ATP1A1基因在腫瘤中的功能及治療應(yīng)用研究進展

馮曉異，李蓉濤

1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；2云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500

2018年世界衛(wèi)生組織對腫瘤流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球已面臨老齡化及惡性腫瘤發(fā)病率逐年上升的問題[1]，人口老齡化指數(shù)越高的國家癌癥發(fā)病率越高，肺癌依舊是發(fā)病率(11.6%)和死亡率(18.4%)第一的惡性腫瘤。消化系統(tǒng)腫瘤，如結(jié)腸癌(9.2%)、胃癌(8.2%)、肝癌(8.2%)等位居全球惡性腫瘤發(fā)生率第五位，死因第三位，已成為嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病之一。我國是全球癌癥發(fā)病率(21%)和死亡率(24%)最高的國家。不同的癌癥雖然病因及癥狀存在差異，但臨床和病理組織觀察均表現(xiàn)出pH梯度失調(diào)、代謝紊亂、腫瘤細(xì)胞迅速生長及轉(zhuǎn)移的特征[2]。

Na+/K+-ATPase(NKA)是鑲嵌在細(xì)胞膜磷脂雙分子層之間的一種通道蛋白，具有ATPase活性，每消耗一分子ATP可將3個Na+泵出而泵入2個K+，以保持細(xì)胞高鉀狀態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓、膜電位穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生動作電位，促進系統(tǒng)體液平衡[3-7]。NKA由4個α、3個β亞單位及γ亞型組成[8-10]，α亞基有α1、α2、α3、α4亞型，相對分子量110～130kDa，包括ATP、CTS、Na+、K+等配體的結(jié)合位點。α亞基的N端和C端均位于胞內(nèi)，通過10個跨膜螺旋區(qū)定位于質(zhì)膜上[11](圖1)，α亞基在不同組織中特異性表達(dá)，其中α1亞型(ATP1A1)在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，α2、α3亞型主要表達(dá)于神經(jīng)組織、心肌細(xì)胞等，α4亞型主要在睪丸中表達(dá)。α1亞基是一個具有Mg2+、ATP、Na+、K+和哇巴因結(jié)合位點的催化亞基；β亞基為調(diào)節(jié)性糖蛋白，在α亞基的合成、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運中起著重要作用；γ亞基屬于相對分子質(zhì)量為6.5～10 kDa的單次跨膜FXYD蛋白家族，可通過與α羧基末端相互作用，調(diào)節(jié)NKA與底物的親和力[12]。近期研究發(fā)現(xiàn)[13]，NKA基因的某些突變可能會比離子泵功能失活引起更大的生理擾動，這種生理擾動可能是通過使離子通道泄漏、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定或錯誤折疊等方式產(chǎn)生。

圖1 Na+/K+-ATPase結(jié)構(gòu)與α-亞單位結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The general structure of Na+/K+-ATPase and alpha subunits注：α亞基上具有用于離子傳輸?shù)拇呋?A，P和N結(jié)構(gòu)域)；A：執(zhí)行結(jié)構(gòu)域；P：磷酸化結(jié)構(gòu)域；N：核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Note:The α-subunit carries all the catalytically domains (Domain A,P,and N) for ion transport;A:Actuator domain;P:Phosphorylation domain;N:Nucleotide binding domain.

NKA在主動轉(zhuǎn)運、能量代謝、信號傳遞等方面都發(fā)揮著重要作用[14-17]，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用主要歸因于α亞基[18]。在各種腫瘤中ATP1A1的表達(dá)具有顯著差異性[5,19,20]，調(diào)節(jié)ATP1A1基因的表達(dá)對抑制腫瘤進展具有積極的作用。本文就ATP1A1基因在不同腫瘤中的表達(dá)情況、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及目前以ATP1A1為靶點的治療應(yīng)用進行綜述，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 ATP1A1基因在腫瘤中的表達(dá)差異性

