薇甘菊葉的化學(xué)成分及抑菌活性研究

馬 秋， 王照國(guó)，楊 雪，李 ?*

1貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省天然藥物工程研究中心，貴陽(yáng) 550014

薇甘菊(MikaniamicranthaH.B.K)為菊科假澤蘭屬，是世界上最有害的10種外來(lái)入侵物種之一。原產(chǎn)于中南美洲，是一種生長(zhǎng)迅速的多年生雜草，自1980年代開(kāi)始在中國(guó)南方出現(xiàn)，已對(duì)入侵地的生物多樣性和人類生存環(huán)境造成了嚴(yán)重的危害[1]。

近年來(lái)，開(kāi)發(fā)薇甘菊生物活性以減少其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的危害已成為防控薇甘菊危害的重要研究方向之一。有多篇文章報(bào)道了薇甘菊具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等作用[2-4]，薇甘菊含有豐富的揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分，植物精油具有多種生物活性[5]。Eunice等[6]從薇甘菊總分離得到2個(gè)新的倍半萜類化合物8-epi-mikanokryptin和11Hβ-11,13-dihydromicrantholide，張瑤等通過(guò)制備液相分離得到3個(gè)卡丁烷倍半萜[7]，Shah等[8]從薇甘菊中分離得到的新型三萜16-羥基樺木酸張瑤等通過(guò)制備液相分離得到3個(gè)卡丁烷倍半萜。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)地分離了薇甘菊葉中所含的化合物，得到了9個(gè)化合物，其中6個(gè)化合物為首次從薇甘菊中分離得到，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步明晰了薇甘菊葉中所含化合物的種類。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器

美國(guó)HP-5973型質(zhì)譜儀；Varian INOVA-400 MHz和WIPM-I 500 MHz 核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；RE 52-99 型亞榮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；FA2204B 萬(wàn)分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；WFH-203B暗箱式紫外分析儀。

1.1.2 試劑

柱層析硅膠(60～80目和200～300目)和薄層層析硅膠(GF254)均為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)；5%磷鉬酸的乙醇溶液為顯色劑，所用試劑如四氯化碳、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、乙醇等均為分析純；二甲基亞砜(DMSO)均為市售分析純，氘代試劑購(gòu)于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司。

1.1.3 材料

薇甘菊(MikaniamicranthaH.B.K.)葉子部分采自2019年9月廣東省華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，自然陰干備用。

試驗(yàn)所用受試菌株：綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa、青枯菌Ralstoniasolanacearum、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和大腸桿菌Escherichiacoli，均由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

Luria-Bertani液體培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，加入去離子水至1 000 mL，用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，滅菌后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離

將薇甘菊葉風(fēng)干后粉碎，在室溫下用8 L二氯甲烷超聲提取薇甘菊葉粉碎物2 kg，過(guò)濾得到提取溶液，重復(fù)提取3次。在提取溶液中加入活性炭進(jìn)行脫色，然后過(guò)濾，以除去活性炭和不溶物質(zhì)。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，濃縮后得到86.4 g浸膏。稱取80 g浸膏，加適量氯仿溶解，用硅膠(60～80目)拌樣，在硅膠(200～300目)柱層析(80 mm×1 200 mm)上進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)性依次用四氯化碳-甲醇(30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1，V/V)進(jìn)行洗脫，根據(jù)其TLC譜圖合并后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將溶劑蒸干得到Fr.1～Fr.6餾分。

稱取Fr.1(3.282 6 g)，以硅膠(200～300目)柱層析，流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯(50∶1→1∶1，V/V)洗脫，TLC檢測(cè)合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到化合物1(2.121 0 g)。 Fr.2(2.660 2 g)在硅膠(200～300目)層析柱上進(jìn)行色譜分離，用石油醚：乙酸乙酯(50∶1→1∶1，V/V)洗脫，TLC檢測(cè)合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到化合物2(1.501 8 g)。 將Fr.3(1.726 6 g)在硅膠(200～300目)層析柱上進(jìn)行色譜分離，用石油醚：乙酸乙酯(40∶1→1∶1，V/V)洗脫，TLC檢測(cè)合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到化合物3(0.836 8 g)和化合物4(0.744 2 g)。Fr.4(2.056 3 g)在硅膠(200-300目)層析柱上進(jìn)行色譜分離，用石油醚：乙酸乙酯(30∶1→1∶1，V/V)洗脫，TLC檢測(cè)合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到化合物5(0.744 2 g)和化合物6(0.428 3 g)。將Fr.5(4.572 5 g)在硅膠(200～300目)層析柱上進(jìn)行色譜分離，用石油醚：乙酸乙酯(20∶1→1∶1，V/V)洗脫，TLC檢測(cè)合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到化合物7(3.408 1 g)。

