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    老翹的化學(xué)成分研究

    2020-02-02 01:22:52陳夢瑩韓晶晶李曉婭
    天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2020年12期

    陳夢瑩,李 欽,韓晶晶,李曉婭,張 峰

    河南大學(xué)藥學(xué)院,開封 475004

    連翹為木犀科連翹屬植物連翹(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl)的干燥成熟果實(shí)[1]。早在《本草圖經(jīng)》中就有記載,其味苦,性微寒,歸肺、心、小腸經(jīng),具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效,常用于風(fēng)熱感冒、溫病初起、溫?zé)崛霠I、高熱煩渴、熱淋尿閉、癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒和腫毒等癥。連翹主要分布于我國山西、陜西、山東、安徽西部、河南等地。連翹的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油,連翹苷,木脂素類為主。連翹又根據(jù)其果實(shí)成熟程度,可分為青翹和老翹[2],目前有關(guān)青翹和老翹中化學(xué)成分研究相對(duì)較少。因此,為了細(xì)分連翹化合物成分研究,本次實(shí)驗(yàn)對(duì)老翹進(jìn)行了化合物的提取與分離工作[3]以及抗腫瘤活性篩選,豐富了其化合物的種類。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與材料

    搖擺式高速萬能粉碎機(jī)(林大機(jī)械有限公司);JHBE-100A閃式提取器(智晶生物);LC-6AD高效液相色譜儀-制備型(日本,島津);飛行質(zhì)譜檢測儀(日本);Bruker Avance AV-500/300 型核磁共振儀(德國布魯克公司);Sephadex LH-20凝膠(Pharmacia公司);柱色譜硅膠、薄層色譜硅膠板(青島海洋化工有限公司);甲醇、乙腈(江蘇漢邦科技有限公司,色譜純);其余化學(xué)試劑均為分析純;HCT-116(人結(jié)直腸癌細(xì)胞株)、A549(人肺腺癌細(xì)胞株)購自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。

    老翹(河南佐今明藥業(yè)有限公司,批號(hào)20171209,產(chǎn)地為河南新鄉(xiāng)),經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院袁王俊副教授鑒定。

    1.2 提取與分離

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)老翹9 550 g,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后按料液比(1∶10),50%乙醇經(jīng)閃式提取器提取,提取時(shí)間每次4 min(1檔2 min,2檔1 min,三檔1 min),閃式提取重復(fù)三次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮,合并濾液,濃縮至1 L,分別用石油醚,乙酸乙酯,正丁醇進(jìn)行分次萃取,對(duì)萃取液進(jìn)行減壓濃縮得到干浸膏,最終干燥稱重得到石油醚部位(浸膏約322.78 g)、乙酸乙酯部位(451.72 g)、正丁醇部位(1 500 g),剩余為水相部位。

    然后通過對(duì)正丁醇部位進(jìn)行提取分離。正丁醇部位:取600 g用D101大孔吸附樹脂進(jìn)行(10%、30%、50%、95%乙醇)梯度洗脫,經(jīng)TLC檢測合并,得到4個(gè)流分Frs.1~4。又對(duì)流分Fr.2(150 g)用二氯甲烷∶甲醇系統(tǒng)(10∶1)洗脫系統(tǒng)經(jīng)硅膠柱進(jìn)行梯度分離,在(10∶1)中直接分離得到了化合物9(28 mg)、13(9 mg)。10∶1比例中TLC檢測合并相同流分得到3個(gè)流分Frs.1~3。在Frs.2(50 g)中又用ODS柱層析,洗脫劑采用甲醇∶水系統(tǒng),梯度洗脫比例為10%、20%、40%、60%甲醇水比例,其中在20%甲醇水進(jìn)行洗脫時(shí)分離得到化合物純品為化合物1(168 mg)、2(83 mg),40%甲醇水進(jìn)行洗脫時(shí)分離得到化合物3(131 mg)、4(8 mg)。后經(jīng)制備型HPLC(液相條件:0~60 min,水-乙腈40∶60,流速:3 mL/min),得到化合物5(62 mg)、6(39 mg)、7(46 mg)、8(10 mg)。在二氯甲烷∶甲醇系統(tǒng)(5∶1)經(jīng)硅膠柱進(jìn)行梯度分離中經(jīng)TLC檢測合并,得到6個(gè)流分Frs.1~6。流分Fr.3(61 g)經(jīng)制備型HPLC(液相條件:0~60 min,水-乙腈40∶60,流速:3 mL/min),得到化合物10(44 mg)、11(21 mg)、12(11 mg),F(xiàn)r.6(83 g)中又用ODS柱層析,洗脫劑采用甲醇-水系統(tǒng),梯度洗脫比例為10%、20%、40%、60%甲醇水比例,其中在20%甲醇水進(jìn)行洗脫時(shí)分離得到化合物14(24 mg)、15(51 mg)、16(11 mg)、17(34 mg)。

