洗脫分析物，過量會延長氮吹濃縮時間。因此，選擇洗脫體積為3 mL。

3.5 與商用萃取柱比較

貝類毒素的相關(guān)研究多采用HLB柱、C18柱等凈化材料。本研究通過空白海水加標(biāo)方式（0.50 μg/L），分別對比了最優(yōu)條件下自制離子液體鍵合硅膠柱（Silica-[SOIM＼][PF6＼]）和兩種商用化固相萃取柱（HLB柱和C18柱（3 mL，60 mg））的凈化效果和回收率。加標(biāo)海水進(jìn)樣體積均為20 mL。兩種商用固相萃取小柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水活化，進(jìn)樣后用2 mL水淋洗、2 mL甲醇洗脫。相應(yīng)條

件下做6個平行，回收率見表3。結(jié)果表明，自制離子液體鍵合硅膠柱回收效果與商用HLB柱相當(dāng)，均優(yōu)于C18柱。自制的離子液體鍵合硅膠柱（Silica-[SOIM＼][PF6＼]）與商用C18柱相比，不僅具有辛基疏水基團(tuán)，與目標(biāo)物間還可能存在離子交換作用等多種混合作用力，萃取效果明顯改善。同時，自制小柱填料量（3 mL，50 mg）少于商用HLB柱（3 mL，60 mg），說明其萃取性能與同時具有親脂親水性能的HLB柱相當(dāng)。

3.6 方法評價

3.6.1 方法的檢出限及定量限 取0.02～2.50 μg/L的混合貝類毒素海水進(jìn)樣，以色譜峰面積與貝毒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制校正曲線，3種貝類毒素線性相關(guān)方程分別為： OA， y=-2.96676+2944.44x （R2=0.9969）; DTX-2， y=622.875+904.353x （R2=0.9995）; DTX-1： y=20.3688+2463.97x （R2=0.9997）。 3種貝毒的檢出限（LOD， S/N>3）為0.01 μg/L，定量限（LOQ， S/N>10）為0.05 μg/L，表明制備的離子液體鍵合硅膠具有較好的萃取效果。

3.6.2 方法的精密度及萃取材料的重現(xiàn)性 在優(yōu)化條件下，通過貝類毒素加標(biāo)水樣（0.50 μg/L），考察方法的日內(nèi)（n=5）和日間（n=3）精密度。在不同時間，測得3種貝類毒素的RSD在2.8%～12.3%之間，表明此方法精密度較好。對同一批次和不同批次制備材料的萃取效果進(jìn)行重現(xiàn)性評價，同一批次萃取材料（n=5）在同一時間對3種貝類毒素的RSD在 3.8%～9.5%之間，不同批次萃取材料（n=3）在同一時間測得結(jié)果RSD為6.2%～11.6%，說明此萃取材料的制備重現(xiàn)性良好。

3.7 實(shí)際應(yīng)用

參照本研究2.2和2.6節(jié)的儀器檢測方法和樣品處理方法，按最優(yōu)的萃取方法對取自青島沙子口的海水樣品進(jìn)行處理，如圖6A所示，海水樣品中不含貝類毒素。為評價方法的富集凈化效果，以此樣品作為空白樣品，添加兩個濃度水平（0.2和1.0 μg/L）的貝類毒素，測定方法的回收率。貝類毒素加標(biāo)海水樣品的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）圖見圖6B，經(jīng)離子液體鍵合硅膠柱處理后，貝類毒素得到了有效富集凈化，根據(jù)公式（1）計算富集倍數(shù)約為40。如表4所示， 3種貝類毒素的加標(biāo)回收率在93.0%～116.0%之間，RSD均小于12%。結(jié)果表明，自制離子液體鍵合硅膠固相萃取材料及相關(guān)前處理方法適用于海水中貝類毒素的萃取檢測。

