基于石墨烯和金納米粒子的銅離子配位-分子印跡電化學(xué)傳感器用于凝血酶的檢測(cè)

柏朝朋　楊紹明　滕渝　張劍

摘 要 利用分子印跡技術(shù)與銅離子（Cu2+）配位單元為雙重識(shí)別模式，使用層層自組裝先將L-半胱氨酸（L-cys）通過(guò)AuS鍵組裝到石墨烯（rGO）和金納米粒子（AuNPs）修飾的玻碳電極表面，再將Cu-凝血酶（THR）絡(luò)合物通過(guò)L-cys與Cu2+配位作用組裝到電極表面，以硫堇（Tn）為聚合單體，使用電聚合法聚合得到分子印跡膜，制備了具有雙重識(shí)別模式的金屬離子配體-分子印跡電化學(xué)傳感器。采用掃描電鏡（SEM）和能譜色散儀（EDS）對(duì)復(fù)合納米材料進(jìn)行表征。利用循環(huán)伏安法（CV）、交流阻抗法（EIS）和差分脈沖伏安法（DPV）對(duì)傳感器性能進(jìn)行了研究，在最佳檢測(cè)條件下，傳感器響應(yīng)與THR濃度在2.0×10-9～5.0×10-7 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為-ΔI （μA）= 17.73 + 1.84 lgc（g/L）。構(gòu)建了THR 分子印跡電化學(xué)傳感器的動(dòng)力學(xué)吸附模型，測(cè)得印跡傳感器的印跡因子β=4.32，結(jié)合速率常數(shù)k=5.68 s。傳感器表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可用于實(shí)際樣品中凝血酶的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 石墨烯; 金納米粒子; 凝血酶; 雙重識(shí)別模式; 分子印跡電化學(xué)傳感器

1 引 言

分子印跡電化學(xué)傳感器（MIECSs）是基于分子印跡技術(shù)（MIT）和電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，利用分子印跡聚合物（MIPs）作為特異性識(shí)別元件，對(duì)模板分子具有高選擇識(shí)別性能的一類傳感器。MIECSs兼具分子印跡技術(shù)和電化學(xué)傳感器的優(yōu)勢(shì)，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實(shí)用性強(qiáng)、制備和檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)[1]，在環(huán)境檢測(cè)[2]、食品檢測(cè)[3]、藥品檢測(cè)[4]和化妝品檢測(cè)[5]等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。隨著分子印跡技術(shù)的不斷發(fā)展，分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測(cè)范圍也不斷擴(kuò)大，分析物質(zhì)從雙酚A[6]、多巴胺[7]、槲皮素[8]等小分子物質(zhì)發(fā)展到蛋白質(zhì)[9]、DNA[10]等生物大分子。近年來(lái)，對(duì)蛋白質(zhì)大分子的分子印跡傳感器研究逐漸深入，已成功制備了牛血清白蛋白[11]，血紅蛋白[12]，溶菌酶[13]，細(xì)胞色素[14]，葡萄糖氧化酶[15]等多種蛋白質(zhì)的印跡傳感器，拓寬了分子印跡電化學(xué)傳感器的實(shí)際應(yīng)用范圍。但是，目前分子印跡傳感器檢測(cè)蛋白質(zhì)分子還面臨著諸多挑戰(zhàn)，如蛋白質(zhì)體積大、功能基團(tuán)空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、對(duì)溫度和pH值敏感、識(shí)別單一、特異性較差等。因此，開(kāi)發(fā)一種協(xié)同識(shí)別、特異性好、快速、高靈敏的蛋白質(zhì)分子印跡電化學(xué)傳感器具有十分重要的意義。本研究構(gòu)建了一種雙重識(shí)別模式的金屬離子配位-分子印跡電化學(xué)傳感器，對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行特異性識(shí)別，這種雙重識(shí)別來(lái)源于金屬離子配位和表面分子印跡的共同作用。金屬Au納米粒子（AuNPs）與模板分子中的L-半胱氨酸（L-cys）的巰基形成AuS金屬鍵，含氮化合物作為金屬離子配體，L-cys分子中的氨基氮和羰基氧中孤對(duì)電子與Cu2+形成穩(wěn)定的配合物; 印跡分子洗脫后的聚合物骨架上留有與印跡分子在空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)官能團(tuán)兩方面均互補(bǔ)的識(shí)別部位。在共價(jià)鍵和多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用力的協(xié)同作用下，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)分子多方位多角度的識(shí)別。

