中藥抗菌活性分布規(guī)律及影響因素挖掘研究

王夢瑜，邵欣欣 ，李謹(jǐn)彤，韓 文，任 夏，付先軍,4*

1山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)文獻與文化研究院，濟南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)青島中醫(yī)藥科學(xué)院海洋中藥研究中心，青島 266000；3山東省中醫(yī)藥組學(xué)工程技術(shù)研究中心；4山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點實驗室，濟南 250355

近年來，中藥抗菌研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，文獻報道顯示，許多中草藥在抗菌抗病毒以及逆轉(zhuǎn)耐藥性方面具有確定的活性作用[1,2]，中藥抗菌研究已經(jīng)成為中藥研究領(lǐng)域的熱點之一，至2019年為止，國家針對中藥在抗菌領(lǐng)域的研究投入資金約為1.185 3億元，涉及多項面上項目及青年基金[3]。大部分中藥抗菌活性研究主要集中于單味中藥、中藥的有效部位及成分抗菌活性的篩選，雖然有文獻報道對抗菌中藥的屬性進行頻數(shù)統(tǒng)計研究，初步發(fā)現(xiàn)具備苦寒屬性的中藥有較好的抗菌效果[4]，但是并未明確抗菌中藥屬性分布規(guī)律以及物質(zhì)基礎(chǔ)和結(jié)構(gòu)特征[2]。

因此，本研究擬采用文本挖掘及化學(xué)信息學(xué)的方法，進行抗菌中藥分布規(guī)律及影響因素研究，以期明確抗菌中藥屬性及其相關(guān)成分的結(jié)構(gòu)特征，為抗菌中藥的活性篩選及實驗研究提供思路及參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源與篩選標(biāo)準(zhǔn)

本研究以中國知網(wǎng)(CNKI)數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源，以“(SU=‘抗菌’+‘抑菌’) and(KY=‘中藥’+‘草藥’)”為檢索式。其中，文獻的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)必須是實驗性論文；(2)實驗步驟的各項信息較完整；(3)有明確的抑菌或抗菌指標(biāo)，如抑菌圈直徑、最小抑菌濃度等；(4)實驗對象必須是中藥，或者中藥提取物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)實驗對象為中藥復(fù)方或中西藥聯(lián)用的文獻；(2)綜述論文；(3)實驗數(shù)據(jù)有錯誤。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

數(shù)據(jù)預(yù)處理方法分為四步：第一步，將從CNKI中檢索到的滿足條件的文獻保存到文件夾中，形成原始文獻；第二步，創(chuàng)建Excel表格，設(shè)置編號、中藥名、提取方法、提取溶劑、試驗方法、菌種及數(shù)量、是否有效(有效無效依據(jù)原文數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定)、抑菌圈直徑、最小抑菌濃度、參考文獻等字段，仔細(xì)閱讀原始文獻并將內(nèi)容分類填入表格，形成原始數(shù)據(jù)；第三步，對中藥名、提取方法、試驗方法、菌種名等進行統(tǒng)一規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)化處理：①中藥藥名標(biāo)準(zhǔn)化及藥性信息來源為《中華人民共和國藥典》2015版[5]與《中華本草》[6]，功效標(biāo)準(zhǔn)化參照《中藥功效學(xué)》[7]，將四字聯(lián)合詞組一分為二以區(qū)分直接功效與間接功效，使各功效獨立，繼而分類統(tǒng)計。②微生物的種屬名稱及革蘭染色信息主要依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》第八版中文版[8]。③實驗數(shù)據(jù)單位標(biāo)準(zhǔn)化為統(tǒng)一單位(抑菌直徑統(tǒng)一為mm，最小抑菌濃度統(tǒng)一為mg/mL)。④第四步，將每條數(shù)據(jù)中藥相關(guān)信息導(dǎo)入表格中，包括中藥的來源、形態(tài)、生態(tài)環(huán)境、毒性、四氣、五味、歸經(jīng)、功能主治、科屬等。⑤將最終整理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，以供后期的數(shù)據(jù)挖掘與信息分析。根據(jù)上述方法，每條活性數(shù)據(jù)基本信息點包括：編號、中藥名、提取方法、提取溶劑、試驗方法、菌種及數(shù)量、是否有效、抑菌圈直徑、最小抑菌濃度、科屬、藥性、參考文獻等。