4 結(jié) 論

制備了一種混合模式辛基功能化離子液體共價鍵合硅膠萃取材料，并應(yīng)用于海水中貝類毒素的萃取分析。研究表明， 此固相萃取材料可能通過疏水作用、離子交換作用等多種模式與目標(biāo)貝類毒素（OA、DTX-1和DTX-2）作用，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，對海水中3種貝類毒素的檢測顯示了良好的靈敏度和準(zhǔn)確性。優(yōu)化的萃取條件為：進(jìn)樣20 mL海水，用2 mL 50 mmol/L乙酸銨溶液淋洗、3 mL 5 % NH4OH-甲醇洗脫。結(jié)果表明，本方法的萃取效果優(yōu)于商用C18柱，與HLB柱性能相當(dāng)，表明本方法是一種測定海水中貝類毒素含量的可行的替代方法。同時，此離子液體功能化硅膠材料具有良好的重現(xiàn)性，可通過淋洗再生，反復(fù)使用，降低了檢測成本。另外，可靈活設(shè)計制備具有多個不同基團(tuán)的離子液體，通過鍵合硅膠作為功能化萃取材料，實(shí)現(xiàn)對環(huán)境和食品不同基質(zhì)中污染物的富集凈化，具有良好的應(yīng)用前景。

References

1 Harwood D T， Selwood A I， Ginkel R V. Toxicon， 2014， 90： 213-225

2 Pérez-Gómez A， Ferrero-Gutierrez A， Novelli A. Toxicol. Sci， 2006， 90（1）： 168-177

3 Sheppeck J E， Gauss C M， Chamberlin A R. Bioorg. Med. Chem.， 1997， 5（9）： 1739-1750

4 Valdiglesias V， Méndez J， Pásaro E， Cemeli E， Anderson D， Laffon B. Mutat. Res.， 2010， 689（1-2）： 74-79

5 Dominguez H J， Paz B， Daranas A H， Norte M， Franco J M， Fernández J J. Toxicon， 2010， 56： 191-217

6 Cho Y， Ozeki R， Yotsu-Yamashita M. Harmful Algae， 2013， 25： 47-53

7 Cho Y， Tsuchiya S， Yoshioka R. Harmful Algae， 2015， 49： 58-67

8 Mattarozzi M， Milioli M， Bianchi F， Cavazza A， Pigozzi S， Milandri A， Careri M. Food Control， 2016， 60： 138-145

9 YAO Jian-Hua， TAN Zhi-Jun， ZHOU De-Qing. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（12）： 1714-1720

姚建華， 譚志軍， 周德慶. 分析化學(xué)， 2010， 38（12）： 1714-1720

10 YAO Jian-Hua， TAN Zhi-Jun， ZHOU De-Qing， GUO Meng-Meng， XING Li-Hong， YANG Shou-Guo. Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（4）： 363-367

姚建華， 譚志軍， 周德慶， 郭萌萌， 邢麗紅， 楊守國. 色譜，? 2010， 28（4）： 363-367

11 YANG Xiao， HUANG Hua-Wei，WU Yuan-An，WAN Yi-Wen， LI Xiao-Ling， HUANG Xiang-Rong. Chinese Journal of Chromatography， 2019， 37（5）： 505-511

楊 霄， 黃華偉， 伍遠(yuǎn)安， 萬譯文， 李小玲， 黃向榮. 色譜， 2019， 37（5）： 505-511

12 Berre M L， Kilcoyne M， Kane M. Toxicon， 2015， 103： 169-175

13 GB 5009. 212-2016， Detection of Diarrhetic Shellfish Poisoning in Shellfish. National Standards of the People's Republic of China

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中腹瀉性貝類毒素的測定. 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn). GB 5009. 212-2016