    1.3 MTT法檢測細(xì)胞的增殖抑制率

    取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×105/mL將細(xì)胞懸液接種到96孔板中,90 μL/孔,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱下培養(yǎng)12 h,使細(xì)胞穩(wěn)定。設(shè)定空白組、陽性對(duì)照組(紫杉醇),實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的藥物(200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μg/mL)分別加入96孔板中,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在避光條件下每孔給予10 μL MTT(5 mg/mL),繼續(xù)置于37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱中,4 h后,每孔加入100 μL DMSO,置搖床上震蕩直至MTT反應(yīng)的紫色結(jié)晶體產(chǎn)物甲瓚全部溶解。置于多功能酶標(biāo)儀中,設(shè)置570 nm的波長下檢測吸光度OD值,讀出OD值帶入公式中,求得細(xì)胞抑制率,并計(jì)算IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    細(xì)胞抑制率=[(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組

    平均OD值)/對(duì)照組平均OD值]×100%

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1白色粉末;分子式C16H24O10;ESI-MS:m/z376 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.43(1H,s,H-3),5.15(1H,d,J= 5.3 Hz,H-1),5.05(1H,d,J= 7.2 Hz,H-1′),3.66(1H,dd,J= 11.0,7.1 Hz,H-10b),3.46~3.38(1H,m,H-10a),2.80~2.69(1H,m,H-5),2.26~2.21(1H,m,H-9),2.12~2.02(1H,m,H-8),1.97~1.88(1H,m,H-7a),1.80~1.70(1H,m,H-7b),1.60~1.54(1H,m,H-6a),1.47~1.37(1H,m,H-6b);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:97.4(C-1),152.2(C-3),110.8(C-4),36.3(C-5),33.6(C-6),27.2(C-7),41.3(C-8),36.3(C-9),61.2(C-10),98.9(C-1′),73.1(C-2′),76.6(C-3′),70.1(C-4′),77.3(C-5′),65.8(C-6′),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致[4],故鑒定化合物為五福花苷酸。

    化合物2白色粉末;分子式C27H34O11;ESI-MS:m/z535 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.05(1H,d,J= 8.5 Hz,H-5),6.97(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),6.93(2H,dd,J= 5.1,3.3 Hz,H-2′,5′),6.87(2H,ddd,J= 8.5,3.6,1.8 Hz,H-6,6′),5.21(1H,d,J= 4.5 Hz,H-9′),5.07(1H,d,J