1.3 數(shù)據(jù)分析及結(jié)果可視化

1.3.1 共現(xiàn)分析與頻數(shù)分析

運用共現(xiàn)分析法研究有效抗菌中藥藥物屬性的內(nèi)在聯(lián)系，將標(biāo)準(zhǔn)化的有效中藥藥物屬性導(dǎo)入vosviewer1.6.13[9]進行共現(xiàn)與聚類分析，繪制有效中藥藥物屬性的共現(xiàn)知識圖譜。

1.3.2 網(wǎng)絡(luò)可視化

將中藥與菌種的關(guān)系導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件cytoscape3.4.0[10]，構(gòu)建中藥-菌種的網(wǎng)絡(luò)圖。其中中藥、菌種分類、菌種被表示為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(node)，它們之間的相互聯(lián)系以邊(edge)表示。

1.3.3 分子骨架的提取及分子描述符的計算

篩選出有效抗菌中藥，從TCMD(2009)[11]與TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)，獲取有效中藥的化學(xué)成分信息，從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中得到相關(guān)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)信息。

進一步采用DataWarrio V05[12]進行分子骨架的提取，DataWarrio是一個專門用作化學(xué)和生物數(shù)據(jù)可視化及分析的工具，能夠?qū)討B(tài)圖形視圖和交互式行過濾與化學(xué)智能相結(jié)合，且支持在創(chuàng)建進化庫時枚舉組合庫。本研究中將相關(guān)中藥成分smiles格式的分子骨架導(dǎo)入其中，基于結(jié)構(gòu)片段的相似性比對(fragment-based similarity measure)計算其化學(xué)相似性并進行分子骨架的分析與提取，得到抗菌中藥中所蘊含的抗菌成分的優(yōu)勢骨架。

1.3.4 分子對接

對含優(yōu)勢骨架的化合物采用discovery studio 2017R2[13]進行ADMET預(yù)測，得到Human Intestinal Absorption結(jié)果，篩選Absorption_Level為0與1，且Solubility_Level值最優(yōu)的205個化合物，進行分子對接，探究抗菌機制。借助discovery studio 2017R2中Libdock算法將篩選出的化合物分別與細(xì)菌耐藥性相關(guān)靶點蛋白β-內(nèi)酰胺酶(PDB ID：1FCO，對接區(qū)域：76.942574、5.673936、29.677630、9.7)以及抗真菌靶點甾醇14α-脫甲基酶(PDB ID：1X8V，對接區(qū)域：-15.291555、-2.006965、70.111845、9.1)進行對接。設(shè)置：Number of Hotpots為100；Max Hits to Save設(shè)置為1；Docking tolerance 為0.25；minimum LibDockscore為50；Apolar SASA Cutoff 為15；Polar SASA Cutoff 為5；Surface Grid steps 為18；Conformation method 為FAST。

2 結(jié)果

2.1 抗菌中藥分布情況

根據(jù)檢索式，共檢索出1 687篇文獻，按照篩選標(biāo)準(zhǔn)共剔除文獻1 073篇，滿足條件納入分析的文獻共614篇，從文獻中共整理出38 851條數(shù)據(jù)，涉及1 289種中藥，其中有抗菌活性的中藥為879種。分析其抗菌活性分布情況見圖1，我們可以看出黃連的總條數(shù)最多，高達1 462條；其次是黃芩，達1 439條；再次是金銀花，共867條；其余依次是四季青、連翹、大黃、黃柏、五倍子、魚腥草、蒲公英。其中五倍子活性比例最高，達到96.65%，次之為黃連，為95.08%，第三是黃芩，為94.93%，其余依次為大黃、連翹、金銀花、魚腥草、蒲公英、黃柏、四季青。