缺氧是腫瘤微環(huán)境的主要特征之一，NKA活性降低加重腫瘤組織缺氧程度并參與維持癌細(xì)胞異常的pH梯度[21,22]，缺氧和細(xì)胞外酸化又使NKA離子泵活性進一步降低。研究發(fā)現(xiàn)，ATP1A1在多種癌細(xì)胞中過表達(dá)，如乳腺癌[23]、肺癌[24,25]、肝癌[26]、膠質(zhì)瘤[27]等。其中乳腺癌患者ATP1A1過表達(dá)與乳腺癌患者生存率低密切相關(guān)。相對于ATP1A1過表達(dá)的乳腺癌患者，ATP1A1低表達(dá)的乳腺癌患者具有更長的生存期，抑制ATP1A1的表達(dá)具有抑制腫瘤生長，延長乳腺癌患者生存期的作用[23]。Mijatovic等[24]對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的臨床樣本研究顯示，66%的樣品中α1亞基過表達(dá)，α2和α3亞基在正常肺組織和NSCLCs中表達(dá)無差異，提示NKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的失調(diào)主要因α1亞基的表達(dá)改變所導(dǎo)致。沉默或抑制ATP1A1基因的表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是復(fù)發(fā)率和死亡率最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，ATP1A1-siRNA的轉(zhuǎn)染實驗證實[28]，鈉泵抑制劑在治療人腦膠質(zhì)瘤中具有積極作用，抑制ATP1A1可能是人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在治療方法。

與之相反，在某些腫瘤中ATP1A1基因呈現(xiàn)低表達(dá)現(xiàn)象，如結(jié)直腸癌[10,29]、前列腺癌[30]、腎癌[31]等。Sakai等[10]發(fā)現(xiàn)與正常粘膜細(xì)胞相比，結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中NKA活性顯著降低，α1亞基表達(dá)下降，α3亞基表達(dá)水平升高，提示ATP1A1表達(dá)的減少和α3亞基的增加可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。這一結(jié)論在de Souza等[29]的研究中也得到證實，并發(fā)現(xiàn)NKAα1和β1亞基下調(diào)和ERK 1/2激活是相互關(guān)聯(lián)的，這種關(guān)聯(lián)引起了直腸癌細(xì)胞粘附性的喪失，而這種細(xì)胞粘附性的降低對直腸癌的發(fā)展起到關(guān)鍵作用。在前列腺癌的研究中[30]發(fā)現(xiàn)，正常前列腺和前列腺增生上皮細(xì)胞中α1亞型豐富，但晚期癌細(xì)胞中α1亞型卻明顯降低，說明ATP1A1表達(dá)的減少可能與前列腺的發(fā)展有關(guān)。同樣，在腎癌細(xì)胞中[31]ATP1A1基因表達(dá)高低與腎癌(RCC)患者的生存情況也有相關(guān)性，ATP1A1低表達(dá)與RCC的生存期短相關(guān)，提高ATP1A1的表達(dá)具有明顯延長RCC患者生存時間的作用[32,33]。

ATP1A1基因的異常表達(dá)廣泛存在于各種腫瘤細(xì)胞中，其表達(dá)水平的高低與患者生存期長短相關(guān)，而在不同類型的腫瘤中ATP1A1基因表達(dá)體現(xiàn)出了細(xì)胞之間的差異性，這種表達(dá)的差異性與腫瘤類型的關(guān)系，以及其發(fā)生機制及意義尚未闡釋，值得進一步深入的研究[34]。

2 ATP1A1參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制

NKA是質(zhì)膜上一種廣泛表達(dá)的膜蛋白，但只有約30%的質(zhì)膜NKA行使離子泵功能，大部分NKA參與了依賴于酪氨酸激酶(Src)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中α亞基為主要參與者[35]。α1亞基第二個胞漿結(jié)構(gòu)域(CD2)與Src激酶結(jié)構(gòu)域(SH2)相結(jié)合，穩(wěn)定Src激酶處于無活性狀態(tài)，α1亞基的任何改變，都將打破這一穩(wěn)態(tài)，從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而其他α亞基均無此功能[35-37]，因此，NKA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能主要歸因于α1亞基。

