趙 苗,韓雅茹,賀翼飛,付 宇,劉宇琳,習(xí)瑾昆,賀永貴
(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院, 華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 河北 唐山 063210)
心血管疾病是人類死亡的主要原因之一,死亡率遠(yuǎn)高于包括腫瘤和艾滋病在內(nèi)的其它疾病,成為了人類健康的“第一殺手”[1]。嗎啡(morphine)是阿片受體激動(dòng)劑,它常用于心肌梗死引起的心絞痛。通過各種刺激破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)積累稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。在心臟中,缺氧、缺血/再灌注、肥大、壓力超負(fù)荷和藥物誘導(dǎo)的損傷都可導(dǎo)致ERS,因而抑制ERS介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡對(duì)于改善心臟功能非常重要[2]。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)通路是ERS信號(hào)通路的重要組成部分,影響著細(xì)胞在應(yīng)激條件下的適應(yīng)和存活。有研究表明,嗎啡可減輕心肌H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[3];也有研究表明,PERK/eIF2α/ATF4途徑對(duì)間歇性缺氧細(xì)胞的保護(hù)發(fā)揮著重要作用[4]。氧化損傷可引起ERS,但是嗎啡發(fā)揮心肌保護(hù)作用是否與PERK通路有關(guān)尚未明確。因此,本研究探討嗎啡參與應(yīng)激心肌的保護(hù)機(jī)制,為心血管疾病的預(yù)防及臨床治療提供理論依據(jù)。
來源于大鼠心肌組織的H9c2細(xì)胞(ATCC)。鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司);GSK2656157(MCE);抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein, GRP)78、GRP94、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、p-GSK-3β、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和GAPDH抗體(Cell Signaling Technology);抗p-PERK抗體(Abcam);TMRE熒光染料(Life Technologies Corporation);ER-Tracker Red(Molecular Probes);小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng)通用型試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BeyoECL Plus試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。 FV 1000激光掃描共聚焦顯微鏡、BX53熒光正置顯微鏡和CKX31倒置相差顯微鏡(Olympus);550酶標(biāo)儀(Bio-Rad);電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(北京市六一儀器廠)。
2.1大鼠心肌H9c2細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱中(95%空氣+5% CO2),隔天更換培養(yǎng)基;當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶底時(shí),用0.25%胰蛋白酶根據(jù)需要進(jìn)行處理傳代。
2.2實(shí)驗(yàn)分組 觀察PERK抑制劑GSK2656157的最適濃度,實(shí)驗(yàn)分為5組:0(control)、0.5、1、2和4 μmol/L組,用Western blot法檢測p-PERK蛋白水平。確定觀察嗎啡對(duì)氧化應(yīng)激心肌的影響,實(shí)驗(yàn)分為6組:control組、H2O2組(H2O2濃度為650 μmol/L)、H2O2+morphine組(嗎啡濃度為1 μmol/L)、H2O2+morphine+GSK2656157組(GSK2656157濃度為2 μmol/L)、morphine組和GSK2656157組。
2.3免疫組化法檢測GRP78和GRP94蛋白的表達(dá) 對(duì)無菌小皿中H9c2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),在細(xì)胞密度適當(dāng)時(shí)給予細(xì)胞不同藥物處理,用PBS緩沖液將舊培養(yǎng)基沖洗干凈,并加入新的培養(yǎng)基;到達(dá)藥物作用時(shí)間后加入固定液(4%多聚甲醛)室溫30 min,PBS緩沖液沖洗殘余液體;加入0.5% Triton X-100室溫孵育20 min,用PBS緩沖液沖洗3次;隨后向視野好的細(xì)胞區(qū)域加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,室溫放置10 min;PBS緩沖液沖洗3次;隨后滴加 I 抗和 II 抗進(jìn)行處理,最后用適量現(xiàn)配的DAB顯色液顯色。