圖1 高頻抗菌中藥抗菌活性分布圖Fig.1 Distribution of antibacterial activity of CMs with high frequency

2.2 中藥抗菌活性分布概況

革蘭氏染色是一種常用于細(xì)菌鏡檢的染色方法，根據(jù)染色反應(yīng)可分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，染色反應(yīng)反映了細(xì)菌細(xì)胞壁基本結(jié)構(gòu)的差異，也與抗菌藥物的敏感度及鑒定相關(guān)[14]。本文按照革蘭氏染色法，對抗菌實驗中的菌種數(shù)據(jù)進行分類，分析其活性分布情況(見表1)，發(fā)現(xiàn)中藥抗革蘭陰性菌的實驗條數(shù)最多，但是有活性占比最高的是對革蘭陽性的實驗數(shù)據(jù)，達到84.74%，最低的是真菌，只有35.40%。

表1 中藥抗菌活性分類Table 1 Classification of antibacterial activity of CMs

為進一步挖掘抗菌中藥與其對應(yīng)菌種之間的關(guān)系，構(gòu)建了中藥-菌種的網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。其中中藥、菌種被表示為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(node)，它們之間的相互聯(lián)系以邊(edge)表示。結(jié)果顯示，中藥-菌種的網(wǎng)絡(luò)圖共有節(jié)點1 117個(中藥相關(guān)節(jié)點845個，菌種相關(guān)節(jié)點272個)，邊6 999條，節(jié)點平均度為12.401，其中抗菌中藥與革蘭氏陰性菌之間邊的條數(shù)最多，其次為真菌，再次為革蘭氏陽性菌，與表1抗菌實驗數(shù)據(jù)條數(shù)是一致的。

圖2 抗菌中藥活性分布圖Fig.2 Antibacterial activity distribution map of traditional Chinese medicine注：節(jié)點大小代表度數(shù)高低Note:The node size represents the degree.

關(guān)鍵節(jié)點反映出各菌種與中藥相關(guān)關(guān)系的強弱，由節(jié)點度數(shù)篩選得出排名前十的關(guān)鍵節(jié)點，包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、新型隱球菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、傷寒桿菌、白假絲酵母菌、結(jié)核分枝桿菌、變形桿菌(種不詳)、宋內(nèi)氏志賀菌(見表2)，得到抗菌實驗的代表菌種，進而篩選出抗菌活性頻數(shù)前5的高頻中藥?？傮w而言，清熱類中藥如黃連、黃芩、金銀花、連翹、白頭翁對大多數(shù)代表菌都有良好的作用。除此之外，理氣類中藥如厚樸、丁香、月季花也展現(xiàn)出了廣泛的抗菌效果。兩種真菌的代表中藥中，利濕功效的中藥占比較大。

表2 代表菌種及高頻有效中藥分布Table 2 Representative strains and related antibacterial CMs with high frequency

2.3 抗菌中藥屬性分布規(guī)律研究

根據(jù)抗菌中藥活性條數(shù)中的有效數(shù)據(jù)，按照菌種分類將有效抗菌中藥分為三類：抗革蘭陰性菌有效中藥、抗革蘭陽性菌有效中藥和抗真菌有效中藥。將中藥屬性信息導(dǎo)入vosviewer得到有效抗菌中藥的屬性共現(xiàn)圖。通過共現(xiàn)分析，挖掘中藥的宏觀屬性之間的內(nèi)在聯(lián)系。各類抗菌中藥的中藥屬性共現(xiàn)情況如圖3所示。

