木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯對小鼠B16黑色素瘤細胞增殖和凋亡的影響

劉 蕊，張景照，王丹丹，劉海霞，唐旭東*

1深圳清華大學研究院創(chuàng)新中藥及天然藥物研究重點實驗室；2廣東省創(chuàng)新中藥及天然藥物研究工程中心，深圳 518057

黑色素瘤，又稱惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)，被稱為“皮膚癌王”，是皮膚癌當中最危險的一種，增殖能力極強，是導致死亡人數(shù)最多的皮膚癌[1.2]。中國黑色素瘤檢出率增加，每年新發(fā)病持續(xù)增長[3]。目前，常規(guī)治療黑色素瘤的主要方法是手術(shù)、放療和化療，但存在創(chuàng)傷大、不良反應(yīng)明顯。木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯是木香的主要活性物質(zhì)。木香是我國知名傳統(tǒng)中藥?！吨袊幍洹?2015版)收錄木香為菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根[4]?！吨袊参镏尽穼⒛鞠阒糜诰湛骑L毛菊屬Saussurea，所以木香的拉丁名又為Saussureacostus(Falc.) Lipech.。藥典記載具有行氣止痛，健脾消食。用于胸脅、脘腹脹痛，瀉痢后重，食積不消，不思飲食。煨木香實腸止瀉。用于泄瀉腹痛[4]?！侗静萃ㄐ酚涊d木香外用研末調(diào)敷或密汁涂，可“理疝氣”。木香外用還具有抑菌，治療乳腺增生等功效?，F(xiàn)代研究表明木香提取物、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯等具有多種藥理活性，如抗炎[5]、促胃動力作用[6,7]、利膽[5,8]、抗支氣管痙攣[9]和抗腫瘤[10]等。但是，目前對木香提取物、木香烴內(nèi)酯(圖1)和去氫木香烴內(nèi)酯抗黑色素瘤的研究甚少。僅有報道稱木香烴內(nèi)酯能抑制IBMX-誘導的B16細胞黑色素的生成[11]，文中側(cè)重點是木香中單體化合物的分離和鑒定，并從美白化妝品的角度分析化合物對黑色素產(chǎn)生的影響。本文將研究木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯單體化合物抗黑色素瘤增殖和凋亡的影響，并進一步深入研究其作用機制，旨在為抗黑色素瘤創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

圖1 化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of compounds

1 材料與儀器

1.1 材料

小鼠B16黑色素瘤細胞(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)；木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯(純度﹥98%)(成都曼思特生物科技有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、雙抗、PBS、胎牛血清(Gibco公司)；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和DAPI染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)；抗體Ki-67、PI3K、Bax、Bcl-2、β-Actin(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYA公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；高壓濕熱滅菌器(日本SANYA公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；Airstream II級A2型生物安全柜(新加坡藝思高公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；Tanon化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

小鼠B16黑色素瘤細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/mL鏈霉素及100 U/ mL青霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2天更換培養(yǎng)基，細胞長至70%～80%融合度時，細胞傳代培養(yǎng)。

2.2 細胞增殖測定

取對數(shù)生長期的小鼠B16黑色素瘤細胞，顯微鏡下細胞計數(shù)后，細胞濃度調(diào)整為1×105個/mL，接種到96孔板，每孔100 μL細胞液，即1×104個/孔，細胞貼壁生長過夜后，分別加入100 μL含藥的新鮮培養(yǎng)基，藥物濃度設(shè)置為3.125、6.25、12.5、25、50 μM，同時設(shè)有未加藥的空白對照組，每組設(shè)置6個復孔，分別培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT溶液，細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入200 μL DMSO，酶標儀A570nm測定吸光度值。

細胞增殖抑制率=(A空白組-A給藥組)/A空白組

×100%

2.3 DAPI染色

取3 mL 1×105個/mLB16細胞液，接種到置有玻片的60 mm培養(yǎng)皿中，貼壁生長過夜后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度藥物的新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置空白對照組，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用PBS洗兩次，加入預(yù)冷的75%的乙醇，4 ℃冰箱內(nèi)固定過夜，棄去固定液，加入PBS洗3次，加入DAPI染色液，37 ℃避光30 min，PBS洗后，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并拍照分析。