在分子印跡電化學(xué)傳感器檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究中，常規(guī)蛋白質(zhì)印跡傳感器存在檢測(cè)分析信號(hào)響應(yīng)較差＼，靈敏度不足等缺點(diǎn)，為解決該問(wèn)題，研究者將碳納米材料[16，17]、金屬納米顆粒[17，18]、量子點(diǎn)[19，20]等應(yīng)用到傳感器表面，作為增敏材料，提高電子傳輸速率和導(dǎo)電性，增強(qiáng)靈敏度。相比于其它增敏材料，石墨烯（rGO）具有二維平面結(jié)構(gòu)、大的比表面積和優(yōu)良的電子傳導(dǎo)速率，常作為基質(zhì)用于制備各類傳感器[21～23]; 金納米粒子（AuNPs）具有優(yōu)異的導(dǎo)電和催化性能[23，24]，故兩種增敏材料在分子印跡電化學(xué)傳感器領(lǐng)域備受關(guān)注。如Jin等[22]使用電沉積和電聚合法在泡沫鎳（NF）上制備了MIPs/rGO-AgNPs/NF傳感器，對(duì)實(shí)際樣品中的天麻素進(jìn)行靈敏和選擇性檢測(cè)。Yun等[23]制備了以AuNPs和rGO為敏化材料的分子印跡傳感器，用于金剛烷胺的靈敏檢測(cè)，結(jié)果表明，該傳感器具有較寬的檢測(cè)范圍、較低的檢出限和高的選擇性。李穎等[24]基于磁性氧化石墨烯包裹的金納米粒子（MGO@AuNPs）復(fù)合材料制備了分子印跡傳感器，并對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該傳感器具有很高的選擇性和靈敏度。

本研究將rGO和AuNPs增敏納米材料修飾到玻碳電極表面，然后通過(guò)AuS鍵將L-cys結(jié)合到修飾電極上，再利用L-cys分子中的氨基氮和羰基氧官能團(tuán)與Cu2+配位作用將Cu-THR絡(luò)合物固定到電極表面，最后通過(guò)在硫堇（Tn）溶液內(nèi)電聚合形成印跡THR分子的聚硫堇（PTn）膜，制備得到雙重識(shí)別的銅離子配體-分子印跡電化學(xué)傳感器。此傳感器克服了單獨(dú)分子印跡空穴對(duì)目標(biāo)物的單一識(shí)別靈敏度低、選擇性不佳等缺點(diǎn)。利用循環(huán)伏安法（CV）、交流阻抗法（EIS）和差分脈沖伏安法（DPV）對(duì)傳感器性能進(jìn)行研究，并將其應(yīng)用于實(shí)際血樣中凝血酶的檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

CHI 660C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）; JSM-6701F場(chǎng)發(fā)射型掃描電鏡（日本電子JEOL公司）; 三電極體系（直徑3 mm玻碳電極為工作電極，鉑柱電極為對(duì)電極，Ag/AgCl為參比電極）。

氯金酸（HAuCl4，分析純，Sigma公司）; 無(wú)水CuSO4（>99%，汕頭西隴化工有限公司）; 石墨（光譜純，汕頭西隴化工公司）; 硫堇（>99%，上?；瘜W(xué)試劑公司）; 抗壞血酸（>99%，上海試劑廠）; 鹽酸多巴胺（分子生物學(xué)級(jí)，阿拉丁試劑）; 檸檬酸三鈉（AR，汕頭西隴化工有限公司）; 凝血酶（≥200 U/mg，博美生物公司）; L-半胱氨酸（>98.5%，上海藍(lán)季科技有限公司）; 牛血清白蛋白（BSA，上海晶純有限公司）。

