孔雀石綠分子印跡電化學(xué)傳感器的制備與應(yīng)用
2020-02-06 03:48:57韋壽蓮吳嘉喻黃象金謝春生
分析化學(xué) 2020年1期
韋壽蓮 吳嘉喻 黃象金 謝春生
摘 要 以孔雀石綠（MG）為模板分子，通過電聚合鄰苯二胺，在多孔碳納米纖維（PCNF）修飾的玻碳電極表面制備了可特異性識別MG的分子印跡傳感器。采用差分脈沖伏安法（DPV）、循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗法（EIS）表征了傳感器的電化學(xué)性能，優(yōu)化了PCNF的滴涂量、模板分子與功能單體的摩爾比、CV掃描圈數(shù)、洗脫劑、洗脫時間、樣品溶液pH值及孵化時間等實驗參數(shù)。在最佳條件下，DPV峰電流強度與MG濃度在
0.10～10.0 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.042 nmol/L（3S/k）。此傳感器具有良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。將本方法應(yīng)用于市售新鮮草魚及養(yǎng)殖水樣品中MG的含量測定，加標回收率為82.0%～96.5%。
關(guān)鍵詞 分子印跡電化學(xué)傳感器; 電聚合; 多孔碳納米纖維; 孔雀石綠
1 引 言
孔雀石綠（Malachite green， MG）是一種陽離子三苯甲烷染料，因其對魚類的真菌和寄生蟲感染有很好的抑制作用，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被用作抗菌和抗寄生蟲藥[1]。MG很容易被魚組織吸收，并大部分被代謝成親脂的隱色孔雀綠，它在魚組織中可持續(xù)存在很長時間[2]。MG及其代謝物對人類具有致畸、致癌和致突變作用，許多國家禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品中使用MG[3，4]。但因MG的抗菌效果顯著、價格低，在一些地區(qū)仍被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，給水體、魚類產(chǎn)品和人體健康造成危害。因此，建立靈敏、準確、簡便的MG檢測方法具有重要的意義。
目前，MG的檢測方法包括高效液相色譜[5，6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7，8]、毛細管電泳法[9]、表面增強拉曼光譜法[10]和電化學(xué)方法[11，12]等。其中電化學(xué)方法具有響應(yīng)快、靈敏度高、操作簡單和易于微型化等優(yōu)點，特別適合于常規(guī)分析。分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers， MIPs）是一種人工合成聚合物，擁有與模板分子的尺寸、形狀和功能基團互補的印跡位點，對模板分子具有高親和力和選擇性，因其具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)利用、造價低廉等優(yōu)點，在電化學(xué)傳感領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[13～15]。已有文獻報道將分子印跡技術(shù)與電化學(xué)分析法相結(jié)合用于不同樣品中痕量MG的高選擇性測定。如Huang等[16]開發(fā)了一種分子印跡電化學(xué)發(fā)光法，用于檢測魚類樣品中的微量MG，檢出限為7.3 ng/kg。盡管MIPs在提高選擇性方面具有很好的優(yōu)勢， 但在電化學(xué)檢測中其靈敏度較低。因此，各種納米材料被用于修飾電極以提高電極的有效比表面積、電子傳遞速率和電催化活性[17]，從而提高分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測靈敏度。納米碳纖維具有穩(wěn)定性好、比表面積大、電導(dǎo)性高等優(yōu)良性能，在電化學(xué)分析中受到越來越多的關(guān)注[18，19]。尤其是以細菌纖維素為碳源制備的多孔碳納米纖維（Porous carbon nanofiber， PCNF）， 因其較強的機械強度、高孔隙率和廉價易得而備受關(guān)注，并且已被作為電極修飾材料應(yīng)用于重金屬離子的高靈敏電化學(xué)檢測[20]。
