水稻清蛋白電泳鑒定方法及應(yīng)用

蘭靜 賈雯靖 孫向東 趙琳 金海濤 王冰 張瑞英

摘要?對(duì)清蛋白提取方法進(jìn)行優(yōu)化，建立水稻清蛋白電泳新方法。采用優(yōu)化后清蛋白電泳方法進(jìn)行譜帶分析，發(fā)現(xiàn)蛋白含量相近、食味評(píng)分不同的水稻品種，70～105 kDa處譜帶缺失或譜帶濃度加強(qiáng)。初步確認(rèn)105 kDa是與稻米食味相關(guān)的譜帶，譜帶顏色越深，稻米食味品質(zhì)越好。

關(guān)鍵詞?水稻;清蛋白;電泳;食味品質(zhì)

中圖分類號(hào)?S?511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0176-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.053

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Method and Application of Rice Albumin Electrophoresis Identification

LAN Jing1，2，JIA Wen?jing1，2，SUN Xiang?dong1，2 et al

（1.Quality and Safety Institute of Agricultural Products， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro?products （Harbin）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Harbin， Heilongjiang 150086）

Abstract?The aim is to optimize the extraction method of albumin and establish a new method of rice albumin electrophoresis. It was found that forrice from different sources， a loss or enhancement of band indensity at 70-105 kDa with similar protein content whereas different sensory evaluation scores by using the improved spectral band analysis of albumin electrophoresis method. It was preliminarily confirmed that 105 kDa is the band associated with rice sensory quality. The denser the band， the better the taste quality of rice.

Key words?Rice;Albumin;Electrophoresis;Taste quality

水稻品種的品質(zhì)性狀是育種工作的重要目標(biāo)，早期品質(zhì)選擇方法的實(shí)用性與合理性是育種者關(guān)心的重要問題。水稻食味品質(zhì)是水稻品質(zhì)育種的終極目標(biāo)[1-2]，在水稻早期世代材料篩選上一直是盲區(qū)，沒有較好的評(píng)價(jià)技術(shù)。蛋白質(zhì)作為稻米品質(zhì)的主要性狀，是稻米品質(zhì)改良不可忽視的重要方面。關(guān)于蛋白質(zhì)與稻米品質(zhì)之間的關(guān)系，國內(nèi)外已有的報(bào)道主要集中在表觀蛋白質(zhì)含量與食味品質(zhì)之間的關(guān)系變化上[3]。通常稻米蛋白質(zhì)含量越高其食味值越低[4-5]，而對(duì)于蛋白質(zhì)含量接近的稻米其食味值有的相差較大，需從蛋白質(zhì)組分、結(jié)構(gòu)方面加以闡述。

水稻蛋白質(zhì)中的貯藏蛋白質(zhì)是水稻的第二大營養(yǎng)成分，含量占5.5%～12.0%。稻米中的蛋白質(zhì)根據(jù)其在不同溶劑中的溶解性不同可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[6]。貯藏蛋白在稻米中分布不均，清蛋白主要分布在糊粉層和次糊粉層。研究表明，清蛋白占水稻總貯藏蛋白的2%～5%[7-9]，是與食味品質(zhì)相關(guān)的蛋白。目前有關(guān)清蛋白的研究報(bào)道甚少[10]，而關(guān)于清蛋白電泳技術(shù)鮮見報(bào)道。將水稻食味品質(zhì)蛋白質(zhì)電泳評(píng)價(jià)技術(shù)用于水稻早期世代材料篩選，對(duì)于縮短育種年限、加快水稻育種進(jìn)程、提高水稻育種效率具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?水稻品種來源。

粗蛋白質(zhì)含量接近、食味評(píng)分不同的水稻品種龍粳香1號(hào)、長粒香2號(hào)、墾粳12、龍粳29、五優(yōu)稻、高粱稻來源見表1，其中長粒香2號(hào)分別來源于同江市和富錦市。不同來源水稻品種粗蛋白質(zhì)含量7.76%～7.91%，食味評(píng)分71.0～90.0。

1.1.2?化學(xué)試劑。

所有試劑都是國產(chǎn)或進(jìn)口分析純，用蒸餾水配制有關(guān)溶液，電泳儀和電泳槽型號(hào)為BIO-RAD Power Pac，產(chǎn)地新加坡。

1.2?方法

1.2.1?大米粉制備和清蛋白提取。

稻米經(jīng)自然風(fēng)干后，每個(gè)稻米樣品稱取100 g，先用糙米機(jī)碾成糙米，再將糙米通過精米機(jī)碾成精米。精米經(jīng)磨粉機(jī)碾磨成粉，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

清蛋白提取參考楊靜等[5]、馬建等[10]方法并進(jìn)行優(yōu)化。提取清蛋白的溶劑為蒸餾水，大米粉與蒸餾水的固液比為1∶1（g∶mL），搖床振蕩提取2 h，15 000 r/min，離心5 min，取上清于2 mL離心管內(nèi)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?凝膠配制。