    圖1 化合物1~17的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-17

    =3.8 Hz,H-9′),4.88(1H,d,J= 7.0 Hz,H-1′′),4.80(1H,d,J= 5.9 Hz,H-7′),4.53(1H,t,J= 5.7 Hz,H-9eq),4.38(1H,d,J= 6.8 Hz,H-7),4.12~4.08(1H,m,H-9ax),3.67(3H,s,3′-OCH3),3.24(3H,s,4′-OCH3),2.87~2.81(1H,dd,H-8);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:135.2(C-1),110.4(C-2),145.9(C-3),148.9(C-4),115.2(C-5),118.1(C-6),86.6(C-7),54.0(C-8),70.3(C-9),55.6(C-OCH3-3),131.1(C-1′),109.4(C-2′),147.5(C-3′),148.4(C-4′),117.5(C-5′),111.5(C-6′),81.2(C-7′),49.3(C-8′),68.9(C-9′),100.1(C-1′′),73.2(C-2′′),76.8(C-3′′),69.6(C-4′′),77.0(C-5′′),60.6(C-6′′),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致[5],故鑒定化合物為連翹苷。

    化合物3白色粉末;分子式C27H30O16;ESI-MS:m/z610 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,MeOD-d4)δ:7.69~7.60(1H,m,H-6′),5.11(1H,d,J= 7.4 Hz,H-Glc),3.81~3.38(6H,m,H-2′′,6′′),3.64(d,J= 4.0 Hz,H-2′′′),3.55(1H,dd,J= 9.5,3.3 Hz,H-5′),1.12(d,J= 6.1 Hz,H-CH3);13C NMR(101 MHz,MeOD-d4)δ:158.4(C-2),135.6(C-3),179.3(C-4),162.9(C-5),99.9(C-6),165.9(C-7),94.8(C-8),159.2(C-9),105.5(C-10),123.0(C-1′),116.0(C-2′),145.7(C-3′),149.7(C-4′),117.6(C-5′),123.5(C-6′),104.7(C-1′′),75.7(C-2′′),78.1(C-3′′),71.3(C-4′′),77.1(C-5′′),68.5(C-6′′),102.3(C-1′′′),72.0(C-2′′′),72.2(C-3′′′),73.9(C-4′′′),69.6(C-5′′′),17.8(C-6′′′),以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致[6],故鑒定化合物為蘆丁。

    化合物4白色粉末;分子式C26H32O11;ESI-MS:m/z521 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.16(1H,d,J= 8.3 Hz,H-5),7.03(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),6.93(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2′),6.90(1H,dd,J= 8.4,1.8 Hz,H-6),6.79(1H,dd,J= 8.4,1.8 Hz,H-6′),6.76(1H,d,J= 8.4 Hz,H-5′),4.23(2H,m,H-9a,9′),3.86(1H,s,H-3,3′OMe),3.11(2H,m,H-8,8′);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:137.4(C-1),110.9(C-2),150.8(C-3),147.2(C-4),116.0(C-5),119.7(C-6),87.0(C-7),55.2(C-8),72.6(C-9),133.7(C-1′),111.6(C-2′),149.0(C-3′),147.4(C-4′),117.9(C-5′),120.0(C-6′),87.4(C-7′),55.4(C-8′),72.6(C-9′),102.7(C-1′′),74.8(C-2′′),77.7(C-3′′),71.3(C-4′′),78.1(C-5′′),62.4(C-6′′),56.4(C-OCH3),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[7],故鑒定化合物(+)-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

    化合物5白色粉末;分子式C26H32O11;ESI-MS:m/z520 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.85(1H,brs,H-4),7.05(2H,d,J= 8.4 Hz,H-5),6.96(2H,d,J= 1.9 Hz,H-2),6.92(1H,d,J= 1.6 Hz,H-2′),6.91(1H,dd,J= 8.3,1.6 Hz,H-6),6.77(1H,d,J= 8.3 Hz,H-5′),4.99(1H,d,J= 7.6 Hz,H-1″),4.74(1H,d,J= 3.6 Hz,H-7),4.70(1H,d,J= 4.3 Hz,H-7′),4.27(2H,m,H-9a,9a′),3.66(2H,m,H-9b,9′b),3.45(1H,m,H-5″),3.42(1H,m,H-2″),3.40(1H,m,H-3″),3.13(1H,m,H-6″a);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:135.3(C-1),110.4(C-2),148.9(C-3),145.8(C-4),115.2(C-5),118.1(C-6),86.6(C-7),53.9(C-8),70.2(C-9),129.6(C-1′),109.7(C-2′),147.2(C-3′),145.8(C-4′),115.1(C-5′),117.8(C-6′),81.3(C-7′),49.3(C-8′),68.9(C-9′),100.1(C-1′′),73.1(C-2′′),76.7(C-3′′),69.6(C-4′′),76.9(C-5′′),60.5(C-6′′),55.5(C-OCH3),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[8],故鑒定化合物(+)-表松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。