本研究以細菌纖維素為碳源制備了PCNF材料，并以其作為電極增敏材料。以MG為模板分子，鄰苯二胺為功能單體，通過電聚合法在PCNF修飾的玻碳電極上合成MG的MIPs，構(gòu)建了MG分子印跡電化學(xué)傳感器，并用于實際樣品中MG的測定。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope， TEM， 荷蘭Philips公司）; Tristar 3000比表面積分析儀（BET， 美國Micromeritics公司）; CHI660E電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）。采用三電極體系，玻碳電極（Glassy carbon electrode， GCE， 直徑為2 mm）或其修飾電極為工作電極， 鉑絲為對電極， 飽和甘汞電極為參比電極。
MG標準品（上海阿拉丁試劑有限公司）; 乙腈（色譜純，上海安譜公司）; 鄰苯二胺、K3[Fe（CN）6]（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）; 酸性Al2O3、鹽酸羥胺（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）; 其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。0.2 mol/L PBS緩沖溶液由NaH2PO4和Na2HPO4配制; 0.05 mol/L乙酸銨緩沖溶液由乙酸銨和乙酸配制; 0.2%（w/w）殼聚糖溶液由1%（V/V）乙酸溶液配制。
2.2 實驗方法
2.2.1 PCNF的制備 使用超純水將細菌纖維素洗至中性，冷凍干燥24 h。將干燥后的細菌纖維素放至管式爐中，在氮氣保護下進行程序控溫?zé)崽幚?，升溫速率?0℃/min，在800℃下碳化2 h，得到PCNF材料。
2.2.2 分子印跡電極及非印跡電極的制備
在麂皮上用0.5 μm的Al2O3粉末將玻碳電極打磨拋光，然后依次用無水乙醇、水沖洗干凈，晾干。稱取5 mg PCNF于5.0 mL 0.2%殼聚糖溶液中，超聲混勻，制得1.0 mg/mL的PCNF分散液。吸取4.0 μL PCNF分散液滴涂于處理好的玻碳電極表面，在紅外燈下烘干，即得到PCNF修飾電極（PCNF/GCE）。將PCNF/GCE置于10 mL PBS緩沖液（pH 7.0）中，此緩沖液含有1.0 mmol/L MG和4.0 mmol/L鄰苯二胺。以PCNF/GCE為工作電極，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，在0～0.8 V電壓范圍內(nèi)，以100 mV/s循環(huán)掃描20圈，形成MG印跡膜。將聚合后的電極置于80%（V/V）的甲醇-乙酸混合液中攪拌洗脫25 min，去除模板分子，即獲得MG分子印跡電化學(xué)傳感器（MIPs/PCNF/GCE）。非印跡電化學(xué)傳感器（NIPs/PCNF/GCE）按上述同樣步驟制備，但不加MG。
2.2.3 電化學(xué)測試 將印跡電極在MG溶液中孵育20 min，取出電極，用超純水沖洗電極表面，采用電化學(xué)測試。每次測試完成后將電極置于20%（V/V）的乙酸-甲醇溶液中進行洗脫25 min，再用水沖洗干凈，待繼續(xù)使用。差分脈沖伏安法（DPV）、循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗（EIS）測試采用三電極體系，在含0.10 mol/L KCl的5.0 mmol/L K3[Fe（CN）6＼]溶液中進行。DPV掃描電位為-0.2～0.6 V，電位增量為4 mV，振幅為50 mV，脈沖周期為0.5 s; EIS頻率范圍為0.1 Hz～100 kHz，振幅為5 mV。
