蜂毒肽基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白生物活性作用的研究

王文佳，田維毅，蔡 琨，王 平，梁建東，何光志

貴州中醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550002

蜂毒是蜜蜂科昆蟲中華蜜蜂(ApisceranaFabricius)等工蜂尾部螫刺毒腺和副腺分泌出的具有芳香氣味的淡黃色透明毒液，屬于祖國醫(yī)學(xué)中傳統(tǒng)動(dòng)物藥的一種[1]。臨床廣泛用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰痛、血栓及腫瘤等疾病治療[2-5]。目前蜂毒的自然生產(chǎn)遠(yuǎn)不能滿足用藥需求，并且其常規(guī)采集方法是電擊取毒，這種方式對人體呼吸道有強(qiáng)烈的刺激作用，也不利于生態(tài)環(huán)境。不斷發(fā)展的生物工程技術(shù)為蜂毒的獲得提供了一條新途徑[6]。蜂毒是含有多種生物學(xué)活性的復(fù)雜混合物[7]，主要含有蜂毒肽(melittin)、活性酶、生物胺和其它酸類物質(zhì)等，在臨床使用中可見嚴(yán)重過敏反應(yīng)。蜂毒肽約占蜂毒干重的50%，具有較高的生物活性，有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用[8]，不是常規(guī)蜂毒過敏診斷分子[9]，有望成為新的抗菌肽藥物。其分子量小，基因序列短，易于合成和轉(zhuǎn)染，適合作為目的基因，可利用基因工程技術(shù)獲得。但蜂毒肽可溶解細(xì)胞膜，所以不易直接用細(xì)胞表達(dá)活性蜂毒肽。利用異源細(xì)胞進(jìn)行蜂毒肽重組蛋白的表達(dá)，并從中選擇高效表達(dá)系統(tǒng)，是基因工程生產(chǎn)蜂毒肽的關(guān)鍵技術(shù)之一。筆者團(tuán)隊(duì)通過人工合成蜂毒肽基因，構(gòu)建蜂毒肽融合蛋白的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，改進(jìn)分離純化技術(shù)，提取目的蛋白蜂毒肽，進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)及抗腫瘤試驗(yàn)等生物活性檢測。為蜂毒肽的基因工程生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 主要材料與試劑

1.1 主要試劑

粉碎緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，0.1% Triton X-100，5%甘油，1 mM DTT，pH=8.0)；結(jié)合緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，5%甘油，pH =8.0)；清洗緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，5%甘油，20 /50 mM咪唑，pH=8.0)；洗脫緩沖液(50 mM Tris，300 mM NaCl，5%甘油，500 mM咪唑，pH=8.0)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Phamacia公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(江蘇瑞楚生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；0.02%EDTA /0.25%胰蛋白酶(北京邁晨科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 試劑盒

SDS-PAGE試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；RNA抽提試劑盒(批號(hào)：B012005018，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；RT試劑盒(批號(hào)：lot#B050002018，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(批號(hào)：Cat#KT201，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；96孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)。

1.3 載體、菌種及細(xì)胞

pGEX6p-1載體，引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成；金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌及大腸埃希菌，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)形態(tài)實(shí)驗(yàn)室教研室提供；人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備

多功能電泳儀(型號(hào)：powerpac TM Basic，美國BIO-RAD公司)；低速大容量離心機(jī)(型號(hào)：TD5A-WS，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)；潔凈工作臺(tái)(型號(hào)：CJ-1D，天津市泰斯特儀器有限公司)；梯度PCR儀(型號(hào)：T100 thermal cycle，美國BIO-RAD公司)；高速離心機(jī)(型號(hào)：Thermo Scientific SORVALL LEGEND MICRO 21R，美國Thermo公司)；凝膠成像儀(型號(hào)：Bio-RAD chemiDocTM XRS+，美國Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：USA3131，美國Thermo公司)；自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào)：1510 型，美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(型號(hào)：DSZ2000X型，日本Olympus公司)；全自動(dòng)高壓滅菌鍋(型號(hào)：SX-700，日本TOMY公司)。

2 方法

2.1 表達(dá)菌株的構(gòu)建和蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

根據(jù)Genebank中公布的蜂毒肽基因(melittin)序列(NM001011607)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成基因片段，插入pGEX6p-1載體。取1 μL重組的pGEX6p-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，42 ℃熱擊90 s后冰上靜置5 min后，加入700 μL培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)45 min，涂平板(100 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單個(gè)菌落(表達(dá)BL21(DE3))轉(zhuǎn)入4 mL LB培養(yǎng)基，加入100 μg/mL氨芐青霉素，37 ℃，220 rpm培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)所得菌液，按1∶100比例分別接種于8支試管(4 mL LB培養(yǎng)基，內(nèi)含100 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃，220 rpm培養(yǎng)。當(dāng)OD值達(dá)到0.6左右時(shí)，添加0.2 mM的IPTG，設(shè)定的表達(dá)溫度時(shí)間梯度分別為16 ℃過夜、25 ℃過夜、30 ℃過夜、37 ℃ 5 h后終止表達(dá)，陰性對照不加誘導(dǎo)劑IPTG，4 °C，5 000 rpm，離心5 min，用PBS緩沖液收集菌體。所得菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測，選擇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的最佳條件進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 pGEX6p-melittin表達(dá)純化