2.1 NKAα1亞基介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

每個正常組織的上皮細(xì)胞約表達(dá)一百萬個α1亞基，數(shù)量大概是Src的五倍。因此，α1亞基至少可以通過兩種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞活性：首先，可以結(jié)合并保持Src處于非活化狀態(tài)。當(dāng)敲除一個拷貝的ATP1A1基因會導(dǎo)致α1亞基的表達(dá)降低20%～30%，致使Src和ERK活性提高至少1倍[38]；其次，Na+/K+-ATPase-Src復(fù)合物上有強心類固醇激素結(jié)合位點，可調(diào)節(jié)細(xì)胞信號[39]。ATP1A1與Src的相互作用存在著爭議，據(jù)報道，Src可以與NKA亞基的胞內(nèi)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)和細(xì)胞功能[40]。相反，也有報道稱ATP1A1通過與Src結(jié)合而抑制Src活化[41]。

當(dāng)ATP1A1基因減少或類固醇激素與α亞基結(jié)合，破壞了Src穩(wěn)態(tài)，Src發(fā)生418位點的自磷酸化而被激活，激活的Src可與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合，啟動激酶級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、Ras/Raf/ERK、ERK1/2和PLC/PKC的隨后激活；同時可以促使線粒體產(chǎn)生大量的ROS，調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度，激活第二信使[42]，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[43](圖2)。無論Src活性升高還是降低，與α1亞基相互作用的改變，都會改變Src信號傳導(dǎo)，最終影響細(xì)胞的增殖和代謝。

圖2 依賴Na+/K+-ATPaseα1介導(dǎo)的Src激酶信號通路在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的調(diào)節(jié)示意圖Fig.2 Schematic diagrams of α1 Na+/K+-ATPase-mediated Src regulation in normal and cancer cells

2.1.1 PI3K信號通路

PI3K信號通路通過激活蛋白激酶B(Akt)將信號傳遞到下游不同的靶點，包括mTOR的激活(影響p70或4EBP1的轉(zhuǎn)錄)，從而在細(xì)胞增殖、存活、遷移、自噬、血管新生等眾多生理過程發(fā)揮作用。PI3K/AKT途徑是控制細(xì)胞增殖、存活的主要途徑之一，也是經(jīng)典Ras通路之一。當(dāng)Ras介導(dǎo)的AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制時，PI3K途徑被ATP1A1激活，調(diào)控細(xì)胞增殖和生長，用特定的Src抑制劑治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞時可顯著抑制癌細(xì)胞的遷移和增殖[44]。研究證實，敲除ATP1A1可以降低Src激酶Tyr416的磷酸化，導(dǎo)致Src活性受到抑制[45]，從而進一步抑制基于Src活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。ATP1A1基因過表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，敲除ATP1A1基因可在不影響Akt表達(dá)水平的條件下，抑制Akt蛋白的磷酸化，負(fù)調(diào)控PI3K-Akt-mTOR通路，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[43]，調(diào)節(jié)NKA在質(zhì)膜上的密度及分布。

2.1.2 MAPK信號通路

MAPK超家族包括3個亞家族，即MAPK/JNK、p38MAPK及ERK1/2。Snhematorova等[46]對MAPK信號通路在巴頓病的分子機制研究中發(fā)現(xiàn)，由于ATP1A1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的錯誤折疊導(dǎo)致Src激酶活性的失調(diào)，發(fā)生自發(fā)性和重復(fù)激活，而激活的EGFR，隨后導(dǎo)致MAPK的級聯(lián)。ERK 1/2活化可增加細(xì)胞cyclinDl蛋白活性和基因表達(dá)，cyclinDl蛋白是G1向S期轉(zhuǎn)換的正性調(diào)控因子，cyclinDl的過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[47]，ERK 1/2的激活可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的大量增殖。在ATP1A1基因低表達(dá)的腎癌細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染ATP1A1表達(dá)質(zhì)粒，腎癌細(xì)胞中磷酸化的MEK和ERK蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)量顯著降低(約為50%)。這說明對于低表達(dá)ATP1A1基因的癌細(xì)胞來說，提高ATP1A1基因表達(dá)或抑制NKA離子泵活性均可以起到抑制Raf/MEK/ERK活化的作用，從而抑制細(xì)胞增殖及分化[28,30]。