稱取Fr.6 (6.143 4 g)在硅膠(200～300目)柱層析上進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯(8∶1，V/V)等度洗脫，每25 mL收集1份，TLC檢測(cè)合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到化合物8(4.241 1 g)和化合物9(1.622 8 g)。

1.2.1 抑菌活性測(cè)定

采用肉湯2倍稀釋法測(cè)試所分離的9個(gè)化合物的抑制細(xì)菌活性，將化合物使用十萬(wàn)分之一的天平秤取重量4～6 mg，加入適量的DMSO溶解，每個(gè)樣品加水制成2 000 mg/L的初始濃度(DMSO含量小于2.5%)，以加等量DMSO溶劑作為空白對(duì)照，以環(huán)丙沙星為陽(yáng)性對(duì)照。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以孔板上沒(méi)有渾濁的最小藥液濃度為樣品對(duì)供試細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC,minimum inhibitory concentration )。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色油狀液體;EI-MS：m/z228 [M]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.64 (3H，s，H-1′)，2.34(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.63(2H，q，J=7.4 Hz，H-3)，1.25(14H，s)，0.87(3H，t，J=6.8 Hz，H-13)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：174.8(C-1)，50.8(C-1′)，33.9(C-2)，31.9(C-11)，29.7～29.6(C-6，7，8，9)，29.3(C-10)，29.2(C-5)，29.1(C-4)，24.7(C-3)，22.7(C-12)，14.1(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的十三烷酸甲酯基本一致[9]，是高級(jí)脂肪酸酯。

化合物2淺黃色油狀物;EI-MS：m/z296 [M]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：10.42(1H，s，H-1′)，5.30～5.33(2H，m，H-10，H-11)，2.34(2H，t，J= 7.3 Hz，H-2)，2.01(4H，m，H-9，H-12)，1.63(2H，J= 7.3 Hz，H-3)，1.23～1.41(m，22H)，0.88(3H，t，J= 6.7 Hz，H-19)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：180.4(C-1)，130.1(C-6)，130.1(C-7)，34.2(C-2)，32.1(C-17)，29.6(C-15)，29.6(C-16)，29.5(C-11)，29.4(C-14)，29.3(C-13)，29.3(C-8)，29.3(C-5)，29.2(C-4)，29.1(C-10)，24.7(C-3)，27.3(C-9)，27.2(C-12)，22.7(C-18)，14.1(C-19)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致，確定為(Z)-6-十九碳烯酸[10]。

化合物3無(wú)色油狀物;ESI-MS：m/z535 [M+H]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.36(1H，m，J=7.0 Hz，H-2′)，4.59(2H，d，J=7.0 Hz，H-1′)，2.30(2H，t，J=7.6 Hz，H-2)，1.98～2.00(2H，m，H-4′)，1.70(3H，m，H-3′′)，1.53～1.62(2H，m，H-3)，1.03～1.51(m，43H)，0.89(3H，t，J=6.5 Hz，H-16)，0.87(6H，d，J=6.5 Hz，H-15′′，H-16′)，0.85(3H，d，J=6.5 Hz，H-11′′)，0.84(3H，d，J=6.5 Hz，H-7′′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ:173.9(C-1)，142.7(C-3′)，118.1(C-2′)，61.2(C-1′)，39.9(C-14′)，39.4(C-4′)，37.4(C-6′)，37.3(C-8′)，36.6(C-10′)，36.9(C-12′)，34.4(C-2)，32.8(C-7′)，32.7(C-11′)，31.9(C-14)，29.7(C-8)，29.7(C-9)，29.6(C-10)，29.6(C-7)，29.6(C-6)，29.5(C-11)，29.4(C-12)，29.3(C-5)，29.3(C-13)，29.2(C-4)，28.0(C-15′)，27.2(C-13′)，25.2(C-3)，25.0(C-9′)，24.8(C-5′′)，22.7(C-15′′)，22.7(C-15)，22.6(C-16′)，19.8(C-11′′)，19.7(C-7′′)，16.4(C-3′′)，14.1(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的植酸棕櫚酸酯基本一致[11]。