2.2.4 樣品制備 養(yǎng)殖水樣取自肇慶市周邊的魚塘。水樣經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行電化學(xué)檢測。 草魚從肇慶當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I。魚去皮，取可食部分切片，勻漿。稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，依次加入1.5 mL 0.25 g/mL鹽酸羥胺溶液、3.5 mL 0.05 mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH 4.5），渦旋30 s。然后加入10 mL乙腈渦旋提取10 min，再加入5 g酸性Al2O3和2 g NaCl，渦旋2 min，以5000 r/min離心10 min， 收集上清液。再用10 mL乙腈重復(fù)提取殘渣，合并上清液，于40℃下氮氣吹至近干，用純凈水溶解，定容至10.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，采用本方法進行檢測。
3 結(jié)果與討論
3.1 PCNF的表征
由PCNF的透射電鏡圖（圖1A）可見，PCNF的直徑為20～80 nm，大量PCNF相互交錯形成多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這些互通的孔隙為電解質(zhì)離子提供了充足的擴散通道。N2吸脫附等溫曲線見圖1B，此N2吸脫附等溫線屬于典型的IV類曲線，在相對壓力為0.45～0.97下具有明顯的H2滯后環(huán)，說明PCNF存在介孔結(jié)構(gòu); 在較高的相對壓力（0.97）下，曲線尾部急劇上升，這是由于PCNF間形成的大孔中N2的多層吸附引起的[21]，這些大孔可在透射電鏡圖中觀察到。根據(jù)N2吸脫附等溫曲線計算得到PCNF的比表面積為687 m2/g。由圖1B插圖可知，PCNF具有窄的孔徑分布，集中在3 nm附近。
3.2 電聚合制備分子印跡膜
圖2為含MG的聚合液在PCNF/GCE表面電聚合過程的CV曲線。由CV曲線可知，鄰苯二胺的電聚合是一個不可逆的氧化過程，峰電流隨著電聚合圈數(shù)增加而顯著減小，這是由于電極表面形成了致密的不導(dǎo)電聚合膜，阻礙了電極與溶液之間的電子轉(zhuǎn)移。插圖為不加MG的鄰苯二胺電聚合的CV曲線，與電聚合制備MIPs的 CV曲線相比無明顯差異，說明MG在0～0.8 V電聚合過程中無電活性。
3.3 分子印跡傳感器的電化學(xué)表征
3.3.1 差分脈沖伏安法表征 圖3為不同電極在含有0.10 mol/L KCl的5.0 mmol/L K3[Fe（CN）6＼]溶液的DPV曲線。由圖可見，PCNF/GCE（曲線f）的[Fe（CN）6＼]3-4電流遠高于裸玻碳電極（曲線c），這是由于修飾的PCNF材料提高了電極的導(dǎo)電性及活性表面積; PCNF/GCE表面電聚合了分子印跡膜后，無明顯電流峰（曲線a），說明修飾電極表面已被致密的非導(dǎo)電聚合膜覆蓋，阻礙了[Fe（CN）6＼]3-4向電極表面擴散; 洗脫模板分子后的印跡電極出現(xiàn)了一個較大的電流峰（曲線e），是因為分子印跡膜形成大量的印跡孔穴， 使[Fe（CN）6＼]3-4可以到達電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生電流信號; 將洗脫模板分子的印跡電極重新吸附MG，其峰電流明顯下降（曲線d），原因是MG占據(jù)了部分印跡孔穴，導(dǎo)致印跡電極表面的[Fe（CN）6＼]3-4擴散通道減少。非印跡電極（曲線b）由于NIPs膜的非導(dǎo)電特性和無印跡位點而產(chǎn)生很弱的DPV電流響應(yīng)。
3.3.2 電化學(xué)阻抗表征 電化學(xué)阻抗是表征電極表面電子轉(zhuǎn)移動力學(xué)的一種有效方法。在EIS譜圖中，高頻區(qū)半圓的直徑等于電子轉(zhuǎn)移電阻Rct。圖4為不同電極的電化學(xué)阻抗圖譜，可見裸電極具有較小的電子轉(zhuǎn)移電阻（337 Ω，曲線b），而PCNF/GCE的電子轉(zhuǎn)移電阻顯著減?。?1 Ω，曲線a），說明PCNF的引入促進了電極與電解質(zhì)之間的電子傳遞; 非印跡電極（4473 Ω，曲線f）和未洗脫模板（5214 Ω，曲線e）的印跡電極由于表面覆蓋了非導(dǎo)電聚合膜，阻礙了[Fe（CN）6＼]3-4的電子傳遞，導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移電阻急劇增大; 洗脫模板分子后，印跡膜表面形成大量印跡孔穴，有利于[Fe（CN）6＼]3-4的滲透和電子轉(zhuǎn)移，印跡電極的電子轉(zhuǎn)移電阻顯著減?。?60 Ω，曲線c）; 重新吸附MG后的印跡電極的電子轉(zhuǎn)移電阻明顯增加（1956 Ω，曲線d），說明一部分印跡孔穴又被堵塞，致使電子傳遞受阻，與DPV表征結(jié)果相符。