    化合物6白色粉末;分子式C26H32O12;ESI-MS:m/z536 [M+H ]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.14(2H,d,J= 8.0 Hz,H-5,5′),6.67(2H,d,J= 1.6 Hz,H-2,2′)5.10~4.97(2H,dd,J= 8.0,1.6 Hz,H-6,6′),4.84(2H,d,J= 7.6 Hz,H-Glu-1′′,1),4.54(2H,d,J= 4.0 Hz,H-7,7′),4.25(2H,dd,J= 8.8,6.8 Hz,H-9a,9′a),3.77(6H,s,H-3′,OCH3),3.07(2H,m,H-8,8′);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:132.4(C-1),110.0(C-2),148.5(C-3),145.9(C-4),115.1(C-5),117.5(C-6),81.1(C-7),60.6(C-8),70.3(C-9),132.2(C-1′),110.2(C-2′),147.5(C-3′),145.9(C-4′),114.8(C-5′),118.6(C-6′),86.9(C-7′),9(C-8′),7(C-9′),100.1(C-1′′),73.2(C-2′′),76.8(C-3′′),69.6(C-4′′),77.0(C-5′′),55.5(C-OCH3),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[9],故鑒定化合物(+)-羥基表松脂素-4′′-β-D-葡萄糖苷。

    化合物7白色粉末;分子式C29H36O15;ESI-MS:m/z624 [M+H ]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.50(d,J= 15.9 Hz,H-1),7.05(1H,brs,H-2),6.76(1H,d,J= 8.2 Hz,H-5),7.00(1H,brs,H-6),6.65(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),6.63(1H,d,J= 7.8 Hz,H-5),6.50(1H,dd,J= 7.8,1.8 Hz,H-6),6.20(1H,d,J= 15.6 Hz,H-8),4.54(1H,brs,H-1′′),4.26(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1′),3.88(1H,m,H-7);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:131.4(C-1),116.3(C-2),146.0(C-3),144.6(C-4),117.1(C-5),121.2(C-6),36.6(C-7),71.9(C-8),104.4(C-1′),74.7(C-2′),75.1(C-3′),72.3(C-4′),75.8(C-5′),67.6(C-6′),102.2(C-1′′),72.3(C-2′′),72.2(C-3′′),73.9(C-4′′),69.8(C-5′′),18.0(C-6′′),127.6(C-1′′′),115.2(C-2′′′),147.6(C-3′′′),149.6(C-4′′′),116.5(C-5′′′),123.0(C-6′′′),146.7(C-7′′′),114.7(C-8′′′),168.2(C-9′′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[10],故鑒定化合物連翹脂苷A。