14 Poole C F. J. Chromatogr. A， 2004， 1037（1-2）： 49-82

15 Sun X J， Tan J， Ding H Y， Tan X J， Xing J， Xing L H， Zhai Y X， Li Z X. J. Anal. Methods Chem.，2018： 3765682

16 Liu S J， Zhou F， Zhao L， Xiao X H， Liu X， Jiang S X. Chem. Lett.， 2004， 33（5）： 496-497

17 Qiu H D， Jiang S X， Liu X. J. Chromatogr. A， 2006， 1103（2）： 265-270

18 Wang Q， Baker G A， Baker S N. Analyst， 2006， 131（11）： 1000-1005

19 Sun X J， Zhu Y L， Wang P， Li J， Wu C Y， Xing J. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（6）： 833-841

20 Sun X J， Wu C Y， Xing J. J. Sep. Sci.， 2010， 33（20）： 3159-3167

21 Qin W D， Li S F Y. Electrophoresis， 2002， 23（24）： 4110-4116

22 Qin W D， Li S F Y. J. Chromatogr. A， 2004， 1048（2）： 253-256

23 Tian M L， Yan H Y， Row K H. J. Chromatogr. B， 2009， 877（8/9）： 738-742

24 Qiu H D， Jiang Q， Wei Z， Wang X S， Liu X， Jiang S X. J. Chromatogr. A， 2007， 1163（1-2）： 63-69

25 Qiu H D， Jiang S X， Liu X. J. Chromatogr. A， 2006， 1103（2）： 265-270

26 Gremlich H， Yan B. Infrared and Raman Spectroscopy of Biological Materials. New York： Marcel Dekker Press， 2000： 1

27 ZHU Nan-Nan， SUN Zhi-Rong， QU Ji-Xu，HE Yu-Xin， MA Fang， SUN Su-Qin. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2018， 38（11）： 3407-3413

朱南南， 孫志蓉， 曲繼旭， 賀雨馨， 馬 芳， 孫素琴. 光譜學(xué)與光譜分析， 2018， 38（11）： 3407-3413

28 Kilimann K， Doster W， Vogel R， Hartmann C， Gnzle M. Biochim. Biophys. Acta， 2006， 1764（7）： 1188-1197

Abstract Shellfish toxins are a kind of important marine pollutant. In this study， a novel ionic liquid bonded silica gel material （silica-[SOIM＼][PF6＼]） was prepared by grafting octyl-functionalized ionic liquid onto silica gel， which was characterized and analyzed by infrared spectroscopy （IR）， nuclear magnetic resonance （NMR）， and elemental analysis. Solid phase extraction cartridge of silica-[SOIM＼][PF6＼]， coupled with LC-MS/MS technique was used to extract and determine the concentration of shellfish toxins [Okadaic acid （OA）， Dinophysistoxin-1 （DTX-1） and Dinophysistoxin-2 （DTX-2）＼] in seawater for the first time. It was found that the solid phase extraction material silica-[SOIM＼][PF6＼] had multiple interactions with the 3 kinds of shellfish toxins， such as hydrophobic and ion-exchange. The method was optimized in aspects of volume and pH of the loaded sample solution， as well as the usage of rinsing and eluting reagents. Results indicated that the silica-[SOIM＼][PF6＼] had good extraction effect on target shellfish toxins in seawater， which was better than or equivalent to the performance of commercial extraction materials. The method had a good linearity （R2>0.995） in the concentration range of shellfish toxins from 0.02 μg/L to 2.50 μg/L， with limit of detection （LOD） of 0.01 μg/L and limit of quantification （LOQ） of 0.05 μg/L. The average recoveries for 3 kinds of shellfish toxins were 93.0%-116.0% at different spiking levels in blank seawater. Simultaneously， the material had good reproducibility， with the relative standard deviation （RSD） of less than 15% intra- and inter-batch. This method was accurate， sensitive， simple and reliable， and could be used for the extraction and detection of shellfish toxins in actual samples.

Keywords Ionic liquid; Solid phase extraction; Multiple mode; Shellfish toxins; Seawater