3.3.3 循環(huán)伏安法表征 在含有0.10 mol/L KCl的5.0 mmol/L K3[Fe（CN）6＼]溶液中，洗脫模板后的MIPs/PCNF/GCE的循環(huán)伏安曲線見圖5，可見隨著掃描速率增加，峰電流逐漸增大。陽極峰電流（ipa）和陰極峰電流（ipc）與掃描速率的平方根呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為ipa=5.828v1/2+6.815（R2=0.9989）和ipc=-6.511v1/2-14.074 （R2=0.9996）， 說明[Fe（CN）6＼]3-4在MIPs/PCNF/GCE上的電化學(xué)反應(yīng)是一個擴散控制過程[22]。
3.4 實驗條件的優(yōu)化
3.4.1 PCNF涂覆量的影響 考察了玻碳電極上修飾不同用量（0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 μL）PCNF的響應(yīng)電流變化，結(jié)果表明，當(dāng)PCNF涂覆量為4.0 μL時，PCNF修飾電極上的峰電流最大，即4.0 μL為PCNF的最佳用量。
3.4.2 模板分子與功能單體摩爾比的影響
傳感器制備過程中模板分子與單體的摩爾比影響印跡膜中印跡位點的數(shù)量，進一步影響傳感器的再結(jié)合和識別性能。在含有固定濃度MG（0.10 mmol/L）和不同濃度鄰苯二胺（摩爾比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶10、1∶20和1∶40）的電聚合溶液中制備了不同的傳感器。結(jié)果表明，模板分子與單體摩爾比為1∶4的傳感器具有最大的響應(yīng)電流。當(dāng)摩爾比大于1∶4時，響應(yīng)電流較小，這是因為單體的數(shù)量太少，不能結(jié)合足夠的模板分子。而過量的單體可能占據(jù)了電極表面，使得有效的識別位點減少，因而響應(yīng)電流減小。因此，模板分子與單體的最佳摩爾比為1∶4。
3.4.3 掃描圈數(shù)的影響 電聚合掃描圈數(shù)會影響聚合膜的厚度，從而影響傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性?？疾炝瞬煌酆先?shù)的電極的性能。結(jié)果顯示，當(dāng)掃描圈數(shù)從5圈增加到20圈時，峰電流顯著增加。當(dāng)掃描圈數(shù)超過20圈時，峰電流隨掃描圈數(shù)的增加而減小，可能是形成較厚的聚合膜，導(dǎo)致位于聚合物膜中心區(qū)域的模板分子不能完全去除。選擇20圈作為最佳掃描圈數(shù)。
3.4.4 洗脫劑和洗脫時間的影響 模板分子洗脫直接影響印跡孔穴的數(shù)量，所選洗脫劑應(yīng)盡可能將模板分子洗脫下來而不破壞印跡聚合物膜的結(jié)構(gòu)?；诳兹甘G易溶于水、乙醇和甲醇，而酸能夠破壞模板分子與功能單體之間結(jié)合的氫鍵，選擇純水、無水乙醇、純甲醇、10%（V/V） HAc溶液、10%（V/V） HAc-乙醇溶液、10%（V/V） HAc-甲醇溶液、1.7 mol/L HCl溶液為洗脫劑，考察洗脫模板分子后的印跡電極的電流響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%（V/V） HAc-甲醇溶液和10%（V/V） HAc-乙醇溶液洗脫效果最好，其次是10%（V/V） HAc溶液、純甲醇、無水乙醇，再次是1.7 mol/L HCl，而純水的洗脫效果最差。由于10%（V/V） HAc-甲醇溶液稍優(yōu)于10%（V/V） HAc-乙醇溶液，因此選擇其為洗脫劑進一步優(yōu)化其配比。考察10%，20%、30%、40%、50% （V/V）的HAc-甲醇溶液洗脫模板分子的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以20%（V/V） HAc-甲醇為洗脫液，印跡電極孵化前后的電流變化值最大，隨HAc體積分數(shù)增大，電流變化值下降，可能是HAc與MG之間極易形成氫鍵，有利于模板分子洗脫，但HAc的用量過大可能破壞印跡膜的結(jié)構(gòu)，使得印跡膜的印跡效果變差。