化合物4白色粉末;EI-MS：m/z256 [M]+，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：0.88(3H， t，J=6.8 Hz，H-16)，1.25(24H，m，H-4～15)，1.62(2H，m，H-3)，2.32(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：178.6(C-1)，34.2(C-2)，31.8(C-14)，29.8(C-4)，29.7～29.6(C-7，8，9，10，11，12)，29.5(C-6)，29.4(C-13)，29.1(C-5)，24.8(C-3)，22.7(C-15)，14.2(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致，確定為十六烷酸[12]，為高級(jí)脂肪酸。

化合物5黃色油狀物;ESI-MS：m/z445 [M-H]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：2.52 (2H，m，H-1′)，2.03(3H，s，H-6′)，2.00(6H，s，H-3′，H-4′)，1.24(3H，s，H-3′′)，0.87(6H，d，J=6.5 Hz，H-15′′，H-16′)，0.83～0.86(6H，m，H-7′′，H-11′′)；13C NMR(500 MHz，CDCl3)δ：187.8(C-2)，187.3(C-5)，144.6(C-1)，140.7(C-3)，140.5(C-4)，140.1(C-6)，72.7(C-3′)，42.4(C-4′)，40.4(C-14′)，39.4(C-2′)，37.6(C-8′)，37.4(C-10′)，37.2(C-12′)，32.9(C-7′)，32.8(C-11′)，29.8(C-6′)，27.9(C-15′)，26.6(C-3′′)，24.5(C-13′)，22.9(C-15′′)，24.9(C-9′)，22.6(C-16′)，21.3(C-5′)，19.9(C-11′′)，19.8(C-7′′)，12.5(C-3′)，12.5(C-4′)，12.5(C-6′)，12.1(C-1′)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的α-生育酚醌基本一致[13]。

化合物6白色無(wú)定形粉末;ESI-MS：m/z197 [M+H]+，1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，s，H-7)，4.33(1H，m，H-3)，2.47(1H，ddd，J=14.0，2.5，2.5 Hz，H-4)，2.00(1H，ddd，J=14.5，2.6，2.6 Hz，H-2)，1.78(1H，m，H-4)，1.77(3H，s，H-11)，1.53(1H，dd，J=14.5，3.7 Hz，H-2)，1.47(3H，s，H-9)，1.28(3H，s，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：183.8(C-6)，171.8(C-8)，112.5(C-7)，87.1(C-5)，66.3(C-3)，47.0(C-2)，45.7(C-4)，36.1(C-1)，30.8(C-9)，27.3(C-11)，26.6(C-10)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的黑麥草內(nèi)酯基本一致[14]，為酯類化合物。

化合物7白色片狀結(jié)晶;EI-MS：m/z412 [M ]+，1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.34(1H，d，J=5.1 Hz，H-6)，5.15(1H，dd，J=15.1，8.6 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J=15.2，8.6 Hz，H-23)，3.52(1H，m，H-3)，1.03(3H，d，J= 8.5 Hz，H-21)，1.01(3H，s，H-19)，0.97～0.89(3H，m，H-29)，0.83(3H，d，J= 6.5 Hz，H-26)，0.79(3H，d，J=6.9 Hz，H-27)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:140.7(C-5)，138.3(C-22)，129.2(C-23)，121.7(C-6)，71.8(C-3)，56.8(C-14)，55.9(C-17)，51.2(C-24)，50.1(C-9)，42.2(C-4)，42.2(C-13)，40.5(C-20)，39.7(C-12)，37.2(C-1)，31.9(C-25)，31.9(C-8)，31.8(C-7)，31.6(C-2)，28.9(C-16)，25.4(C-28)，24.4(C-15)，21.2(C-26)，21.1(C-11)，21.0(C-21)，19.4(C-19)，19.1(C-27)，13.1(C-29)，12.0(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的豆甾醇基本一致[15]。