培養(yǎng)所得菌液，按1∶100分別轉(zhuǎn)種于試管(4 mL LB培養(yǎng)基，100 μg/mL氨芐青霉素)，37 ℃，220 rpm培養(yǎng)。當(dāng)OD值達(dá)到0.6左右時(shí)，添加0.2 mM的IPTG，25 ℃，220 rpm，培養(yǎng)過夜，4 °C 5 000 rpm離心5 min收集菌體。用Buffer(50 mM Tris，300 mM NaCl，0.1%Triton X-100，5 mM DTT，10%甘油，pH8.0)破碎溶解，超聲碎菌(冰浴，功率500 W，25 min，每超聲2 s，暫停6 s為一個(gè)循環(huán))。碎菌后，4 ℃，12 000 rpm，離心20 min，取上清液，親和層析。取GST填料5 mL，用Binding Buffer 10倍柱床體積，流速5 mL/min，清洗平衡柱子。樣品(上清液)上柱，流速2 mL/min，收集穿透液。Binding Buffer 10倍柱床體積，流速10 mL/min，清洗柱子。Elution Buffer洗脫，流速2 mL/min，收集洗脫液。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，將10 mM還原性谷胱甘肽洗脫組分別透析到1×PBS，2 mM DTT，pH7.4透析液中，過夜。冷凍重組蛋白液獲得干燥粉5 mg備用。

2.3 SDS-PAGE電泳、蛋白濃度分析

所獲得重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書分別制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，待膠體凝固后取下膠板安置于垂直電泳槽中，電泳液注滿電泳槽，取重組蛋白10 μL加入樣品孔，以蛋白Marker為參照標(biāo)準(zhǔn)。加90 V電壓至溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，電壓升高至160 V，待指示劑近膠體底部時(shí)取出凝膠進(jìn)行灰度分析，檢測重組蜂毒肽的純度，使用SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒檢測重組蜂毒肽的濃度。

2.4 免疫印跡

取方法2.2純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素薄膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，采用鼠源抗His-tag抗體(1∶3 000)一抗與兔抗鼠IgG抗體(1∶3 000)二抗(參照說明書使用劑量)進(jìn)行免疫印跡分析。使用AEC底物顯色試劑(按照試劑盒說明書制備)完全浸潤轉(zhuǎn)印膜，常溫，10 min，去離子水沖，洗終止反應(yīng)，觀察記錄結(jié)果。

2.5 藥敏試驗(yàn)

2.5.1 表達(dá)蛋白液和菌懸液的制備

將純化重組蛋白液的冷凍干燥粉加無菌蒸餾水稀釋至50 mL(重組蛋白0.5 g/mL，pH7.2)備用。將6 mm圓形濾紙片浸泡于重組蛋白液中，陰性對照浸泡無菌蒸餾水，2 h后40 ℃烘干各待試紙片備用。

黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌及大腸埃希菌分別轉(zhuǎn)種于普通液體培養(yǎng)基中6 h后，分別轉(zhuǎn)入普通液體培養(yǎng)基18 h復(fù)蘇增菌后，再分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃，18 h。分別挑取平板所培養(yǎng)菌落，各自放入3 mL生理鹽水(振蕩混勻)，以0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁転闃?biāo)準(zhǔn)，制備菌液。

2.5.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

用無菌棉簽分別蘸取以上4種菌液均勻涂布于MH藥敏瓊脂平板。將待試紙片貼于平板上，每個(gè)平板均勻放置重組蛋白紙片3片，無菌蒸餾水紙片1片作為陰性對照，37 °C，培養(yǎng)20 h，測量紙片周圍抑菌環(huán)直徑。上述作3個(gè)平行樣，取3次平均值為最終抑菌直徑。