故選擇20%（V/V） HAc-甲醇溶液為洗脫液。同時考察印跡電極在20%（V/V） HAc-甲醇洗脫液中洗脫不同時間的效果。研究發(fā)現(xiàn)，隨著洗脫時間增加，峰電流不斷增大，當(dāng)洗脫時間超過25 min時，峰電流不再增大，這說明洗脫時間太短，印跡膜上的模板分子未能完全去除; 洗脫時間達到25 min時，模板分子已完全被洗脫下來; 繼續(xù)延長洗脫時間，不僅影響實驗效率，還可能破壞印跡聚合物膜的結(jié)構(gòu)。因此，選擇洗脫時間為25 min。
3.4.5 樣品溶液pH值的影響 以含10.0 nmol/L MG的0.20 mol/L磷酸鹽溶液為樣品溶液，考察印跡電極在pH 4.5～8.5的樣品溶液中孵化對孔雀石綠的選擇吸附效果。結(jié)果表明， 在pH 7.0時峰電流降至最低，說明在中性溶液中吸附效果最好。這可能因為MG的pKa=6.9，當(dāng)樣品溶液pH
3.4.6 孵化時間的影響 將洗脫模板后的印跡電極置于10.0 nmol/L MG溶液中，對孵化時間進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，峰電流隨孵化時間的延長而減小，20 min后峰電流趨于平穩(wěn)，說明模板分子與印跡電極之間達到了吸附平衡。因此，選擇孵化時間為20 min。
3.5 分子印跡傳感器的分析性能
3.5.1 線性范圍及檢出限 在最優(yōu)條件下，利用MIPs/PCNF/GCE對不同濃度的MG進行測試。如圖6所示， DPV峰電流隨MG濃度的增加而逐漸減小，在0.10～10.0 nmol/L濃度范圍內(nèi)，峰電流（μA）與MG濃度（nmol/L）呈良好的線性關(guān)系（圖6插圖），線性方程為i（μA）=3.672c（nmol/L） + 79.39（R2=0.997），檢出限為0.042 nmol/L（3S/k），其中S為空白溶液測定8次的峰電流的標準偏差，k為校準曲線斜率的絕對值。本方法的檢出限低于大多數(shù)文獻報道的電化學(xué)方法（表1），高于文獻報道的Ru（bpy）2+3電化學(xué)發(fā)光法[16]，但其使用的發(fā)光試劑Ru（bpy）2+3價格昂貴。
3.5.2 選擇性及干擾性 為了評價傳感器的選擇性，選擇結(jié)晶紫、氯霉素、洛美沙星等幾種常見的抗菌藥物作為干擾物質(zhì)。定義選擇因子[26]K=△i1/△i，
其中， △i1為空白電極產(chǎn)生的峰電流與存在干擾物質(zhì)產(chǎn)生的峰電流的差值，△i為空白電極產(chǎn)生的峰電流與存在MG產(chǎn)生的峰電流差值，K值越小，證明印跡電極對模板分子的選擇性越好。將洗脫模板分子后的印跡電極分別在10.0 nmol/L的結(jié)晶紫、氯霉素、洛美沙星中吸附5 min后，進行DPV掃描。結(jié)晶紫、氯霉素、洛美沙星的選擇因子分別為0.47、0.22和0.15。盡管結(jié)晶紫與MG的結(jié)構(gòu)相似度高，使得印跡膜上的孔穴對結(jié)晶紫產(chǎn)生吸附，產(chǎn)生一定的電流響應(yīng)，但未對MG的測定形成明顯干擾，表明印跡膜與MG的結(jié)合能力除了兩者互補的官能團決定外，印跡膜上的孔穴的空間結(jié)構(gòu)對兩者的結(jié)合作用也產(chǎn)生較大的影響。結(jié)果表明，此傳感器能夠?qū)G進行特異性識別。同時也考察NIPs/PCNF/GCE對結(jié)晶紫、氯霉素、洛美沙星的電流響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)NIPs傳感器對上述物質(zhì)響應(yīng)不靈敏，對MG無特異性識別作用。
此外，在10.0 nmol/L MG溶液中，考察了一些可能共存的生物小分子和離子對MG測定的影響。結(jié)果表明，200倍的賴氨酸和葡萄糖，500倍的Ca2+、Al3+、Mg2+、Na+、SO2-4、Cl、PO3-4對于MG的測定無顯著影響（電流信號變化小于5%），表明所構(gòu)建的傳感器具有良好的抗干擾能力。
