茄科植物糖苷生物堿抗腫瘤活性及其構效關系研究進展

吳 桐，王建農(nóng)

中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院 基礎醫(yī)學研究所，北京 100091

糖苷生物堿是一種含氮的甾體苷類化合物，是一類具有藥理活性的次生代謝物，廣泛存在于茄科植物中。其中包括許多常見的藥用植物及重要農(nóng)業(yè)植物，如白英、龍葵、馬鈴薯、番茄和茄子。隨著國內(nèi)外學者對糖苷生物堿的不斷深入研究，近年來已取得了實質性進展。大量研究表明，茄科糖苷生物堿具有抗腫瘤、抗炎、抗菌和降膽固醇等作用[1]。越來越多的研究人員將目光聚焦于其顯著的抗腫瘤作用。然而到目前為止，該類化合物的確切抗腫瘤藥理機制和構效關系尚未得到闡明，部分化合物具有潛在毒性，使得其顯著的抗腫瘤作用未在臨床上貢獻力量。本文圍繞糖苷生物堿具有的獨特靶向抗腫瘤特性，從化學結構、抗腫瘤活性及構效關系三個方面進行綜述，不僅能為這類天然藥物抗腫瘤應用提供科學依據(jù)，而且能為相關科研人員開展糖苷生物堿的抗腫瘤機制研究探索新思路和方向。

1 糖苷生物堿的分布情況

茄科植物中的糖苷生物堿廣泛分布于根、莖、葉、花、果實和種子中，且在不同品種間含量差異較大，不同生長期和不同部位的含量也不同。Liu[2]采用高效液相色譜法對茄子的根、莖、葉、蒂中糖苷生物堿的種類和含量進行分析，結果表明，茄子中4個非可食部分均同時含有α-茄堿、α-卡茄堿、α-澳洲茄堿等3種糖苷生物堿，組成成分相似，且各部位各種糖苷生物堿的含量具有顯著差異，這4個非可食部分糖苷生物堿總量分布順序為：茄蒂>茄根>茄葉>茄莖。龍葵中主要含有茄堿、澳洲茄堿、澳洲茄邊堿和β-澳洲茄邊堿等糖苷生物堿，研究表明糖苷生物堿在龍葵嫩葉中含量較高，且隨葉的長大逐漸減少；在未成熟果實中含量最高，但在果實成熟后則減少甚至消失[3]。在馬鈴薯植株和塊莖中，至少95%的糖苷生物堿是以α-茄堿和α-卡茄堿的形式存在[4]，二者比例取決于品種類型或馬鈴薯解剖部位，一般比例為1∶2～1∶7，大多數(shù)發(fā)現(xiàn)于花、葉和芽中[5]。此外，馬鈴薯糖苷生物堿含量也會隨光照、不同采收時期以及加工處理過程而不斷變化。

2 糖苷生物堿的化學結構

茄科植物中的甾體類生物堿是一組含氮甾體的糖苷衍生物，它們由C27膽甾烷骨架(糖苷配基)組成，其中1～4個單糖的碳水化合物部分附著在配基的3-OH位置，基本連接形式見圖1。碳水化合物部分由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和L-鼠李糖的不同組合組成，迄今為止，已知超過75種天然存在的糖苷配基結構[6]。因為氮被嵌入非氨基酸殘基中，所以這些化合物屬于偽生物堿的一個亞群，即異戊二烯類生物堿。糖苷生物堿的結構變異主要基于糖苷配基，基本結構母核見圖2。在這些結構中，氮的不同附著形式通常會影響化合物的化學性質[7]。氮可以作為一級NH2基團(游離或甲基化)附著，形成簡單的甾體生物堿，環(huán)以骨架形式(作為二級NH)或雙環(huán)以叔氮形式相連。所有類型的糖苷生物堿都能在不同的位置包含雙鍵和羥基，在350多種茄屬植物中目前已鑒定出100余種結構獨特的甾類生物堿。