2.4 流式細胞儀FCM檢測分析細胞凋亡

取3 mL 1×105個/mL B16細胞液，接種到的60 mm培養(yǎng)皿中，貼壁生長過夜后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度藥物的新鮮培養(yǎng)基，設(shè)不加藥物組為對照組。置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 rpm離心5 min，棄上清，用PBS洗兩遍，用PBS重懸細胞，取1×104個重懸細胞，離心后，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻，加入10 μL PI，輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，隨后置于冰上，流式細胞儀檢測，進行凋亡率分析。

2.5 Western blot檢測凋亡蛋白

分別收集對照組細胞，及不同濃度藥物處理48 h的B16細胞，加入配置好的含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液冰上充分裂解，提取蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照蛋白樣品與5×loading buffer體積比4∶1制備，95度8 min變性。取40 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋好的一抗(表2)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入顯影液，Tanon化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，采集圖像，進行條帶分析。

2.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差來表示。用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，用One-way ANOVA進行分析，方差齊性采用F檢驗，組間兩兩比較采用Fisher’s Protected LSD test分析，P<0.05判定為統(tǒng)計學上差異顯著，P<0.01判定為統(tǒng)計學上差異極顯著。

3 結(jié)果與討論

3.1 對B16細胞增殖的影響

木香烴內(nèi)酯(CL)和去氫木香內(nèi)酯(DL)處理小鼠B16黑色素瘤細胞24、48 h后，和未給藥空白對照組相比，能明顯抑制小鼠B16黑色素瘤細胞增殖(圖2和圖3)。CL和DL在0～100 μmol/L處理B16細胞時，抑制率隨著濃度的增加而增大；且隨著時間的增加，抑制率也在增大。如濃度為25 μmol/L的CL對B16細胞24 h時的抑制率為42.01%，48 h時抑制率為62.23%(圖2)。CL處理B16細胞24 h，48 h的IC50值分別為28.34 μmol/L和19.21 μmol/L。如濃度為25 μmol/L 的DL對B16細胞24 h時的抑制率為40.21%，48 h時抑制率為60.06%(圖3)。DL處理B16細胞24 h，48 h的IC50值分別為29.54 μmol/L和21.22 μmol/L。可見，CL和DL均具有抗B16黑色素瘤細胞的潛在能力，值得進一步深入研究。

圖2 木香烴內(nèi)酯(CL)對B16細胞增殖的影響Fig.2 The effect of costunolide on proliferation of B16 cells注：與空白對照組比較，*P<0.05，具有顯著性差異； **P<0.01，具有極顯著性差異，下同。Note:Compared with blank control,*P<0.05,significant difference;**P<0.01,extremely significant difference,the same below.

圖3 去氫木香內(nèi)酯(DL)對B16細胞增殖的影響Fig.3 The effect of dehydrocostus lactone on proliferation of B16 cells

3.2 細胞形態(tài)變化

CL和DL處理B16細胞后，顯微鏡下觀察細胞的數(shù)目明顯減少，出現(xiàn)收縮，消解現(xiàn)象。DAPI染色后在倒置顯微鏡下觀察CL對B16細胞形態(tài)的影響(圖4)，CL處理B16細胞48 h后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，主要是凋亡相關(guān)形態(tài)學的改變，包括細胞收縮、高染色質(zhì)凝聚、凋亡體的可見形成和核降解。說明CL引起了B16細胞凋亡。

3.3 流式細胞儀分析B16細胞凋亡率

流式細胞儀檢測CL誘導B16細胞凋亡，不同濃度的CL處理B16細胞48 h后，流式檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CL能顯著誘導B16細胞凋亡，增加細胞凋亡數(shù)目，而且隨著濃度的增加，細胞凋亡率也在增加。CL處理細胞48 h后，濃度為25 μmol/L的CL誘導35.1%的B16細胞凋亡；濃度為50 μmol/L的CL誘導50.2%的B16細胞凋亡；濃度為100 μmol/L的CL誘導57.6%的B16細胞凋亡(圖5)。流式結(jié)果，結(jié)合顯微鏡觀察結(jié)果，明確了CL能夠誘導B16黑色素瘤細胞凋亡。

圖4 CL對B16細胞形態(tài)變化的影響(DAPI染色)Fig.4 Effect of CL on morphology of B16 cells (DAPI staining)

圖5 流式細胞儀分析木香烴內(nèi)酯對B16細胞的凋亡率Fig.5 The apoptosis rate analysis of FCM in B16 cells