2.1.3 PKC信號通路

PKC是腫瘤細(xì)胞活化的重要信號分子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤生成等過程[48]。為了探討PKC與NKA活性的關(guān)系，研究者[49]采用PKC抑制劑處理腎癌細(xì)胞(Caco2)，發(fā)現(xiàn)PKC通路被抑制的同時NKA活性顯著降低。Sottejeau等[48]的研究表明，ATP1A1亞基參與了PKC介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)，PKC調(diào)節(jié)NKA進出質(zhì)膜的循環(huán)，PKC的激活可影響網(wǎng)格蛋白所介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，從而影響NKA在質(zhì)膜中的分布，調(diào)節(jié)NKA的活性。研究證實,NKAα1亞基16位和23位絲氨酸的磷酸化是PKC活化NKA的活化位點，NKA的活化繼而又使PKC進一步激活[50]。

2.2 NKA α1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞

細(xì)胞內(nèi)吞是細(xì)胞與外界物質(zhì)交流至關(guān)重要的過程，包括網(wǎng)格蛋白和非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，涉及到細(xì)胞極性、遷移、分裂等[51]。EGFR是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體，激活的Src與EGFR結(jié)合，導(dǎo)致EGFR的反式激活，誘導(dǎo)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞。Lingemann等[52]最新研究發(fā)現(xiàn)，肺合胞病毒(RSV)感染與ATP1A1信號激活密切相關(guān)，ATP1A1的激活導(dǎo)致EGFR的反式激活，誘發(fā)肌動蛋白重排和質(zhì)膜皺褶，膜的延伸將RSV吞噬到囊泡中，RSV以包膜的形式進入宿主細(xì)胞，其機制不依賴病毒轉(zhuǎn)錄和基因組或病毒復(fù)制。降低ATP1A1基因的表達(dá)，抑制Src-EGFR信號的激活，可顯著降低RSV感染效率(圖3)。

圖3 ATP1A1依賴性RSV進入細(xì)胞的模式圖Fig.3 Proposed model of ATP1A1-dependent macropinocytic entry of RSV

3 ATP1A1基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系

NKAα1亞基參與的上述細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，涉及到了細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、腫瘤形成等過程[53,54]。對于ATP1A1過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，α1亞基在細(xì)胞膜上的分布顯著提高，ATP1A1的敲除或沉默可以減少Src激酶級聯(lián)激活，下調(diào)Akt和ERK1/2磷酸化，從而有效抑制細(xì)胞的增殖和生長。將人類肝癌細(xì)胞的ATP1A1基因沉默或抑制的實驗結(jié)果顯示，抑制cyclin依賴性激酶2(CDK2)的表達(dá)，細(xì)胞產(chǎn)生S期阻滯，細(xì)胞的增殖能力和遷移能力降低，同時細(xì)胞內(nèi)Ca2+和ROS的增加，而過度產(chǎn)生的 ROS 導(dǎo)致 DNA 的氧化損傷，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[28]。因此，對ATP1A1過表達(dá)的腫瘤來說，抑制ATP1A1基因的表達(dá)，具有延長生存期的作用[55]。