2.2 氧化石墨烯（GO）的制備

采用文獻(xiàn)[25＼]的方法制備氧化石墨并稍作改進(jìn)。在冰水浴條件下，將2.0 g石墨粉加入25 mL濃H2SO4，置于三頸瓶中，進(jìn)行攪拌。緩慢加入6 g P2O5和5 g過(guò)硫酸鉀，在80℃水浴條件下，攪拌反應(yīng)5 h。 另取一個(gè)燒杯，在其中加入250～300 mL蒸餾水，將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)入其中，水洗2～3次，干燥后，得到預(yù)氧化的石墨。

取1.0 g預(yù)氧化的石墨粉末，在冰浴條件下加入50 mL 濃H2SO4、3. 0 g KMnO4和1.2 g KNO3，然后水浴緩慢升溫至約35℃，攪拌反應(yīng)2 h 后，在冰浴條件下，緩慢加入100 mL 蒸餾水，攪拌10 min， 35℃水浴條件下攪拌反應(yīng)2 h。將混合液轉(zhuǎn)入燒杯中，加入30% H2O2處理，溶液顏色由棕褐色變成亮黃色。靜置一段時(shí)間后，倒去上層清液，用10% HCl清洗3 次，離心過(guò)濾，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，45℃ 真空干燥48 h，得到GO樣品，干燥保存，備用。

2.3 修飾電極的制備

GCE按照文獻(xiàn)[26＼]方法進(jìn)行預(yù)處理。用粒徑0.05 μm的氧化鋁（Al2O3）拋光粉在麂皮上拋光打磨，依次于丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水中超聲清洗5 min，然后于5 mmol/L K3Fe（CN）6（含0.1 mol/L KCl）中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，用去離子水沖洗干凈，在0.5 mol/L H2SO4中于1.5～-0.4 V下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到得到穩(wěn)定的可重復(fù)的循環(huán)伏安曲線。用去離子水沖洗干凈，再用高純N2吹干，待用。

將預(yù)處理后的GCE置于1 g/L GO溶液中，在-1.7～+0.2 V范圍內(nèi)，以25 mV/s的掃速循環(huán)伏安掃描20圈，得到還原氧化石墨烯修飾的玻碳電極（rGO/GCE）。取2 mL 2 mmol/L HAuCl4加入6 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=6.0），在N2中除氧10 min。將rGO/GCE置于PBS中，以50 mV/s的掃速，在電位范圍+0.1～-0.9 V條件下掃描15圈，得到AuNPs/rGO/GCE修飾電極; 然后放入0.05 mol/L H2SO4溶液內(nèi)循環(huán)伏安掃描至曲線穩(wěn)定，以去除多余吸附雜質(zhì)。N2吹干后，置于10 mmol/L L-cys溶液中浸泡24 h，沖洗干凈，得到 L-cys/AuNPs/rGO/GCE修飾電極。

Cu-THR混合液的配制： 將THR用緩沖溶液配制成0.2 g/L的儲(chǔ)備液，取80 μL 0.2 g/L THR儲(chǔ)備液與15 μL 0.05 mol/L CuSO4溶液和5 μL 0.1 mol/L NaOH溶液混合，在20℃條件下孵育。將L-cys/AuNPs/rGO/GCE電極置于上述配好的Cu-THR混合液中孵育結(jié)合10 h，取出沖洗并晾干。將修飾電極置于含1 mmol/L Tn的PBS溶液（pH=6.0）內(nèi)，在+1.5 V陽(yáng)極化450 s后，然后在0.1～0.4 V范圍內(nèi)聚合40圈，轉(zhuǎn)入20 mmol/L EDTA溶液中洗脫15 min，再置于0.05 mol/L NaOH溶液中洗脫20 min，制得MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器。非印跡傳感器（NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE）的制備過(guò)程與MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE相同，只是在所有溶液中均不加入THR。

2.4 電化學(xué)測(cè)試方法

電化學(xué)測(cè)試均在CHI660C電化學(xué)工作站上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在室溫（25℃）下進(jìn)行。在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe（CN）6＼]/K4[Fe（CN）6＼]溶液中測(cè)量交流阻抗圖譜，頻率范圍為1～100000 Hz，振幅為0.005 V。