3.5.3 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性 在相同條件下制備的5支印跡電極分別對2.0 nmol/L MG溶液進行測定，測得峰電流的相對偏差（RSD）為7.2%。同一支印跡電極平行測定6次，RSD為3.6%。將5支印跡電極保存于4℃下，10天后再對2.0 nmol/L MG溶液測定，電流響應(yīng)為初始響應(yīng)值的91%，表明此電極有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
3.6 實際樣品分析
將MIPs/PCNF/GCE用于市售新鮮草魚及養(yǎng)殖水樣中的MG檢測，草魚及養(yǎng)殖水樣中未檢出MG。對實際樣品進行了加標回收實驗。由表2可知，不同加標濃度下的回收率為82.0%～96.5%， RSD<8.0%，說明此方法對于不同基質(zhì)樣品中MG的測定具有較高的準確度和精密度，可用于實際樣品中MG的檢測。
4 結(jié) 論
構(gòu)建了一種基于PCNF的MG分子印跡電化學(xué)傳感器。在0.10～10.0 nmol/L濃度范圍內(nèi)，MIPs/PCNF/GCE對MG表現(xiàn)出良好的線性響應(yīng)，檢出限為0.042 nmol/L，低于大多數(shù)文獻報道的電化學(xué)方法。此傳感器不僅對MG具有較高的靈敏度和選擇性，而且具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，為MG提供了一種簡單、經(jīng)濟、靈敏的電化學(xué)檢測方法。將此傳感器用于檢測市售新鮮草魚及養(yǎng)殖水樣品中MG含量，結(jié)果令人滿意，有望應(yīng)用于實際樣品中MG殘留量的檢測。
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Abstract A molecularly imprinted electrochemical sensor for specific recognition of malachite green （MG） was prepared by electropolymerization of o-phenylenediamine on the surface of porous carbon nanofiber （PCNF） modified glassy carbon electrode with MG as template molecule. The electrochemical performance of the sensor was characterized by differential pulse voltammetry （DPV）， cyclic voltammetry （CV） and electrochemical impedance spectroscopy （EIS）. The experimental parameters， such as the amount of PCNF， molar ratio of template molecule to functional monomer， scan cycle of CV， eluent， elution time， pH value of sample solution and incubation time， were optimized. Under optimal conditions， the peak current was linear to MG concentration in the range of 0.10-10.0 nmol/L， with a detection limit of 0.042 nmol/L. The prepared sensor possessed excellent selectivity， reproducibility and stability， and was applied to the detection of MG in commercially available fresh grass carp and aquaculture water samples with recoveries of 82.0%-96.5%.
Keywords Molecularly imprinted electrochemical sensor; Electropolymerization; Porous carbon nanofiber; Malachite green