圖3 抗菌中藥宏觀屬性共現(xiàn)圖Fig.3 Co-occurrence map of antibacterial CM properties注：A：抗革蘭陽性菌中藥屬性共現(xiàn)分布圖； B：抗革蘭陰性菌中藥屬性共現(xiàn)分布圖；C：抗真菌中藥屬性共現(xiàn)分布圖。節(jié)點為中藥的性味、歸經(jīng)等藥物屬性，節(jié)點間連線表示各屬性之間的關(guān)系。節(jié)點與字體的大小取決于節(jié)點的權(quán)重，權(quán)重越大，節(jié)點與字體就越大，節(jié)點之間的連線表明節(jié)點共現(xiàn)關(guān)系，節(jié)點之間的距離體現(xiàn)了共現(xiàn)關(guān)系的遠(yuǎn)近，節(jié)點的顏色表示不同的聚類關(guān)系。Note:A:Properties co-occurrence map of traditional Chinese medicine against Gram-positive bacteria;B:Properties co-occurrence map of traditional Chinese medicine against Gram-negetive bacteria;C:Properties co-occurrence map of traditional Chinese medicine against fungal.The nodes are the properties of traditional Chinese medicine,such as nature and flavour,channel tropism.And the edge represents the relationships between the properties.The size of the node and the font depends on the weight of the node.The greater the weight,the larger the node and the font.The edge between the nodes indicates the co-occurrence relationship of the nodes.The distance between the nodes reflects the distance of the co-occurrence relationship.The color of the node represents different clustering category.

在針對于抗菌中藥的屬性研究中發(fā)現(xiàn)，苦、肝兩種屬性是抗菌中藥中的優(yōu)勢屬性(見圖3)。相比于抗革蘭陽性菌和抗革蘭陰性菌的中藥屬性的共現(xiàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抗真菌的中藥屬性辛味與祛風(fēng)更為突出(見圖3C)。其次，在抗革蘭陽性菌中，寒性與清熱解毒更為相關(guān)(見圖3A)，而在抗真菌中寒性與清熱更為相關(guān)，與解毒的相關(guān)性次之(見圖3C)。在抗革蘭陰性菌的中藥屬性中，寒性與清熱解度的共現(xiàn)較差，與利水更為相關(guān)(見圖3B)。提示寒性在不同菌之間發(fā)揮著不同的作用，這與傳統(tǒng)概念的“寒性-清熱解毒”的關(guān)聯(lián)思維稍有出入。

2.4 結(jié)構(gòu)相似性比對

篩選出有效抗菌中藥共845味相關(guān)的抗菌中藥化學(xué)成分為13 802個。將收集到的化學(xué)成分進行基于結(jié)構(gòu)片段的相似性比對(fragment-based similarity measure)，計算其化學(xué)相似性并進行分子骨架的分析與提取，以相似度大于90%為閾值，選擇相似個數(shù)大于25的化合物類別進行分析，發(fā)現(xiàn)化合物除卻初生物質(zhì)(氨基酸、長鏈脂肪酸)，有關(guān)于中藥抗菌初生物質(zhì)之間的化合物主要集中于四環(huán)三萜，五環(huán)三萜以及黃酮類化合物(見圖4)?；衔锵嗨菩员葘Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，四環(huán)三萜，五環(huán)三萜以及黃酮類化合物是抗菌中藥中存在相似度最高，且數(shù)量優(yōu)勢較高的化合物。

圖4 化合物結(jié)構(gòu)相似比對圖Fig.4 Compound structural similarity comparison chart

2.5 分子骨架篩選

為進一步探尋抗菌中藥化學(xué)成分中所包含的優(yōu)勢骨架，將化合物進行Murcko scaffold特征骨架計算，計算完成進行匯總得到化合物的骨架特征信息如表3所示，可以發(fā)現(xiàn)化合物中top5的占比分別是黃酮骨架、芳烴、五環(huán)三萜、四環(huán)三萜以及香豆素類化合物，其中因涉及較多的氨基酸，脂肪酸等初生物質(zhì)，導(dǎo)致苯環(huán)的占比量較高。