2.5 樣品前處理

以稀釋50%的血液樣品為儲(chǔ)備液。取100 mL儲(chǔ)備液加入0.4 g檸檬酸三鈉，混合均勻， 3000 r/min離心15 min，所得上清液為血漿。取10 μL稀釋1000倍后的血漿進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNPs/rGO/GCE的形貌表征和能譜分析

圖1為AuNPs/rGO/GCE的掃描電鏡圖（SEM）和能譜圖（EDS）。由圖1A可見(jiàn)，60～80 nm大小的形狀規(guī)則的球形AuNPs顆粒均勻分布在電極表面，這種結(jié)構(gòu)能顯著增大電極的比表面積。圖1B為修飾電極表面的能譜分析，可見(jiàn)出現(xiàn)了C、O、Au元素的峰，證明已成功制備AuNPs/rGO/GCE修飾電極。

3.2 修飾電極的制備

在0.5 mol/L K3Fe（CN）6溶液中，不同修飾電極的CV圖見(jiàn)圖2A。AuNPs/rGO/GCE（曲線a）在L-cys溶液中浸泡一定時(shí)間后，CV峰電流明顯增大，如曲線b所示，這是因?yàn)長(zhǎng)-cys擁有優(yōu)良的電化學(xué)活性，能夠促進(jìn)探針[Fe（CN）6＼]3-4在電極表面?zhèn)鬟f，因此峰電流增大，也表明L-cys/AuNPs/rGO/GCE制備成功。將L-cys/AuNPs/rGO/GCE電極放入到Cu-THR溶液中孵育一段時(shí)間后，再次在K3Fe（CN）6溶液中進(jìn)行CV掃描，峰電流明顯減?。ㄇ€c），說(shuō)明Cu-THR配合物結(jié)合到了電極上，阻礙探針[Fe（CN）6＼]3-4在電極上的反應(yīng)。

采用CV法在對(duì)MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE洗脫前后、孵育后的電流信號(hào)變化進(jìn)行表征，如圖2B所示。CV圖是在PBS（pH=6.0，0.1 mol/L NaCl）溶液中以100 mV/s的掃速，在0.2～-0.6 V范圍內(nèi)掃描得到。由曲線a可知，MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE在約-0.2 V出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰; 在EDTA和NaOH溶液中洗脫后，此對(duì)氧化還原峰的峰電流信號(hào)明顯增大（曲線b），印跡膜中嵌入的模板分子被洗脫，留下了特異性的識(shí)別孔穴，使得PTn與基底GCE更容易發(fā)生電子交換; 去除模板后的MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器浸泡在0.05 mol/L CuSO4溶液，再浸入THR溶液孵育后，氧化還原峰電流減?。ㄇ€c），說(shuō)明一部分特異性識(shí)別孔穴又與THR結(jié)合而被占據(jù)，阻礙了PTn在電極上的反應(yīng)。圖2B的內(nèi)插圖為NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的對(duì)照CV圖。雖然d、e、f都在-0.2 V有一對(duì)氧化還原峰，但是洗脫前后孵育后曲線的峰電流大小變化并不大，說(shuō)明聚合膜上沒(méi)有孔穴使得PTn與基底電極之間的電子交換增強(qiáng)。

圖2 （A）不同修飾電極的CV圖： （a） AuNPs/rGO/GCE; （b） L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （c） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （B）MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的CV圖： （a）洗脫前; （b）洗脫后; （c）孵育后。內(nèi)插圖為NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的CV圖： （d）模板洗脫前; （e）模板洗脫后; （f）在CuSO4溶液（0.05 mol/L）和THR溶液（8.0×10-8 g/L）孵育后; （C）修飾電極的EIS圖： （a）裸GCE; （b） rGO/GCE; （c） AuNPs/rGO/GCE; （d） L-cys /AuNPs/rGO/GCE; （e） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （D）MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的EIS圖： （f） 模板洗脫前; （g） 模板洗脫后; （h） 模板再孵育后