1.2.2.1?分離膠的配制。

（1）取27.23 g Trizma base 溶解于80 mL蒸餾水中，鹽酸調(diào)pH至8.8，蒸餾水定容至150 mL。

（2）量取步驟（1）中的溶液25 mL，加入40 mL 30% MonomerSoln，1 mL 10%SDS，33.5 mL蒸餾水，混勻4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）量取步驟（2）中的溶液9.95 mL，加入50 μL 10% 過硫酸銨，5 μL TEMED，混勻，灌入膠板中，上層加入蒸餾水封口，等待分離膠凝固。

1.2.2.2?濃縮膠的配制。

（1）將6.0 gTrizma base 溶解于60 mL蒸餾水中，鹽酸調(diào)pH至6.8，蒸餾水定容至100 mL。

（2）量取步驟（1）中的溶液25 mL，加入13 mL 30% MonomerSoln，0.5 mL 10%SDS，61 mL蒸餾水，混勻4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）量取步驟（2）中的溶液10 mL，加入50 μL 10% 過硫酸銨，10 μL TEMED，混勻，待分離膠凝固，倒出表面的水層，將配制好的濃縮膠灌入膠板中，然后插入梳子，等待凝固。

1.2.3?電泳。

蛋白提取液的配制：0.125 mol/LTris-HCl，pH=6.8，4%SDS，20%甘油，4 mol/L尿素，5% 巰基乙醇。

清蛋白進(jìn)樣量10 μL。電泳開始時(shí)，恒定電壓為100 V，當(dāng)樣品到達(dá)分離膠時(shí)，降低電壓恒定至80 V，電泳2.5 h。

1.2.4?蛋白固定。

電泳結(jié)束，取出凝膠，將凝膠浸入40 mL 10%三氯乙酸中，搖床振蕩固定蛋白，過夜固定。

1.2.5?染色與脫色。

凝膠置于40 mL考馬斯亮藍(lán)R-250溶液中，搖床染色2 h，然后在冰乙酸∶甲醇∶水（10∶45∶45）溶液中脫色。

2?結(jié)果與分析

2.1?水稻清蛋白電泳方法優(yōu)化

2.1.1?方法一。

稱取0.1 g精米粉于2 mL離心管內(nèi)，加入1 mL蒸餾水，于搖床上振蕩提取2 h，室溫下10 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL刻度試管中，重復(fù)提取3次合并提取液，即為清蛋白溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆肹5]。

2.1.2?方法二（改進(jìn)方法）。

稱取1 g精米粉于2 mL離心管內(nèi)，加入1 mL蒸餾水，攪拌至均勻，浸提1 h，室溫下15 000 r/min離心5 min。取上清液（清蛋白溶液）于2 mL離心管內(nèi)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3?2種方法比較。

改進(jìn)的水稻清蛋白提取方法，稻米經(jīng)自然風(fēng)干后研磨成大米粉，向大米粉中按固液比1∶1加入水，攪拌至均勻，浸提1 h后離心，取上清，即為水稻清蛋白提取液。浸提后室溫下15 000 r/min離心5 min，較方法一離心力大，清蛋白提取效果更徹底。

由圖1可知，方法一得到的清蛋白電泳圖譜幾乎看不見譜帶（A）;而方法二得到的清蛋白圖譜中譜帶清晰可見（B），且方法二在2個(gè)水稻品種中的提取效果基本相同，說明該方法具有廣泛適用性，穩(wěn)定性好。

2.2?蛋白質(zhì)含量相近的大米樣品清蛋白電泳差異分析

對(duì)蛋白質(zhì)含量接近、食味評(píng)分相差較大的7個(gè)樣品進(jìn)行清蛋白電泳圖譜分析。從圖2可以看出，龍粳香1號(hào)水稻樣品譜帶與其他樣品譜帶不同，在70～105 kDa處出現(xiàn)了譜帶的缺失;在105 kDa處，長粒香2號(hào)樣品也出現(xiàn)了譜帶的缺失。由表1可知，這2個(gè)樣品的食味評(píng)分很低。譜帶顏色較深的高粱稻，其食味評(píng)分最高。龍粳29和五優(yōu)稻的譜帶顏色次之，其食味評(píng)分也對(duì)應(yīng)下降。

3?討論

目前對(duì)水稻清蛋白電泳方法研究較少，利用該方法對(duì)水稻食味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)鮮見報(bào)道。采用該研究提供的水稻清蛋白提取方法，提取的清蛋白更加充分，清蛋白提取率提高，且得到的電泳圖譜更加清晰，適合于不同來源的水稻品種的鑒定，對(duì)指導(dǎo)水稻品質(zhì)育種具有重要意義。

現(xiàn)有研究表明，水稻表觀蛋白質(zhì)含量越低，米飯食味值越高。對(duì)于表觀蛋白質(zhì)含量相近、食味值差異較大的水稻品種，通過清蛋白電泳圖譜分析，初步發(fā)現(xiàn)105 kDa處譜帶缺失，米飯食味值較低;105 kDa處譜帶顏色越深，其米飯食味值越高。105 kDa為水稻食味優(yōu)質(zhì)亞基。該研究首次將水稻清蛋白電泳技術(shù)應(yīng)用于稻米食味品質(zhì)評(píng)價(jià)中，從蛋白質(zhì)組分結(jié)構(gòu)方面對(duì)稻米食味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)更加科學(xué)。

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