3.4 凋亡蛋白

Western blot實驗結(jié)果表明，CL處理組B16細胞48 h后，不同濃度(25、50、100 μmol/L)CL組細胞內(nèi)Cyt-C、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達明顯升高，并成濃度依賴性促進B16細胞凋亡，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖6)。

圖6 Western blot分析木香烴內(nèi)酯對B16凋亡相關(guān)蛋白表達Fig.6 The apoptosis protein changes of CL in B16 cells analyzed by Western blot

3.5 PI3K/AKT通路

Western blot實驗結(jié)果表明，不同濃度木香烴內(nèi)酯(25、50、100 μmol/L)處理B16細胞48 h后，能夠抑制B16惡性黑色素瘤細胞中PI3K和AKT蛋白的表達(圖7)。這種抑制作用呈現(xiàn)出濃度趨勢，濃度越高抑制作用越明顯。PI3K/AKT信號通路調(diào)控細胞增殖和凋亡，對該通路的調(diào)控，能夠影響B(tài)cl-2家族蛋白的活性。

實驗證實，木香烴內(nèi)酯確實能抑制B16黑色素瘤細胞中Bcl-2的表達，并促進Bax蛋白表達(圖7)。細胞內(nèi)與線粒體膜通透性蛋白Bax發(fā)生作用的Bcl-2蛋白受到了木香烴內(nèi)酯的抑制，從而線粒體膜通透性得到了提高，線粒體釋放Cyt-C，促進caspase-9和caspase-3的表達，最終促進B16細胞發(fā)生凋亡。

圖7 Western blot分析CL對B16細胞PI3K/AKT通路的作用Fig.7 Effect of CL on PI3K/AKT pathway in B16 cells

惡性黑色素瘤被稱為“皮膚癌王”，是皮膚癌致死的主要元兇。目前手術(shù)、放療和化療對于惡性黑色素瘤的治療不明朗，存在一系列的問題，如手術(shù)造成的創(chuàng)傷和術(shù)后后遺癥；化療藥物的副作用脫發(fā)、惡心、肝腎損傷；放療不敏感等。中藥是天然藥物的寶庫，在中醫(yī)理論的指導下，借鑒現(xiàn)代醫(yī)學手段，越來越受到科學家和醫(yī)學工作者的重視。木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯能夠抑制B16細胞增殖，并成濃度和時間依賴。據(jù)報道，木香烴內(nèi)酯能夠抑制黑色素瘤細胞SK-MEL-2的增殖，并成濃度依賴趨勢，木香烴內(nèi)酯處理細胞48 h后，IC50為0.5 μg/mL，文中未對抑制增殖機理、細胞凋亡和作用機制進行研究[12]。誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌的主要思路之一。木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯是木香的主要成分，木香是一些中成藥的常見成分，可內(nèi)服，可外用。CL誘導B16細胞凋亡可能是通過線粒體釋放Cyt-C從而激活caspase凋亡通路，最終引起B(yǎng)16細胞凋亡，起到抗黑色素瘤的作用。Ding等[13]研究表明細胞色素C參與新狼毒素A誘導人黑色素瘤A375細胞凋亡過程，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達。這與文獻報道木香烴內(nèi)酯誘導肺癌A549細胞凋亡的途徑一致[14]，木香烴內(nèi)酯還能促進激活促凋亡因子Bax的表達和抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達來抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖，并促進其凋亡[15]。去氫木香內(nèi)酯引起線粒體跨膜電位降低而破壞了線粒體的結(jié)構(gòu)，進一步阻礙了線粒體的功能，導致了細胞內(nèi)代謝物的紊亂，最終誘導了人類乳腺癌細胞 MCF-7細胞的凋亡[11]。木香中部分有效成分的抗腫瘤機制通過引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)、細胞色素C釋放或破壞線粒體膜電位而誘導人白血病細胞HL-60凋亡[16]。

本文發(fā)現(xiàn)CL和DL能抑制小鼠黑色素瘤細胞B16的增殖，并能誘導B16細胞凋亡。研究表明，木香烴內(nèi)酯通過抑制惡性黑色素瘤細胞中PI3K/AKT通路激活，抑制Bcl-2蛋白的表達，促進線粒體膜通透性蛋白Bax的表達，使線粒體膜通透性增加，釋放了細胞色素C，從而促進caspase-9和caspase-3的表達，最終促進B16細胞發(fā)生凋亡。本文為開發(fā)出以木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為原料的抗黑色素瘤創(chuàng)新中藥提供理論依據(jù)，為抗黑色素瘤提供新的解決思路。