Fig.2 （A） Cyclic voltammetry （CV） diagrams of modified electrodes： （a） AuNPs/rGO/GCE; （b） L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （c） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE. （B） CV diagrams of MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE： （a） before template extracting; （b） after template extracting; （c） after rebinding CuSO4 （0.05 mol/L） and THR （8.0×10-8 g/L）. Inset is the CV curve of NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE： （d） before template extracting; （e） after template extracting; （f） after rebinding CuSO4 （0.05 mol/L） and THR （8.0×10-8 g/L）. （C） EIS response of modified electrodes： （a） bare GCE; （b） rGO/GCE; （c） AuNPs/rGO/GCE; （d） L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （e） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE. （D） EIS response of MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE： （f） before template extracting; （g） after template extracting; （h） after rebinding CuSO4 （0.05 mol/L） and THR （8.0×10-8 g/L）. THR， thrombin; MIPs， molecular imprinted polymers; Cys， cysteine

電化學(xué)阻抗譜（EIS）是描述電極表面和界面電阻情況非常有效的手段。Nyquist阻抗圖譜中由一個(gè)半圓和一條直線組成，高頻區(qū)的半圓直徑對(duì)應(yīng)電子轉(zhuǎn)移的阻值，即電子轉(zhuǎn)移阻抗（Ret）。圖2C和2D為不同階段的修飾電極在5 mmol/L K3[Fe（CN）6＼]/K4[Fe（CN）6＼]（含 0.1 mol/L KCl）溶液中的EIS圖。裸玻碳電極（曲線a）的阻抗較小（Ret=95 Ω）; 曲線b對(duì)應(yīng)rGO/GCE電極（Ret=67 Ω）; 曲線c為AuNPs/rGO/GCE電極（Ret=51 Ω），其阻抗值比曲線a 和b的阻抗值都小，說(shuō)明rGO和AuNPs的修飾提高了電子在電極表面的傳遞速度; 曲線d為L(zhǎng)-cys/AuNPs/rGO的電極（Ret=57Ω），阻抗值變化不大，因?yàn)長(zhǎng)-cys本身具有電活性，修飾到電極上并不會(huì)阻礙電子的傳遞; 曲線e為Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE電極（Ret=514 Ω），電極在Cu-THR溶液中孵育后，THR結(jié)合到電極上，阻礙電子的傳遞，阻抗變大。曲線f、g、h表示了MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE 傳感器在洗脫前后及孵育后的電極的阻抗。曲線f較曲線e的阻抗變小，Ret= 203 Ω，說(shuō)明Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE在Tn溶液中聚合后，生成的PTn膜具有電導(dǎo)性，促進(jìn)[Fe（CN）6＼]3-4-在電極上的傳遞; 而洗脫后的曲線g阻抗又進(jìn)一步變小，說(shuō)明去除電極上的模板分子，留下了一部分特異性的識(shí)別孔穴，有利于電子在電極表明的傳遞; 在THR溶液中孵育后的修飾電極的阻抗變大，表明THR占據(jù)了一部分孔穴，阻礙了電子傳遞。

3.3 孵育時(shí)間的影響

將MIPs/AuNPs/rGO/GCE置于濃度為8.0×10-8 g/L THR溶液中孵育不同時(shí)間，用DPV法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，傳感器的響應(yīng)電流逐漸變小，20 min后基本穩(wěn)定，說(shuō)明電極上的特異性孔穴對(duì)THR達(dá)到吸附平衡。選擇20 min為傳感器的吸附時(shí)間。

3.4 MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器對(duì)THR的檢測(cè)

圖3為分子印跡修飾電極在不同濃度的THR孵育后在PBS溶液中的DPV曲線。由圖3A可知，隨著THR濃度增大，修飾電極在PBS溶液中的DPV檢測(cè)的峰電流逐漸變小，這表明更多的THR通過(guò)與Cu2+形成配合物結(jié)合到印跡膜上，占據(jù)印跡膜上的孔穴，阻隔了PTn與基底電極之間的電子交換。如圖3B所示，在2.0×10-9～5.0×10-7 g/L（0.055 pmol/L～14 pmol/L）范圍內(nèi)，傳感器電流變化與THR濃度對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI（μA）=17.73+1.84 lgc （g/L），線性相關(guān)系數(shù)為R=0.996，檢出限（S/N=3）為0.78 ng/L（21 fmol/L）。