2.4Western blot法檢測蛋白表達(dá) 當(dāng)H9c2細(xì)胞在無菌小皿中生長密度達(dá)到90%~95%時(shí),根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。藥物處理完畢后,將細(xì)胞裂解提取各組蛋白并進(jìn)行定量分裝變性。各組蛋白通過電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉;孵育抗GRP78、GRP94、p-PERK(1∶500稀釋)、CHOP、p-GSK-3β、GSK-3β和GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體,放置于4 ℃過夜。第2天,孵育 II 抗(1∶2 000稀釋)室溫1 h后,ECL熒光顯色。ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析并統(tǒng)計(jì)。
2.5線粒體膜電位和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的檢測 將細(xì)胞分為6組,用PBS緩沖液沖掉共聚焦小皿中的死細(xì)胞和懸浮物,隨后臺(tái)氏液處理2 h,用線粒體的特異性熒光染料TMRE(100 nmol/L)預(yù)染細(xì)胞。在共聚焦顯微鏡下觀察TMRE紅色熒光強(qiáng)度,判斷線粒體膜電位變化,進(jìn)而了解線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP)的開放程度。觀察ER-Tracker Red熒光強(qiáng)度時(shí),倒掉共聚焦小皿中的培養(yǎng)基,用PBS緩沖液沖洗,加入1∶1 000現(xiàn)配的且37 ℃預(yù)溫育20 min后的ER-Tracker Red(1 μmol/L)工作液,37 ℃溫育15 min,在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行紅色熒光強(qiáng)度觀察。檢測線粒體膜電位最大激發(fā)波長543 nm,最大發(fā)射波長560 nm;檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最大激發(fā)波長587 nm,最大發(fā)射波長615 nm。
2.6LDH和MTT試劑盒分別檢測細(xì)胞毒性和細(xì)胞活力 將 H9c2細(xì)胞懸液接種至96孔的細(xì)胞培養(yǎng)孔板,再將孔板置于37 ℃孵箱中;在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度,到達(dá)90%左右時(shí),按照實(shí)驗(yàn)分組分別給與藥物。藥物作用完畢后分別按照LDH試劑盒和MTT試劑盒說明書進(jìn)行操作。最后,在光鏡下觀察,用570 nm酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度(A)。
實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組均值比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差(one-way ANOVA)分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
免疫組化法檢測顯示,與對(duì)照組相比,H2O2組棕黃色顆粒明顯增加,GRP78和GRP94蛋白為強(qiáng)陽性表達(dá),morphine組與對(duì)照組無顯著差異;與H2O2組相比,用嗎啡預(yù)處理后棕黃色顆粒明顯減少,提示H2O2處理會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,嗎啡能抑制此過程,見圖1。
Figure 1. The effects of morphine on the protein expression of GRP78 和 GRP94 in the H9c2 cells were detected by immunohistoche-mistry (×200).
圖1 免疫組化檢測嗎啡對(duì)H9c2心肌細(xì)胞中GRP78和GRP94蛋白表達(dá)的影響
與對(duì)照組相比,不同濃度(0.5、1、2和4 μmol/L)的PERK通路抑制劑GSK2656157均降低p-PERK的蛋白水平,并且在一定濃度范圍內(nèi),隨著抑制劑濃度的升高,抑制作用越明顯(P<0.05),見圖2。因?yàn)樵跐舛葹? μmol/L和濃度為4 μmol/L時(shí)差異較小,蛋白水平都明顯降低,且濃度為2 μmol/L對(duì)細(xì)胞損傷較小,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以2 μmol/L為作用濃度。
Figure 2. The effect ofGSK2656157 at different concentrations on the protein level of p-PERK in the H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.