    化合物8白色粉末;ESI-MS:m/z625 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.58(1H,d,J= 16.0 Hz,H-7′),7.06(1H,d,J= 1.6 Hz,H-2′),6.94(1H,dd,J= 8.0,1.6 Hz,H-6′),6.77(1H,d,J= 8.0,H-5′),6.67(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),6.66(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5)6.56(1H,dd,J= 8.0,2.0 Hz,H-6),6.32(1H,d,J= 16.0 Hz,H-8′),5.03(1H,t,J= 9.2 Hz,H-3′′),4.73(1H,d,J= 0.8 Hz,H-1′′′),3.99(1H,m,H-8),3.98(1H,dd,J= 12.4,2.0 Hz,H-6′′),3.71(1H,m,H-3′′′),3.37(1H,t,J= 8.0 Hz,H-4′′′),2.79(2H,m,H-7),1.26(1H,d,J= 6.5 Hz,H-6′′′);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:169.0(C-1),115.4(C-2),149.5(C-3),127.8(C-4),115.1(C-5),146.9(C-6),146.7(C-7),116.5(C-8),122.8(C-9),104.3(C-1′),74.0(C-2′),78.9(C-3′),70.0(C-4′),76.6(C-5′),67.8(C-6′),102.2(C-1′′),72.1(C-2′′),72.3(C-3′′),73.4(C-4′′),69.8(C-5′′),18.0(C-6′′),72.3(C-1′′′),36.6(C-2′′′),131.3(C-3′′′),117.0(C-4′′′),144.6(C-5′′′),146.0(C-6′′′),116.3(C-7′′′),121.2(C-8′′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[11],故鑒定化合物連翹新苷。

    化合物9白色粉末;分子式C23H26O11;ESI-MS:m/z478 [M+H]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J= 15.9 Hz,H-7′′),7.05(1H,d,J= 1.9 Hz,H-2′′),6.90(1H,dd,J= 8.2,1.9 Hz,H-6′′),6.79(1H,d,J= 8.2 Hz,H-5′′),6.67(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),6.63(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.55(1H,dd,J= 8.0,2.0 Hz,H-6),6.30(1H,d,J= 15.9 Hz,H-8′′),4.52(1H,dd,J= 11.9,1.8 Hz,H-6a′),4.50(1H,dd,J= 11.9,1.8 Hz,H-6a′),4.32(1H,m,H-6b′),3.94(1H,m,H-8a),3.70(1H,m,H-8b),2.78(2H,t,J= 7.6 Hz,H-7);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:131.3(C-1),117.0(C-2),146.0(C-3),144.5(C-4),116.3(C-5),121.2(C-6),36.6(C-7),72.3(C-8),127.6(C-1′),115.0(C-2′),147.1(C-3′),149.5(C-4′),116.5(C-5′),123.1(C-6′),146.6(C-7′),114.8(C-8′),169.1(C-9′),104.4(C-1′′),74.9(C-2′′),77.8(C-3′′),71.6(C-4′′),75.3(C-5′′),64.5(C-6′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[12],故鑒定化合物為木通苯乙醇苷B。

    化合物10白色粉末;分子式為C26H32O12;ESI-MS:m/z559 [M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.02(1H,d,J= 1.5 Hz,H-2),7.06(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.90(1H,dd,H-6),6.95(1H,d,J= 1.5 Hz,H-2′),6.70(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5′),6.76(1H,dd,J= 1.5,8.0 Hz,H-6′),4.88(1H,d,J= 7.5 Hz,H-Glu-1),4.36(1H,t,J= 9.0 Hz,H-9′),3.77(3H,s,H-OCH3-3),3.75(3H,s,H-OCH3-3′),3.02(1H,m,H-8′);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:128.9(C-1),111.8(C-2),148.6(C-3),147.3(C-4),115.6(C-5),120.1(C-6),89.1(C-7),92.7(C-8),76.1(C-9),56.3(C-OCH3-3),137.1(C-1′),112.6(C-2′),150.7(C-3′),147.4(C-4′),117.7(C-5′),121.5(C-6′),87.2(C-7′),62.4(C-8′),71.9(C-9′),56.7(C-OCH3-3′),102.6(C-Glc-1′′),74.8(C-Glc-2′′),77.7(C-Glc-3′′),71.2(C-Glc-4′′),78.0(C-Glc-5′′),62.3(C-Glc-6′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[13],故鑒定化合物為(7R,8S,7′R,8′S)-8-hydroxypinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside。