圖1 連接在3-OH的糖側鏈部分結構Fig.1 The structures of the sugar chains attached to 3-OH

圖2 糖苷生物堿基本母核結構Fig.2 The basic parent nucleus structures of glycoalkaloids

3 糖苷生物堿的抗腫瘤活性

3.1 幾種常見茄科植物糖苷生物堿的抗腫瘤活性

3.1.1 龍葵

龍葵(SolanumnigrumLinn.)作為一種傳統(tǒng)中藥，臨床應用廣泛，具有明確抗腫瘤藥效。龍葵中含量較多的龍葵堿，廣泛存在于茄科植物中，又叫茄堿。Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，龍葵堿通過miR-138/survivin途徑增強了食道癌細胞對化學療法的化學敏感性。此外，龍葵中的澳洲茄邊堿可以抑制HCT116細胞增殖和克隆形成，促HCT116細胞凋亡，其機制與活化Caspase-3相關[9]。另有研究表明，澳洲茄邊堿可能通過線粒體途徑誘導人膽管癌QBC939細胞凋亡，改變細胞凋亡相關蛋白水平[10]。澳洲茄堿可抑制肺癌細胞侵襲，其機制可能與調控MMPs和TIMPs表達有關[11]。多數(shù)研究表明，龍葵鮮果提取物的抗腫瘤活性強于龍葵全草及其干果。Shi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，從龍葵鮮果水提物中分離到的一種新型糖苷生物堿solaoiacid可抑制人肺腺癌A549細胞的生長，其半抑制濃度值為2.3 μmol/L，明顯低于澳洲茄邊堿，該作用可能與其顯著下調脂肪酸合酶-表皮生長因子受體有關。Fekry等[13]從龍葵果皮中分離得到5種糖苷生物堿，研究發(fā)現(xiàn)5種龍葵糖苷生物堿均可將細胞周期阻滯于S期，從而顯著抑制肝癌細胞增殖作用。

3.2.2 白英

白英(SolanumlyratumThunb.)為茄科茄屬植物白英的干燥全草，味苦，性微寒，入肝、胃經(jīng)，具有顯著的清熱解毒功效，臨床廣泛用于治療多種腫瘤。本課題組從白英全草中富集得到含量高達90%的白英總甾體糖苷生物堿(TSGS)，前期對白英總皂苷、TSGS及其二者配伍樣品的抗腫瘤作用進行了比較研究，證明TSGS具有與抗腫瘤一線藥物紫杉醇相當?shù)膬?yōu)良抗腫瘤作用，對動物整體體重無顯著影響并能延長生存期[14]。此外，TSGS的急性毒理學和長期毒理學，以及安全藥理學研究均未見明顯毒性[15]，進一步反映了其作為抗腫瘤藥物的高安全性。目前已從白英中分離得到20余種新型甾體糖苷生物堿。Du等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TSGS和一種新型白英糖苷生物堿能夠通過抑制A549細胞來源的外泌體的促血管生成活性發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用。Han等[17]從白英中分離得到4種結構相似的糖苷生物堿(圖3)，進一步研究發(fā)現(xiàn)這些化合物或其他結構相似的糖苷生物堿具有潛在的抗腫瘤血管生成活性。這一結果提示，白英的抗腫瘤活性可能與其所含糖苷生物堿的結構有關。

圖3 具有抗腫瘤活性的糖苷生物堿結構[17]Fig.3 The structures of glycoalkaloids with antitumor activity

3.3.3 其他

番茄(SolanumlycopersicumL.)中富含的α-番茄堿在癌癥治療領域中起著不可小覷的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度下，α-番茄堿能夠抑制人結腸癌HT29和肝癌HepG2以及正常肝細胞的生長，效果明顯好于阿霉素和喜樹堿等常規(guī)抗癌藥[18]。Friedman等[19]采用MTT法檢測6種青番茄和3種紅番茄提取物在人類癌癥和正常細胞中誘導細胞死亡的能力。結果表明，青番茄提取物中含有較高的番茄堿，且能夠顯著抑制人乳腺癌MCF-7、人結腸癌HT-29、人胃癌AGS、人肝癌HepG2細胞生長，對正常人肝細胞也具有抑制作用。提示番茄堿在殺傷癌細胞的同時也會一定程度損害正常細胞。

洋茄(SolanumlycocarpumSt.Hil.)中同樣富含具有抗腫瘤藥理活性的糖苷生物堿。Carvalho等[20]以天然脂質納米粒(NLN)為載體，研究了富含澳洲茄堿(86%)和澳洲茄邊堿(89%)的洋茄果提取物(AE)在膀胱癌細胞中的抗腫瘤活性。結果顯示，游離AE在膀胱癌細胞中具有一定的抗腫瘤活性。此外，在NLN包埋AE后，細胞活力下降5.4倍，提示NLN-AE比游離AE具有更高的抗增殖活性。

3.2 糖苷生物堿的抗腫瘤作用機制

3.2.1 Hedgehog信號傳導途徑

Hedgehog(Hh)信號通路在胚胎發(fā)育、細胞維持和細胞增殖中起著至關重要的作用。多數(shù)研究表明，Hh信號在不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿可能通過作用于Gli來抑制Hh信號通路。同時，澳洲茄堿可明顯抑制小鼠胚胎成纖維細胞C3H10T1/2中的堿性磷酸酶活性，降低Gli1和Ptch1的mRNA表達，但對由PGE2或TNF-α激發(fā)的轉錄因子活性沒有影響，因此表明其具有能夠選擇性抑制Hh通路活性。此研究結果恰好與另一篇報道[22]相吻合，提示澳洲茄堿可作為Gli抑制劑來對抗當前Smo蛋白抑制劑耐藥的良好候選。