圖2 不同濃度GSK2656157對(duì)H9c2心肌細(xì)胞中p-PERK蛋白水平的影響
Western blot法檢測顯示,與對(duì)照組相比,H2O2組的GRP78和GRP94蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05);嗎啡預(yù)處理可顯著降低H2O2增加的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和GRP94(P<0.05)的水平;加入PERK通路抑制劑GSK2656157后GRP78和GRP94蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05),提示嗎啡明顯抑制H2O2引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,PERK通路可能參與此過程,見圖3。
Figure 3. Western blot was used for determining the protein levels of GRP78 and GRP94 in the H9c2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖3 Western blot檢測心肌H9c2細(xì)胞中GRP78和GRP94的蛋白水平
與對(duì)照組相比,H2O2處理后心肌 H9c2細(xì)胞的p-PERK和CHOP蛋白水平明顯增加(P<0.05);用嗎啡預(yù)處理后,細(xì)胞中p-PERK和CHOP的蛋白水平明顯降低(P<0.05),說明嗎啡抑制氧化應(yīng)激引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;與H2O2+morphine組相比,采用GSK2656157處理后嗎啡進(jìn)一步抑制H2O2損傷H9c2細(xì)胞的作用,p-PERK和CHOP蛋白水平明顯降低(P<0.05),提示嗎啡可能通過抑制PERK通路參與抗氧化應(yīng)激和心肌保護(hù)作用,見圖4。
Figure 4. Western blot was used for determining the protein levels of p-PERK and CHOP in the H9c2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖4 Western blot檢測心肌H9c2細(xì)胞中p-PERK 和CHOP的蛋白水平
與對(duì)照組相比,H2O2處理使GSK-3β的磷酸化明顯減少(P<0.05);嗎啡預(yù)處理明顯抑制H2O2所引起的GSK-3β的磷酸化變化(P<0.05);而加入GSK2656157后則明顯增強(qiáng)了嗎啡的作用,GSK-3β的磷酸化明顯增加(P<0.05),提示嗎啡可能通過抑制PERK通路使GSK-3β失活保護(hù)氧化應(yīng)激作用下的心肌細(xì)胞,見圖5。
Figure 5. Western blot was used for determining the protein level of p-GSK-3β in the H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖5 Western blot檢測心肌H9c2細(xì)胞中p-GSK-3β的蛋白水平
與對(duì)照組相比,H2O2處理使TMRE和ER-Tracker Red紅色熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05),說明H2O2導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體膜電位降低,mPTP開放,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷;嗎啡預(yù)處理明顯抑制H2O2引起的熒光強(qiáng)度降低(P<0.05);GSK2656157進(jìn)一步加強(qiáng)了嗎啡的作用(P<0.05),提示嗎啡可能通過抑制PERK通路阻止mPTP開放,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷,發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用,見圖6、7。
Figure 6. The effect of morphine on mitochondrial membrane potential in oxidative stress-induced H9c2 cells (×400). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖6 嗎啡對(duì)氧化應(yīng)激下的心肌H9c2細(xì)胞線粒體膜電位的影響
Figure 7. The effect of morphine on endoplasmic reticulum in oxidative stress-induced H9c2 cells (×200). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖7 嗎啡對(duì)氧化應(yīng)激下的心肌H9c2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響
與對(duì)照組相比,H2O2處理后LDH值顯著上升,細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng),MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞活力明顯減弱(P<0.05);當(dāng)用嗎啡預(yù)處理后,H2O2處理的心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯減弱,細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(P<0.05);加入GSK2656157阻斷了PERK通路后,進(jìn)一步加強(qiáng)了嗎啡的作用(P<0.05),見圖8、9。
Figure 8. The changes of the LDH levels. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖8 各組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活性的比較
Figure 9. The effects of morphine on the viability of H9c2 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group;△P<0.05vsH2O2+morphine group.
圖9 MTT法檢測嗎啡對(duì)心肌H9c2細(xì)胞活力的影響
急性心肌梗死是人類死亡的主要原因之一,在治療過程中,血液流向缺血區(qū)的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,它會(huì)造成心肌再灌注損傷(myocardial reperfusion injury,MRI)[5];并且,當(dāng)ROS含量超過體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的閾值時(shí),會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)增多并引起ERS,影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)功能障礙[6]。嗎啡及其衍生物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué),包括腫瘤、急性心肌梗死、絞痛和分娩等[7]。有研究表明,嗎啡通過激活PKCε-ERK1/2通路保護(hù)缺血再灌注心肌[8];也有研究表明,嗎啡能夠保護(hù)缺氧/復(fù)氧心肌[3]。