    化合物11白色粉末;分子式為C23H26O11;ESI-MS:m/z478 [M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.60(1H,d,J= 15.9 Hz,H-7′′),7.06(1H,d,J= 1.9 Hz,H-2′′),6.96(1H,dd,J= 8.2,1.9 Hz,H-6′′),6.77(1H,d,J= 8.2 Hz,H-5′′),6.67(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),6.63(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.53(1H,dd,J= 8.0,2.0 Hz,H-6),6.30(1H,d,J= 15.9 Hz,H-8′′),4.37(1H,m,H-6b′),3.94(1H,m,H-8a),3.85(1H,m,H-8b),3.23(1H,m,H-2′),3.38(1H,m,H-3′),3.36(1H,m,H-4′),3.52(1H,m,H-5′),2.80(2H,t,J= 7.6 Hz,H-7);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:131.4(C-1),117.1(C-2),146.0(C-3),144.5(C-4),116.2(C-5),121.2(C-6),72.1(C-7),36.5(C-8),127.6(C-1′),115.2(C-2′),147.6(C-3′),149.6(C-4′),116.5(C-5′),123.0(C-6′),146.7(C-7′),114.6(C-8′),168.5(C-9′),104.2(C-1′′),75.1(C-2′′),76.0(C-3′′),72.4(C-4′′),75.7(C-5′′),62.3(C-6′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[14],故鑒定化合物為木通苯乙醇苷A。

    化合物12白色粉末;ESI-MS:m/z501 [M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.61(1H,d,J= 15.9 Hz,H-β′′),7.08(1H,d,J= 0.6 Hz,H-2′′),6.96(1H,dd,J= 8.1 Hz,H-6′′),6.79(1H,d,J= 8.1 Hz,H-5′′),6.70(1H,d,J= 2.1 Hz,H-2),6.67(1H,d,J= 8.1 Hz,H-5),6.57(1H,dd,J= 8.1,2.1 Hz,H-6),6.33(1H,d,J= 15.6 Hz,H-α′′),5.05(1H,t,J= 9.3 Hz,H-3′),4.42(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1′),3.93~3.85(1H,m,J= 12,2.4 Hz,H-6′),3.79~3.68(2H,m,H-α),3.54(1H,t,J= 9.3 Hz,H-4′),3.38(1H,m,H-5′),2.79(2H,m,H-β);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:131.4(C-1),117.0(C-2),146.7(C-3),144.6(C-4),116.2(C-5),121.2(C-6),69.8(C-7),36.5(C-8),127.8(C-1′),115.4(C-2′),146.9(C-3′),149.4(C-4′),116.4(C-5′),122.8(C-6′),146.0(C-7′),115.1(C-8′),169.0(C-9′),104.2(C-1′′),73.5(C-2′′),78.9(C-3′′),72.1(C-4′′),77.7(C-5′′),62.3(C-6′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[15],故鑒定化合物為車前草苷A。

    化合物13白色粉末;分子式為C20H30O12;ESI-MS:m/z462[M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:2.77(2H,m,H-7),4.26(1H,m,H-8a),4.74(1H,m,H-8b),6.57(1H,dd,J= 7.8,2.1 Hz,H-6),6.72(1H,d,J= 7.8 Hz,H-5),6.60(1H,d,J= 2.1 Hz,H-2),1.25(3H,d,J= 6.2 Hz,H-6′′);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:134.4(C-1),111.1(C-2),150.6(C-3),147.0(C-4),117.7(C-5),119.2(C-6),82.4(C-7),58.6(C-8),69.0(C-9),128.9(C-1′),112.7(C-2′),148.6(C-3′),147.4(C-4′),115.6(C-5′),121.6(C-6′),90.7(C-7′),91.5(C-8′),76.8(C-9′),102.7(C-1′′),74.8(C-2′′),78.1(C-3′′),71.3(C-4′′),77.7(C-5′′),62.4(C-6′′),56.3(C-OCH3),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[16],故鑒定化合物為連翹酯苷E。