3.2.2 Caspase非依賴的細胞凋亡途徑

凋亡是一種程序性細胞死亡，凋亡的級聯(lián)反應可以通過兩種主要途徑啟動，即內(nèi)源性途徑和外源性途徑。內(nèi)源性途徑，也稱為線粒體途徑，可以觸發(fā)細胞色素C從線粒體釋放。外源性途徑，也稱為死亡受體途徑，是由死亡受體與激活的配體相結合。半胱天冬酶(Caspase)活化是兩種主要凋亡途徑的共同特征。除此之外，還存在Caspase非依賴的細胞死亡形式[23]。α-番茄堿對人白血病癌細胞HL60和K562有明顯的細胞毒性作用。此外，α-番茄堿通過Caspase非依賴的細胞死亡誘導HL60和K562細胞凋亡。即使使用泛Caspase抑制劑z-VAD-fmk預處理細胞，也不會逆轉α-番茄堿誘導的細胞凋亡[24]。提示α-番茄堿誘導的細胞死亡與Caspase激活無關。Kim等[25]研究發(fā)現(xiàn)，α-番茄堿能夠顯著誘導CT-26結腸癌細胞凋亡，并且抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長。Western blot結果表明凋亡誘導因子定位于細胞核，凋亡抑制蛋白survivin表達下調，并且未能檢測到在CT-26細胞中蛋白裂解產(chǎn)生的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性形式。提示α-番茄堿主要通過Caspase非依賴的信號傳導途徑誘導CT-26細胞死亡。

3.2.3 細胞周期

CDKs(細胞周期依賴性蛋白激酶)的激活對于細胞從G1過渡到S期至關重要，而細胞周期蛋白的周期性表達調控著細胞周期蛋白的轉運。細胞周期調節(jié)蛋白Cyclin D/E與CDK2、4或6形成復合物并激活它們，從而促進細胞從G1期過渡到S期[26,27]。P21是一種CDK抑制劑(CKDI)，調節(jié)G1/S期過渡的負反饋，P21表達的增加阻斷了G1/S過渡的進程[28,29]。Pan等[30]采用qPCR和Western blot方法檢測茄堿對前列腺癌細胞DU145細胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，茄堿可以顯著下調Cyclin D1/E1、CDK4和CDK6的表達，上調P21，表明茄堿會影響G1/S轉換信號，阻止G1/S轉換的進行，在體內(nèi)抑制癌細胞的生長和腫瘤的生長。Fekry等[31]從茄子皮的甲醇提取物中分離出具有抗肝癌活性的糖苷生物堿，采用流式細胞儀和FITC膜聯(lián)蛋白V染色法分析這些化合物的潛在作用機制，結果顯示，澳洲茄堿、澳洲茄胺和澳洲茄邊堿均可使人肝癌細胞(Huh7和HepG2)阻滯于S期，從而顯著抑制肝癌細胞增殖。

3.2.4 ROS途徑

ROS(活性氧簇)在腫瘤發(fā)生和轉移方面起著重要作用[32]。最近的研究表明，調節(jié)ROS可以通過加速腫瘤細胞死亡來達到治療目的[33]。腫瘤細胞中的ROS含量很高，始終處于氧化應激狀態(tài)，因此比健康細胞具有更高的敏感性。ROS主要通過促進細胞凋亡，誘導細胞壞死和調節(jié)細胞自噬性死亡來抑制癌癥的發(fā)展[34,35]。最新研究發(fā)現(xiàn)，茄堿能夠顯著抑制前列腺癌細胞DU145生長。使用一種活性氧清除劑NAC可以顯著減少由茄堿誘導的細胞死亡。P38 MAPK激酶的阻斷不能抑制ROS，但可以抑制茄堿誘導的細胞凋亡。同樣，NAC對ROS的抑制也會使P38通路失活。因此，茄堿可能是通過誘導ROS，促進P38激活，誘導腫瘤細胞凋亡[30]。

4 糖苷生物堿的抗腫瘤構效關系

糖苷生物堿因其具有重要的生物活性而受到人們的重視。一些研究表明，甾體糖苷生物堿中糖苷配基與糖部分的不同組合使其具有不同的結構，而化學結構決定了其生物活性。多數(shù)研究證實，糖苷生物堿的生物活性取決于附著在糖苷配基3-OH位置上的糖殘基。甾體苷元上的糖側鏈中單糖的種類、數(shù)目、連接方式以及苷元本身都影響著糖苷生物堿的抗腫瘤活性。在糖鏈被逐個水解后，可能使得糖苷生物堿對于腫瘤細胞的親和性降低，使糖苷生物堿無法通過細胞膜進入細胞體內(nèi)，從而影響了糖苷生物堿的抗腫瘤活性。