ERS會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),它是一種在不利條件下細(xì)胞自我保護(hù)的基本生存機(jī)制,可進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[9]。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境刺激時(shí),GRP78和GRP94啟動(dòng)UPR,激活PERK、需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)3條經(jīng)典信號(hào)通路[10]。為了探究氧化應(yīng)激能否引起ERS以及嗎啡能否抑制此過程,我們通過免疫組化檢測了ERS早期標(biāo)志蛋白GRP78和GRP94的表達(dá),結(jié)果顯示,H2O2組GRP78和GRP94蛋白為強(qiáng)陽性表達(dá),棕黃色顆粒明顯增加,嗎啡明顯抑制此過程,說明氧化應(yīng)激導(dǎo)致ERS,嗎啡抑制氧化應(yīng)激引起的ERS。
PERK在GRP78解離時(shí)被激活,這種解離允許PERK二聚化和自磷酸化[11],形成具有活性的p-PERK。CHOP是一種促凋亡轉(zhuǎn)錄因子,被ERS激活進(jìn)而介導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡即細(xì)胞凋亡。有研究表明, 缺氧早期通過PERK通路保護(hù)機(jī)體對(duì)抗缺氧損傷,后期激活細(xì)胞凋亡通路[12];也有研究表明,肌原纖維形成調(diào)節(jié)因子1通過抑制PERK/Nrf2途徑而減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[13]。PERK通路與缺氧心肌細(xì)胞保護(hù)密切相關(guān)。GSK2656157是一種與ATP競爭的高選擇性PERK抑制劑,能夠競爭性阻止ATP結(jié)合PERK蛋白,使PERK無法進(jìn)行磷酸化,從而對(duì)該信號(hào)通路進(jìn)行有效抑制。為了探究GSK2656157的最適濃度,我們觀察不同濃度(0、0.5、1、2和4 μmol/L)GSK2656157對(duì)PERK蛋白磷酸化水平的影響,結(jié)果顯示,2 μmol/L降低明顯,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以此作為濃度。
ERS伴侶蛋白GRP78和GRP94被轉(zhuǎn)錄翻譯,在UPR中起重要作用[10]。為了檢測氧化應(yīng)激對(duì)ERS的影響,我們用H2O2制備氧化應(yīng)激模型,觀察GRP78和GRP94的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,H2O2使GRP78和GRP94的表達(dá)明顯增加,嗎啡明顯抑制此過程,GSK2656157進(jìn)一步加強(qiáng)嗎啡的作用,提示氧化應(yīng)激導(dǎo)致ERS,嗎啡明顯抑制氧化應(yīng)激引起的ERS,PERK通路可能參與此過程。
ERS可導(dǎo)致雙鏈RNA激活的PERK自磷酸化,進(jìn)一步激活CHOP,導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)合成受到抑制,并通過減弱鳥嘌呤核苷酸交換因子eIF2β限制蛋白質(zhì)流入ER腔[14]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證嗎啡是否通過抑制PERK通路發(fā)揮氧化應(yīng)激保護(hù)作用,我們檢測了PERK和CHOP蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,H2O2使p-PERK和CHOP蛋白水平明顯增加,嗎啡明顯抑制此過程,GSK2656157加強(qiáng)嗎啡的作用,進(jìn)一步說明氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致ERS,嗎啡通過抑制PERK-CHOP通路降低ERS,發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。
氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS大量積累,破壞心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)平衡, 線粒體膜電位降低,mPTP開放[15]。GSK-3β活性與多種疾病密切相關(guān),GSK-3β磷酸化(即失活)進(jìn)而阻止mPTP開放是心肌保護(hù)的關(guān)鍵[8]。我們的前期研究也證實(shí),黃芪甲苷可能通過抑制GSK-3β活性,進(jìn)而阻止mPTP開放保護(hù)心肌[16]。在我們的實(shí)驗(yàn)中,H2O2使GSK-3β磷酸化明顯減少,嗎啡明顯抑制此過程,GSK2656157進(jìn)一步加強(qiáng)了嗎啡的作用,說明嗎啡可能通過抑制PERK使GSK-3β失活保護(hù)氧化應(yīng)激的心肌細(xì)胞。
進(jìn)一步用激光共聚焦顯微鏡檢測mPTP開放程度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),結(jié)果顯示,H2O2使線粒體特異性熒光染料TMRE和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性熒光染料ER-Tracker的紅色熒光強(qiáng)度明顯減少,嗎啡明顯抑制紅色熒光強(qiáng)度的減少,GSK2656157進(jìn)一步加強(qiáng)嗎啡的作用,此結(jié)果提示,嗎啡通過抑制PERK通路阻止mPTP開放,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷,發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。
此外,我們通過LDH試劑盒檢測細(xì)胞毒性,MTT試劑盒檢測細(xì)胞活力,結(jié)果顯示,H2O2使細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng),使細(xì)胞活力明顯減弱,嗎啡明顯抑制此作用,GSK2656157進(jìn)一步加強(qiáng)嗎啡的作用,說明嗎啡能夠減輕氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞毒性,增強(qiáng)細(xì)胞活力,PERK通路參與嗎啡的心肌保護(hù)作用。
綜上所述,氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷,嗎啡可能通過抑制PERK通路降低ERS,使GSK-3β失活進(jìn)而阻止mPTP的開放,從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。嗎啡的心肌保護(hù)作用與“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體”對(duì)話機(jī)制密切相關(guān),其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探索。