    化合物14白色粉末;分子式為C26H34O11;ESI-MS:m/z545 [M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.13(1H,d,J= 8.3 Hz,H-5′),6.98(1H,d,J= 1.7 Hz,H-2′),6.88(1H,dd,J= 8.3,1.7 Hz,H-6′),6.79(1H,d,J= 1.7 Hz,H-2),6.71(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.63(1H,dd,J= 8.0,1.7 Hz,H-6),4.00(1H,d,J= 7.6 Hz,H-4′),3.86(1H,d,J= 6.4 Hz,H-7′),3.85(1H,dd,J= 8.2,6.4 Hz,H-9a),3.85(3H,s,H-OCH3-3),3.82(3H,s,H-OCH3-3′),3.72(1H,dd,J= 8.2,2.1 Hz,H-9b),2.90(1H,dd,J= 13.4,4.7 Hz,H-7b),2.50(1H,dd,J= 13.4,11.2 Hz,H-7a);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:133.4(C-1),113.3(C-2),150.8(C-3),147.2(C-4),116.1(C-5),122.1(C-6),33.6(C-7),43.8(C-8),73.6(C-9),139.4(C-1′),111.3(C-2′),150.8(C-3′),148.9(C-4′),117.8(C-5′),119.5(C-6′),83.8(C-7′),54.1(C-8′),60.4(C-9′),56.7(C-OCH3),102.8(C-Glc-1′′),74.9(C-Glc-2′′),78.1(C-Glc-3′′),71.3(C-Glc-4′′),77.8(C-Glc-5′′),62.4(C-Glc-6′′)以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[17],故鑒定化合物為落葉松脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

    化合物15白色粉末;ESI-MS:m/z482[M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:3.15(2H,t,J= 7.2 Hz,H-7),3.91(1H,m,H-8a),3.64(1H,m,H-8b),4.25(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1),0.98(3H,brd,J= 6.0 Hz,H-6′′),4.17(1H,d,J= 7.2 Hz,H-1),7.09(1H,brs,H-2′′),6.94(1H,brd,J= 7.8 Hz,H-6′′),7.47(1H,d,J= 16.2 Hz,H-7′′),6.14(1H,d,J= 16.2 Hz,H-8′′);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:69.1(C-1),154.3(C-2),127.9(C-3),187.7(C-4),127.8(C-5),154.4(C-6),40.9(C-7),65.8(C-8),104.3(C-1′),75.3(C-2′),77.8(C-3′),71.6(C-4′),74.9(C-5′),64.6(C-6′),131.1(C-1′′),141.5(C-2′′),28.5(C-3′′),45.4(C-4′′),24.4(C-5′′),26.3(C-6′′),168.7(C-7′′),72.8(C-8′′),27.0(C-9′′),26.4(C-10′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[18],故鑒定化合物為連翹酯苷G。

    化合物16白色粉末;分子式為C29H36O15;ESI-MS:m/z625[M+Na]+;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.57(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),6.65(1H,d,J= 8.4 Hz,H-5),6.51(1H,dd,J= 8.4,1.8 Hz,H-6),2.70(1H,m,H-7),4.08(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1′),4.52(1H,brs,H-1′′),1.14(1H,d,J= 6.6 Hz,H-6′′),7.11(1H,brs,H-2),6.81(1H,d,J= 7.2 Hz,H-5),7.00(1H,brs,H-6),7.59(1H,d,J= 16.0 Hz,H-7),6.31(1H,d,J= 16.0 Hz,H-8);13C NMR(101 MHz,CD3OD)δ:131.4(C-1),117.0(C-2),145.9(C-3),144.5(C-4),116.3(C-5),121.5(C-6),36.6(C-7),71.9(C-8),127.8(C-1′),115.2(C-2′),146.7(C-3′),149.5(C-4′),117.0(C-5′),123.0(C-6′),147.1(C-7′),115.2(C-8′),168.4(C-9′),102.3(C-1′′),75.1(C-2′′),76.1(C-3′′),71.7(C-4′′),76.9(C-5′′),67.8(C-6′′),102.1(C-1′′′),72.3(C-2′′′),72.2(C-3′′′),74.0(C-4′′′),69.8(C-5′′′),18.0(C-6′′′),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[19],故鑒定化合物為連翹酯苷H。