Li等[36]采用MTT法檢測α-澳洲茄邊堿和α-澳洲茄堿及其衍生物對HCT-8腫瘤細胞的抗增殖活性。結果表明，兩種糖苷生物堿均具有較強的細胞毒活性，而其水解衍生物的活性相對較低[37]，進一步證實了糖生物堿的糖鏈在抗腫瘤活性中起著重要的作用。

目前發(fā)現(xiàn)糖苷生物堿中的鼠李糖基在細胞凋亡和壞死過程中發(fā)揮關鍵作用[38]，而其抗腫瘤活性隨著鼠李糖數(shù)目的增加而增強[37]。基于腫瘤細胞富含鼠李糖結合蛋白[39]，鼠李糖對鼠李糖結合受體有高度的親和性這一特點，Wang[40]通過生物素化的糖和鏈霉親和素鍵合的量子點結合，建立一種原位觀察腫瘤細胞膜表面鼠李糖結合凝集素的方法，對不同腫瘤細胞膜表面鼠李糖結合凝集素(RBL)受體的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤細胞或組織存在不同的RBL受體的表達，RBL受體高表達的腫瘤細胞對皂苷更為敏感。提示腫瘤細胞膜表面的RBL受體在介導糖苷生物堿的抗腫瘤活性方面發(fā)揮著重要的作用[41]。

Han等[17]研究發(fā)現(xiàn)，從白英中分離得到的4種糖苷生物堿均可抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞Td-ECs的增殖、遷移、侵襲和管腔樣結構的形成，表明其具有潛在的抑制腫瘤血管生成作用，并且抑制作用的強弱可能與糖苷生物堿的甾體母核5/6位的飽和程度以及糖鏈部分的糖基組成有關。結果顯示，在只有甾體母核5/6位的飽和程度存在區(qū)別的情況下，飽和單鍵具有更強的細胞抑制作用；在只有糖鏈部分存在區(qū)別時，含四個糖基(木糖、半乳糖和兩個葡萄糖)的抑制作用強于含三個糖基(一個半乳糖和兩個葡萄糖)的糖苷生物堿，提示糖鏈中的木糖殘基可能發(fā)揮重要作用(見圖3)。

此外，糖苷生物堿具有與膽固醇以1∶1的結合，形成不溶性復合物的基本性質[42]。脂筏是生物膜脂質雙層上富含膽固醇、具有豐富功能的微結構域，是細胞信息處理樞紐，對外泌體形成及其功能發(fā)揮均至關重要。腫瘤細胞膽固醇含量明顯高于正常細胞，甚至腫瘤外泌體膜膽固醇含量高達其親本細胞的四倍[43]?；谏鲜鍪聦崳珼u等[16]研究了茄屬植物白英中的糖苷生物堿對人肺腺癌A549細胞來源的外泌體功能的影響。研究結果表明，A549來源的外泌體可以顯著增強人臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管生成能力，而白英糖苷生物堿的干預可以顯著抑制A549來源的外泌體的血管生成能力。這些結果表明，白英糖苷生物堿通過凝集腫瘤細胞膜脂筏膽固醇干擾外泌體功能而發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用。

5 總結與展望

綜上所述，糖苷生物堿能夠抑制多種腫瘤細胞生長，臨床應用前景廣泛。目前，國內(nèi)外對糖苷生物堿的化學結構和抗腫瘤活性的相互作用關系研究較少，其抗腫瘤作用機制及其作用靶點尚未得到闡明。近年來，本課題組已從茄屬植物白英中分離得到近40個活性糖苷生物堿，對其抗腫瘤活性和作用機制的相關研究正在進行中。

縱觀國內(nèi)外有關糖苷生物堿的研究進展，我們發(fā)現(xiàn)關于該類化合物的化學成分和藥理活性的研究居多，未見有人提出并揭示其獨特的化學結構具備何種深入藥理機制的問題，限制了糖苷生物堿類藥物的進一步開發(fā)和利用。本文首次以茄科糖苷生物堿為例，將其化學結構與抗腫瘤活性進行綜述，總結其抗腫瘤構效關系，并對其可能的抗腫瘤作用機制進行了討論。糖苷生物堿發(fā)揮抗腫瘤作用的機制主要包括四個方面：抑制Hedgehog途徑，通過Caspase非依賴的信號傳導途徑誘導細胞凋亡，阻斷細胞周期，以及誘導ROS途徑。相信隨著廣大學者對糖苷生物堿的抗腫瘤構效關系的不斷探索，深入研究其抗腫瘤作用機制，糖苷生物堿將成為抗腫瘤新藥研發(fā)的熱點，具有極大的研究意義。