2.6 抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)4代人乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)，設(shè)陰性對照組、不同濃度重組蛋白組、空白組。稱取1 mg重組蛋白用高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM-H)，不加胎牛血清(FBS)，稀釋得到50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L共5個(gè)濃度備用。取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗，加入0.02%細(xì)胞消化液(EDTA /0.25%胰蛋白酶)1 mL，37 ℃，3 min，鏡下觀察約80% MCF-7細(xì)胞變圓時(shí)，移液器取DMEM-H (含10% FBS)培養(yǎng)液3 mL反復(fù)吹打，收集后離心，再用DMEM-H(含10%FBS)培養(yǎng)液調(diào)整為4×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。取96 孔板各孔加入100 μL，培養(yǎng)12 h后細(xì)胞貼壁長滿底部，加入不同濃度重組蛋白各100 μL，對照組加DMEM-H培養(yǎng)液稀釋(不含F(xiàn)BS)100 μL，空白組無細(xì)胞，加DMEM -H培養(yǎng)液，含10% FBS和不含F(xiàn)BS各100 μL，每組設(shè)3個(gè)平行孔，37 ℃，5%CO2孵化箱培養(yǎng)。分別培養(yǎng)12、24、36、48、72 h后，取出，每孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑鹽(MTT)(PBS配制濃度)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，上低速搖床10 min，靜置20 min，酶標(biāo)儀490 nm測各孔吸光度OD值，測定重組蛋白的相對活力。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 重組蛋白的表達(dá)及定位

重組蛋白最佳表達(dá)條件為：25 ℃溫度，IPTG濃度為0.2 mM。通過SDS-PAGE電泳對重組蛋白進(jìn)行純度分析，結(jié)果在25～35 kDa之間出現(xiàn)明顯的條帶，表明加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后有目的蛋白表達(dá)，與預(yù)期基因序列表達(dá)蛋白分子量與31.9 kDa基本一致(見圖1)。

圖1 表達(dá)蛋白SDS-PAGE及表達(dá)定位Fig.1 SDS-PAGE and location of expressed protein注：IPTG，0.2 mM；M：Protein Marker；1.PGEX6P-1空載體誘導(dǎo)上清；2.PGEX6P-1空載體誘導(dǎo)上清沉淀；3.16 ℃過夜誘導(dǎo)沉淀；4.16 ℃過夜誘導(dǎo)上清；5.25 ℃過夜誘導(dǎo)沉淀；6.25 ℃過夜誘導(dǎo)上清；7.30 ℃過夜誘導(dǎo)沉淀；8.30 ℃過夜誘導(dǎo)上清；9.37 ℃過夜誘導(dǎo)5 h沉淀；10.37 ℃過夜誘導(dǎo)5 h上清。Note:IPTG,0.2 mM;M:Protein Marker;1.PGEX6P-1supernatant of empty body induction;2.PGEX6P-1 precipitation of supernatant induced by empty body;3.16 ℃overnight induced precipitation;4.16 ℃ overnight induction supernatant;5.25 ℃ overnight induced precipitation;6.25 ℃ overnight induction supernatant;7.30 ℃overnight induced precipitation;8.30 ℃overnight induced precipitation;9.37 ℃precipitation was induced overnight for 5 h;10.37 ℃supernatant was induced overnight for 5 h.

3.2 純化蛋白檢測、灰度分析及免疫印跡

使用GST親和層析對重組蛋白進(jìn)行收集，通過SDS-PAGE電泳在相應(yīng)位置(31.9 kDa)出現(xiàn)明顯條帶，表明重組蛋白成功得到了純化(見圖2)。將重組蛋白的SDS-PAGE膠，通過ChemiDocTM XRS+system.，進(jìn)行灰度分析，其純度為90.4%(見圖3)。通過SK3071非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定重組蛋白濃度，測定蛋白時(shí)的體積為30 μL，BSA濃度為2 mg/mL，計(jì)算得蛋白濃度為0.6 mg/mL(見圖4)。

圖2 重組蛋白純化免疫印跡分析Fig.2 The recombinant protein purification for Western blot analysis注：1.目的蛋白；2.蜂毒肽印跡。Note:1.Target protein; 2.Melittin imprinting.

圖3 重組蛋白灰度分析圖Fig.3 Gray analysis chart of recombinant protein

圖4 重組蛋白定量分析圖Fig.4 Quantitative analysis chart of recombinant protein

3.3 抑菌試驗(yàn)

重組蛋白對金黃色葡萄球菌有高度敏感性(15.2 mm)，對大腸埃希菌有中度敏感性(12.9 mm)，對銅綠假單胞菌(6.7 mm)和傷寒沙門菌(8.4 mm)有低度敏感性。結(jié)果見表1。

表1 重組蛋白對各試驗(yàn)菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of recombinant protein on experimental bacteria

3.4 抗腫瘤作用

5個(gè)濃度重組蛋白50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L作用于MCF-7細(xì)胞，在12、24、36、48、72 h對MCF-7細(xì)胞生長均有穩(wěn)定抑制作用，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果顯示重組蛋白的濃度越高，作用時(shí)間越長，其抑制腫瘤的作用越強(qiáng)。結(jié)果見表2、圖5。