將制備的雙識(shí)別模式的銅離子配位-分子印跡電化學(xué)傳感器與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)凝血酶?jìng)鞲衅鞯男阅苓M(jìn)行比較（表1）。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的雙識(shí)別模式的銅離子配位-分子印跡電化學(xué)傳感器的線性范圍較大、檢出限較低，這是由于其將具有大的比表面積和良好導(dǎo)電性的石墨烯和金納米粒子作為基底，分子印跡空穴能特異性識(shí)別THR，而且Cu2+配位能加強(qiáng)THR與電極表面的鍵合力，有效提高了傳感器的性能。

3.5 MIPs/L-cys/AuPs/rGO/GCE傳感器的抗干擾能力

圖4A為PBS緩沖溶液（含0.2 mol/L NaCl pH=6.0）配制的濃度為7.8×10-9 mol/L的THR溶液和10倍濃度（7.8×10―8 mol/L）的牛血清白蛋白（BSA）、鹽酸多巴胺（DPA）、抗壞血酸（AA）的DPV測(cè)試結(jié)果。由圖4可見(jiàn)，MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器對(duì)10倍THR濃度的干擾物的響應(yīng)電流非常小，說(shuō)明MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的特異性識(shí)別孔穴只與目標(biāo)分子發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的選擇性。由于NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE沒(méi)有特異性識(shí)別位點(diǎn)，無(wú)法與目標(biāo)測(cè)試分子進(jìn)行特異性結(jié)合，所以NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE對(duì)目標(biāo)分子和干擾物質(zhì)的電流響應(yīng)都很小。

3.6 配位印跡膜電極傳感器對(duì)THR識(shí)別過(guò)程動(dòng)力學(xué)模型

圖4B為MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE、NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE在7.8×10Symbolm@@9 mg/mL THR溶液中的吸附圖，根據(jù)Langmuir吸附模型，擬合各種電極吸附THR的動(dòng)力學(xué)曲線：

根據(jù)印跡因子公式計(jì)算出THR分子印跡電化學(xué)傳感器的印跡因子β=4.32。 β數(shù)值越大，表明傳感器對(duì)目標(biāo)分子的印跡能力越好。MIPs電極結(jié)合模板分子的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NIPs的速率，因?yàn)镃u2+的配位鍵作用使得MIPs結(jié)合能力更強(qiáng)、選擇性更好，而NIPs電極表面沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)，THR無(wú)法與印跡膜結(jié)合。

3.7 MIPs/L-cys/AuPs/rGO/GCE傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

在最佳檢測(cè)條件下，采用同一根電極對(duì)7.8×10-9 mol/L THR溶液平行測(cè)定3次，電極響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.6%; 在相同條件下制備3根電極，對(duì)7.8×10-9 mol/L THR溶液進(jìn)行測(cè)定，電極響應(yīng)的RSD為5.3%，表明本研究制備的MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將制備好的MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器于4℃條件下保存1周后，響應(yīng)電流為初始響應(yīng)電流的90.3%， 表明此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

3.8 血液樣品分析

為了驗(yàn)證制備的分子印跡MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的效果，對(duì)實(shí)際血樣進(jìn)行了檢測(cè)，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。本傳感器測(cè)定凝血酶回收率較高，具有良好的實(shí)用性，可用于凝血酶樣品的測(cè)定。

4 結(jié) 論

采用銅離子配位和分子印跡構(gòu)建雙識(shí)別模式制備MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE傳感器，利用循環(huán)伏安法、交流阻抗法和差分脈沖伏安法對(duì)傳感器性能進(jìn)行研究，在最佳檢測(cè)條件下，傳感器對(duì)凝血酶在2.0×10-5.0×10-7 g/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果表明，具有雙識(shí)別模式的新型分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)凝血酶有良好的信號(hào)響應(yīng)。此傳感器具有制備簡(jiǎn)單、檢出限低、靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)、良好的實(shí)用性等優(yōu)勢(shì)，有望用于實(shí)際樣品中凝血酶的檢測(cè)。

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