    化合物17白色粉末;分子式為C27H34O11;ESI-MS:m/z534[M+Na]+;1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.14(2H,dd,J= 2.0 Hz,H-2,2′),6.90(2H,d,J= 8.2 Hz,H-5,5′),6.69(2H,dd,J= 8.2,2.0 Hz,H-6,6′),4.91(1H,d,J= 8.0 Hz,H-1′′),3.74(3H,s,H-OCH3),3.75(3H,s,H-OCH3),3.77(3H,s,H-OCH3),4.62(2H,d,J= 4.4 Hz,H-7,7′),3.08(2H,m,H-8,8′),4.21(2H,dd,J= 9.0,4.0 Hz,H-9a,9′a),3.85(2H,dd,J= 9.0,6.6 Hz,H-9b,9′b);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ:135.1(C-1),110.5(C-2),148.9(C-3),145.8(C-4),115.1(C-5),118.1(C-6),84.8(C-7),53.6(C-8),71.0(C-9),133.8(C-1′),109.8(C-2′),148.7(C-3′),148.1(C-4′),111.5(C-5′),118.1(C-6′),84.9(C-7′),53.6(C-8′),71.0(C-9′),100.1(C-1′′),73.1(C-2′′),76.8(C-3′′),69.6(C-4′′),77.0(C-5′′),60.6(C-6′′),55.4(C-OCH3),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[20],故鑒定化合物為(+)松脂素單甲基醚-β-D-葡萄糖甙。

    2.2 MTT法檢測細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果

    通過對(duì)化合物1~17進(jìn)行MTT篩選,結(jié)果表明,17個(gè)化合物均沒有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。

    3 討論

    迄今為止,從該屬植物中分離的化學(xué)成分主要為苯乙醇苷類、木脂素及其苷類、乙基環(huán)己醇及其苷類、黃酮類、有機(jī)酸類、萜類、甾醇類、揮發(fā)油類等化合物[21]。本次從老翹正丁醇提取物中分離得到17個(gè)化合物,利用理化性質(zhì)及光譜特征鑒定了17個(gè)化合物的結(jié)構(gòu),其中包括六個(gè)木脂素類化合物、一個(gè)黃酮類化合物、六個(gè)苯乙醇苷類化合物、一個(gè)萜類化合物,及其他類型化合物。以上化合物中(+)-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、(+)-羥基表松脂素-4′′-β-D-葡萄糖(6)、木通苯乙醇苷B(9)、(7R,8S,7′R,8′S)-8-hydroxypinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside(10)、落葉松脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷(14)、(+)松脂素單甲基醚-β-D-葡萄糖甙(17)均為首次從該屬植物中分離得到的已知化合物。同時(shí)采用MTT法考察了17個(gè)單體化合物的抗腫瘤活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物1~17均沒有表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。本次實(shí)驗(yàn)中分離的化合物最多的是苯乙醇苷類,木脂素類,說明這與課題組前期對(duì)老翹化學(xué)成分的研究結(jié)果相似,說明老翹的主要化學(xué)成分在正丁醇部位,但在臨床上對(duì)其老翹的藥效學(xué)研究尚不清楚。為了合理開發(fā)利用該藥用植物資源,進(jìn)一步對(duì)老翹的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究是非常必要的。而本次實(shí)驗(yàn)豐富了連翹屬植物的化學(xué)結(jié)構(gòu),該研究為進(jìn)一步開發(fā)和利用老翹提供了研究依據(jù)。

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