表3 化合物優(yōu)勢分子骨架Table 3 Advantage molecular skeleton of compound

2.6 分子對接結(jié)果

分子對接結(jié)果數(shù)據(jù)顯示(見圖5，6)，針對于細(xì)菌耐藥靶點β-內(nèi)酰胺酶(ampC)，黃酮以及香豆素能與其結(jié)合，提示中藥黃酮以及香豆素可能在逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性方面能發(fā)揮一定作用，但是其數(shù)量以及能量上并不占優(yōu)勢，而三萜類化合物未能與其結(jié)合，提示三萜類骨架化合物可能并不是針對細(xì)菌耐藥靶點β-內(nèi)酰胺酶。

而針對于甾醇14α-脫甲基酶(cyp51)，三萜類化合物對接結(jié)果較好，由于cyp51是真菌細(xì)胞膜生物合成中的關(guān)鍵酶，結(jié)果提示中藥三萜類化合物可能具備較好的抗真菌活性。從能量打分值來看，中藥化學(xué)成分中四環(huán)三萜以及五環(huán)三萜與cyp51結(jié)合能打分最高，黃酮次之，香豆素較差。

圖5 中藥化合物與cyp51分子對接結(jié)果圖Fig.5 Molecular docking result of cyp51 and dominant compound注：A：CYP51、ampC與優(yōu)勢化合物分子對接結(jié)果的頻數(shù)統(tǒng)計；B：CYP51分子對接結(jié)果能量打分；圖C：黃酮類化合物與CYP51對接結(jié)果圖；D：為香豆素類化合物與CYP51對接結(jié)果圖；E：四環(huán)三萜類化合物與CYP51分子對接結(jié)果圖；F：為五環(huán)三萜化合物與CYP51對接結(jié)果圖。Note:A:Frequency statistics of molecular docking results of CYP51,ampC and dominant compounds;B:Energy score of CYP51 molecular docking result;C:Molecular docking diagram of flavonoids and CYP51;D:Molecular docking diagram of coumarins and CYP51;E:Molecular docking diagram of tetracyclic triterpenoid compounds and CYP51;F:Molecular docking diagram of pentacyclic triterpene compounds and CYP51.

2.7 優(yōu)勢骨架化合物科屬分布

植物之間存在的親緣關(guān)系，同科屬之間的初生物質(zhì)以及次生物質(zhì)之間具備較高的相似性[15]。結(jié)合分子相似性比對結(jié)果以及分子骨架分析結(jié)果，最終確定黃酮、四環(huán)三萜、五環(huán)三萜、香豆素為抗菌中藥優(yōu)勢骨架，根據(jù)得到的分子骨架，對TCMD(2009)進行搜尋，并統(tǒng)計其植物來源，將植物來源進行科屬標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)入Flourish進行可視化，得到“化合物骨架-科屬”分布圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)具備黃酮骨架的化合物主要分布于豆科，菊科，蕓香科和唇形科；具備四環(huán)三萜骨架的化合物主要分布于百合科，葫蘆科，蘿藦科，毛茛科，夾竹桃科，豆科，茄科，薯蕷科，五加科；具備五環(huán)三萜類骨架的化合物主要分布于豆科，菊科，木通科；具備香豆素骨架的化合物主要分布于傘形科，蕓香科，豆科。這些作為抗菌中藥化學(xué)成分中的優(yōu)勢骨架，通過植物親緣性出現(xiàn)規(guī)律性分布，這種規(guī)律性可用于指導(dǎo)抗菌中藥的篩選與開發(fā)(圖7)。

圖6 中藥化合物與ampC分子對接結(jié)果圖Fig.6 Molecular docking result of ampC and dominant compound注：A：ampC與香豆素類化合物對接結(jié)果圖；B：ampC與黃酮類化合物對接結(jié)果圖。Note:B:Molecular docking diagram of ampC and coumarins; C:Molecular docking diagram of ampC and flavonoids.