化合物8針狀晶體;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.62(1H，d，J=1.9 Hz，H-5)，6.23(1H，d，J=3.6 Hz，H-13a)，5.96(1H，d，J=3.2 Hz，H-13b)，5.36(1H，m，H-6)，4.83(1H，m，H-8)，4.78(1H，m，H-3)，3.39(1H，d，J=3.2 Hz，H-2)，3.26(1H，s，H-1)，3.08(1H，m，H-7)，2.20(1H，dd，J=13.3，11.0 Hz，H-9a)，1.89(1H，dd，J=13.5，4.8 Hz，H-9b)，1.00(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：171.3(C-15)，168.4(C-12)，150.7(C-5)，138.8(C-11)，129.3(C-4)，122.5(C-13)，83.7(C-6)，77.0(C-8)，57.6(C-1)，57.6(C-10)，55.7(C-2)，50.5(C-7)，49.6(C-3)，42.6(C-9)，21.4(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的薇甘菊內(nèi)酯基本一致[16，17]，為吉瑪烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物。

化合物9白色結(jié)晶;1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.57(1H，m，H-5)，5.46(1H，s，H-6)，4.65(1H，m，H-8)，4.01(1H，m，H-3)，3.38(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，3.31(1H，s，H-1)，2.99(1H，m，H-11)，2.98(1H，td，J=13.8，6.9 Hz，H-7)，2.08(1H，dd，J=13.6，4.2 Hz，H-9a)，1.88(1H，dd，J=13.5，10.9 Hz，H-9b)，1.27(3H，d，J=7.0 Hz，H-13)，0.97(3H，s，H-14)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：177.5(C-12)，172.5(C-15)，151.3(C-5)，129.0(C-4)，83.7(C-6)，77.9(C-8)，58.9(C-1)，58.8(C-10)，56.1C-2)，53.6(C-7)，51.7(C-3)，43.6(C-9)，42.4(C-11)，22.2(C-14)，14.7(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的二氫薇甘菊內(nèi)酯基本一致[17]，為吉瑪烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物。

2.2 抑菌活性篩選

對(duì)薇甘菊葉分離得到的化合物1～9進(jìn)行抑菌活性測(cè)試,結(jié)果如表1所示，只有吉瑪烷型倍半萜類化合物8和9表現(xiàn)出抑菌作用，MIC值均為500 mg/L，其余化合物在該濃度下對(duì)5種受試菌株均無(wú)抑制作用，表中未列出。

表1 薇甘菊葉部位化合物的抑菌活性篩選Table 1 Antibacterial activity of compounds of the leaves of M. micrantha

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分離了薇甘菊葉二氯甲烷浸膏中的化合物，得到了9個(gè)化合物，其中吉瑪烷型倍半萜類化合物2個(gè)、脂肪酸2個(gè)、甾醇類1個(gè)、酯類2個(gè)、其它化合物2個(gè)，化合物1～6為首次從薇甘菊中分離得到。同時(shí)對(duì)所有化合物進(jìn)行抑菌活性測(cè)試，只有吉瑪烷型倍半萜類化合物8和9表現(xiàn)出抑菌作用，MIC值均為500 mg/L，推測(cè)薇甘菊抑菌活性成分主要為吉瑪烷型倍半萜類化合物。

薇甘菊中含有多種化合物，主要是萜類、酚類化合物，對(duì)于高級(jí)脂肪酸和高級(jí)脂肪酸酯的報(bào)道較少，化合物1、2和4為高級(jí)脂肪酸和高級(jí)脂肪酸酯。脂肪酸主要存在植物油中，如亞油酸存在于葵花籽油、大豆油以及芝麻油等植物油中，α-亞麻酸存在于紫蘇、胡麻 、亞麻以及油菜籽等植物油中；也可于人體內(nèi)合成，在人體內(nèi)具有重要的生理功能，長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸如月桂酸，肉豆蔻酸，十六烷酸會(huì)使血清膽固醇值升高[18]。據(jù)報(bào)道，吉瑪烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物如薇甘菊內(nèi)酯，去氧薇甘菊內(nèi)酯，藤薇甘菊內(nèi)酯和二氫薇甘菊內(nèi)酯具有抗菌作用[17]；甾醇類如β-谷甾醇有抗炎作用[19]，豆甾醇有調(diào)節(jié)血脂平衡、預(yù)防心腦血管疾病的作用[15]；除此之外，薇甘菊的提取物對(duì)治療糖尿病有顯著效果[20]等。實(shí)驗(yàn)表明薇甘菊植物在抑菌方面具有研究與開(kāi)發(fā)的潛力。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室下一步將繼續(xù)研究薇甘菊葉中化合物的活性，以期能尋找到薇甘菊更多的生物活性和活性化合物，為客觀評(píng)價(jià)薇甘菊的應(yīng)用價(jià)值和探討薇甘菊的綜合利用前景提供依據(jù)。