表2 重組蛋白對MCF-7細(xì)胞的生長影響(相對活力)Table 2 Effect of recombinant protein on the growth of MCF-7 cells(relative vitality)

圖5 重組蛋白對MCF-7細(xì)胞的生長影響曲線圖Fig.5 Effect of recombinant protein on growth of MCF-7 cells

4 討論

蜂毒肽是蜂毒主要生物活性成分，也是一種抗菌肽。抗菌肽(antimicrobial peptides)廣義上是指生物防御系統(tǒng)中產(chǎn)生的，廣泛存在于微生物、動(dòng)物及植物體內(nèi)[10],具有抵御外界微生物侵害，清除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類帶正電荷的兩親性小分子抗菌肽，是生物先天免疫的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽具有廣譜抗菌活性，多數(shù)抗菌肽不僅能殺死細(xì)菌，而且對真菌、原生動(dòng)物、病毒以及腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[11,12]。具有高效性、抗原性弱、穩(wěn)定性好等特性。因此，抗菌肽是新一代抗生素的理想替代者，具有極好的市場開發(fā)前景[13,14]。目前獲取蜂毒肽的方法主要有化學(xué)合成、從粗蜂毒中分離純化和生物工程法3種[15]。其中化學(xué)合成獲得蜂毒肽純品的成本太高，不適合蜂毒肽的批量生產(chǎn)。從粗蜂毒中分離純化蜂毒肽純品是目前主要獲得途徑，運(yùn)用色譜原理進(jìn)行分離純化，隨著色譜技術(shù)的提升以及與其他提取工藝的聯(lián)合，操作成本降低，產(chǎn)量和純度有所提高，但原材料主要是通過電擊蜜蜂獲取，這種方式對蜂源有要求，且不利于生態(tài)環(huán)境。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，為蜂毒肽的獲得提供了新途徑。利用基因工程菌表達(dá)目的蛋白，然后收集純化表達(dá)蛋白，從而得到蜂毒肽純品。

蜂毒肽由26個(gè)氨基酸殘基組成，中間區(qū)域是疏水性氨基酸殘基，還含有脯氨酸殘基和精氨酸殘基，使其成為一個(gè)強(qiáng)堿性肽，分子量為2.84 kDa，基因序列為NH2-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-COOH。其基因序列短，易于合成和轉(zhuǎn)染，適合作為目的基因。但蜂毒肽是兩親性分子，其中親水氨基酸殘基的分布不均勻且本身分子量小，可與帶負(fù)電荷的細(xì)胞在膜表面結(jié)合，形成孔隙破壞生物膜引起細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，并隨著滲透性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解[16]。故直接在感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)蜂毒肽對其有毒性，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在宿主細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)的報(bào)告并不多且表達(dá)量不高[17]。解決此難題是基因工程生產(chǎn)蜂毒肽的關(guān)鍵技術(shù)之一。從異源表達(dá)系統(tǒng)中獲得有活性的蜂毒肽，以融合蛋白的形式表達(dá)是解決矛盾的方法之一。融合表達(dá)可降低蜂毒肽對宿主細(xì)胞的毒性，增加產(chǎn)物的穩(wěn)定性，切除其承載部分就能得到目的蛋白，也是抗菌肽常用的表達(dá)策略。研究采用人工合成melittin基因，并構(gòu)建pGEX6p-1-melittin載體，轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用SDS-PAGE電泳純化重組蛋白和灰度分析測定蛋白濃度，結(jié)果證明基因工程方法可獲得穩(wěn)定的蜂毒肽。進(jìn)一步對所獲得重組蛋白進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)及抗腫瘤實(shí)驗(yàn)等生物活性檢測，同時(shí)證明重組的蜂毒肽仍保留原有的生物活性。

科學(xué)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蜂毒肽，根據(jù)其電荷特性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)建新型表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)蜂毒肽融合蛋白在單細(xì)胞生物中的穩(wěn)定表達(dá)，即可以規(guī)避蜂毒中其它成分如磷酸脂酶A、透明質(zhì)酸酶所引起的過敏反應(yīng)[18]，又可以突出蜂毒的抗炎、抗菌、抗病毒、抗輻射及抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[19]。本實(shí)驗(yàn)為基因工程生產(chǎn)蜂毒肽提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。而選擇蜂毒肽高效表達(dá)系統(tǒng)，改進(jìn)分離純化技術(shù)，可為蜂毒肽的基因工程批量生產(chǎn)朝著低成本、高表達(dá)、更方便的方向發(fā)展，同時(shí)也為毒性藥物生產(chǎn)提供一種可行性。