圖7 抗菌中藥優(yōu)勢化合物科屬分布圖Fig.7 Distribution map of dominant compound from antibacterial of CMs in family genus

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)具備抗菌活性的中藥多為苦，寒，歸肝經(jīng)的中藥，同時發(fā)現(xiàn)辛、祛風(fēng)在抗真菌中藥中具備突出地位，可能與中醫(yī)理論中治療真菌性的皮膚感染的用藥規(guī)律一致[16]。通過化合物相似性比對以及藥物優(yōu)勢骨架的統(tǒng)計與計算，發(fā)現(xiàn)具備黃酮、三萜、香豆素骨架的化合物在抗菌中藥化合物中所占的比重最高，提示這三類物質(zhì)可能具備突出的抗菌活性。進一步通過對優(yōu)勢分子骨架的篩選以及分子對接，發(fā)現(xiàn)相對于黃酮以及香豆素類化合物，三萜類化合物與抗真菌相關(guān)靶點甾醇14α-脫甲基酶(CYP51)打分值更高，結(jié)合度更好；而黃酮以及香豆素能與細(xì)菌耐藥靶點β-內(nèi)酰胺酶(ampC)結(jié)合。

中藥抗菌機制主要有四個方面，分別是破壞細(xì)菌的結(jié)構(gòu)、影響細(xì)菌內(nèi)部物質(zhì)的合成和抑制酶活性、以及逆轉(zhuǎn)耐藥性等[17]。β-內(nèi)酰胺抗生素是臨床常用的一類抗生素，由于臨床長期、大量的使用，導(dǎo)致其β-內(nèi)酰胺酶(ampC)在細(xì)菌中的表達量升高，從而誘發(fā)細(xì)菌耐藥性出現(xiàn)[18,19]。本論文研究結(jié)果顯示抗菌活性中藥中黃酮以及香豆素成分可以與細(xì)菌耐藥靶點β-內(nèi)酰胺酶(ampC)結(jié)合，提示這兩了中藥成分可能在逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性方面能發(fā)揮一定作用，但是其數(shù)量以及能量上并不占優(yōu)勢，需要進一步的實驗結(jié)果進行驗證。

甾醇14α-脫甲基酶(cyp51)是真菌細(xì)胞膜生物合成中的關(guān)鍵酶，催化甾醇前體14α-甲基羥基化反應(yīng)，生成細(xì)胞膜的重要成分麥角甾醇，是抗真菌藥物的主要作用靶點之一[20]。抗真菌藥物通過含氮雜環(huán)上的N原子與靶蛋白上的血紅素-鐵活性中心配位結(jié)合，阻止血紅素與氧原子結(jié)合，抑制羊毛甾醇 C14α位的甲基羥基化反應(yīng)，從而阻止真菌細(xì)胞膜成分甾醇的合成，抑制了病原菌的生長[21]。分子對接結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，針對于甾醇14α-脫甲基酶(cyp51)，三萜類化合物對接結(jié)果較好，提示中藥三萜類化合物可能具備較好的抗真菌活性，能量打分值顯示三萜類化合物中四環(huán)三萜以及五環(huán)三萜與cyp51結(jié)合能打分最高，這可以為今后從中藥中篩選抗真菌活性成分提供線索和參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗菌活性中藥在中藥屬性、成分分子結(jié)構(gòu)，尤其是優(yōu)勢骨架方面都具有一定的表征特征，植物類中藥不同優(yōu)勢骨架成分在科屬的分布上也具有一定的分布規(guī)律，這些規(guī)律為今后抗菌中藥及成分的活性篩選，尤其是耐藥菌的逆轉(zhuǎn)研究和抗真菌創(chuàng)新藥物的研發(fā)等方面提供參考。