對于ATP1A1低表達(dá)的腫瘤，NKA離子泵功能降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H+與細(xì)胞外部的Na+跨膜交換減少，胞外pH降低，呈現(xiàn)弱酸性。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ATP1A1陽性的腎癌患者比ATP1A1陰性的患者有更長的生存時間。外源ATP1A1基因的引入可增加線粒體ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致DNA損傷，抑制腎癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[32]。在前列腺癌中NKA下調(diào)降低了離子泵的活性，及Src相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，α1亞基類似多肽pNaKtide的導(dǎo)入，可以降低Src激酶活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻止體內(nèi)癌細(xì)胞增殖[17]。

可見α1亞基在不同腫瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)與其所行使的功能，存在著復(fù)雜的聯(lián)系，正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞的NKA活性不同，可能是由于腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜NKA的密度改變以及同工酶表達(dá)的差異所致。這種轉(zhuǎn)變的分子機制尚不清楚，是一個值得進一步研究的課題。

4 以ATP1A1為靶點的藥物開發(fā)及臨床應(yīng)用

α1亞基在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和NKA活性調(diào)節(jié)中所表現(xiàn)出來的雙重作用，為以ATP1A1為靶點的藥物研究與開發(fā)提供了依據(jù)。脊椎動物體內(nèi)可產(chǎn)生內(nèi)源性強心劑類固醇[18]，如哇巴因，但在生理條件下含量很低，故其濃度變化不會導(dǎo)致離子濃度的擾動，但可以引發(fā)信號級聯(lián)[56]。強心苷類物質(zhì)[57]通過抑制NKA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮作用，如誘發(fā)自噬、促進細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮抗癌作用[58]。低濃度的強心苷，包括哇巴因，地高辛和洋地黃毒苷，可以在不影響NKA活性的情況下阻斷癌細(xì)胞的生長，通過體積調(diào)節(jié)陰離子通道(volume-regulated anion channel，VRAC)和NKA之間的相互作用介導(dǎo)強心苷誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，刺激活性氧的產(chǎn)生，激活VRAC，VRAC電流增強，并伴隨著癌細(xì)胞增殖的減少[59]。Lan等[60]對華蟾素的主要成分蟾毒靈抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究顯示，蟾蜍靈可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，并引發(fā)DNA損傷，通過激活泛素-蛋白酶體信號通路顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中ATP1A1的表達(dá)，促進ATP1A1蛋白的降解，并顯著抑制腫瘤的生長，進一步證實了ATP1A1在人膠質(zhì)瘤抗癌作用中的關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)的ATP1A1和p53信號介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑的療法可能是人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在治療方法。目前多種NKA抑制劑已開展臨床研究(表1)，其中地高辛(digoxin)、安維澤爾(anvirzel)和華蟾素等藥物的I和II期臨床試驗結(jié)果顯示，單獨或與其他抗癌劑的聯(lián)合使用，NKA抑制劑均具有良好的安全性，但療效有限，需要進一步推進隨機臨床試驗以證實強心苷類物質(zhì)治療癌癥的有效性和安全性。尋找或開發(fā)具有NKA調(diào)節(jié)活性的抗癌藥物也值得深入研究。

表1 Na+/K+-ATPase抑制劑抗癌作用的臨床研究Table 1 Clinical study of anti-cancer effect of Na+/K+-ATPase inhibitor

續(xù)表1(Continued Tab.1)

ATP1A1基因在不同腫瘤中表達(dá)具有顯著性差異，作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要參與者，闡釋其發(fā)生機制及意義對開發(fā)具有NKA調(diào)節(jié)功能的抗腫瘤藥物具有重要的意義。近些年許多國內(nèi)外學(xué)者通過敲除或沉默ATP1A1對其抗癌活性機制進行了大量研究，但其作用機制復(fù)雜，涉及到不同腫瘤中ATP1A1基因表達(dá)的特異性，且目前關(guān)于ATP1A1在穩(wěn)定Src和激活Src方面存在爭議。因此，在今后的研究中，需要進一步闡釋ATP1A1基因表達(dá)特異性在腫瘤中的發(fā)生機制，構(gòu)建腫瘤模型以闡釋α1-Src相互作用的確切機制和直接證據(jù)。