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    EGCG聯(lián)合順鉑抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖、侵襲及遷移作用的實(shí)驗(yàn)研究

    2020-02-02 01:20:56鄒日昌宋嘉琪殷嫦嫦

    黃 磊,鄒日昌,宋嘉琪,羅 超,殷嫦嫦

    1南昌大學(xué) 研究生院醫(yī)學(xué)部;2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科,南昌 330006;3撫州市立醫(yī)院骨科,撫州 344000;4九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,九江 332000

    骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是骨最常見(jiàn)的惡性腫瘤,好發(fā)于長(zhǎng)骨的干骺端,常見(jiàn)于兒童和青少年,惡性程度高,預(yù)后差,容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,手術(shù)切除聯(lián)合新輔助化療、輔助化療相結(jié)合為OS的主要治療方式[1],在臨床治療中,多柔比星、順鉑、異環(huán)磷酰胺等是常用于治療骨肉瘤的化療藥物。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步,新輔助化療能夠有效提高患者5年生存率,但仍有30%~40%患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,尤其是對(duì)于已出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移者,往往導(dǎo)致呼吸衰竭,預(yù)后極差[1-2]。因此,尋找新的治療OS的方法已經(jīng)成為近幾年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。

    茶文化在我國(guó)有幾千年的文化歷史,茶中的主要活性成分為兒茶素,包括沒(méi)食子酸兒茶素(gallocatechin,GC)、表沒(méi)食子酸兒茶素(epigallocatechin,ECG)、表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸磷脂(epigallocatechin gallate,EGCG)及表兒茶素(EC)等[3]。EGCG是一類(lèi)既親水又親脂的兩性分子,能夠在體液中充分溶解,輕松穿過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)相結(jié)合[3]。大量研究表明EGCG含有多種活性基因,具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用,這些基團(tuán)可以與轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子、蛋白激酶、細(xì)胞因子和酶等多種分子靶點(diǎn)結(jié)合而相互作用,導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。因此EGCG是一類(lèi)理想的潛在抗癌藥物。已有研究報(bào)道EGCG能夠抑制宮頸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及胰腺癌細(xì)胞的增殖,在預(yù)防肝膽腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4-6]。順鉑(cisplatin,CDDP)為骨肉瘤臨床治療中常用的化療藥物,在近年來(lái)的臨床治療中,多應(yīng)用以CDDP為核心的聯(lián)合化療方案治療骨肉瘤患者,且聯(lián)合用藥能夠很好的提高療效、降低耐藥性。但是CDDP的副作用較大,最主要的就是腎毒性[7],往往造成急性腎損傷,并呈劑量、時(shí)間相關(guān)性,這也在一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用。大量抗氧化復(fù)合物如番茄紅素[8]、銀杏果提取物[9]、迷迭香[10]等均能減輕CDDP的腎毒性,EGCG是一類(lèi)抗氧化酶,具有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用,在醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,已有研究報(bào)導(dǎo)EGCG能夠通過(guò)提高細(xì)胞的抗氧化能力達(dá)到減少CDDP對(duì)細(xì)胞的損傷[11]。本研究將ECGC聯(lián)合CDDP作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞,探討其抑制骨肉瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制,為臨床尋找高效、低毒的新型抗癌化療方案提供新的策略。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室凍存,EGCG(美國(guó)Sigma公司,純度≥98%),順鉑(美國(guó)Sigma公司),胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);兔抗人Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9、Caspase-3、cleaved Caspase-3抗體(美國(guó)Proteintech 公司);CCK-8試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司);Transwell(美國(guó)Millipore公司);25 cm2塑料培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司);AnnexinⅤ-PE/7AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (BD公司);BCA蛋白定量分析試劑盒(北京Solarbio公司);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);封閉奶粉(蒙牛公司);倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司);酶標(biāo)儀、電泳槽(美國(guó)BIO-RAD公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Eppendorf公司)。

    2 方法

    2.1 器材準(zhǔn)備

    本實(shí)驗(yàn)所需要使用的器械及其他材料均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽鍋高溫(126 °C)滅菌30 min以上,再放入烘箱中干燥,備用。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及細(xì)胞形態(tài)觀察

    將骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的7 mL培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng),隔天換液,換液時(shí)使用PBS清洗,當(dāng)細(xì)胞達(dá)75%~85%匯合率時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。分別用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀況及形態(tài)變化。EGCG聯(lián)合CDDP實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、EGCG組(60 μmol/L)、CDDP組(60 μmol/L)、聯(lián)合用藥組(EGCG 60 μmol/L+CDDP 60 μmol/L)。

    2.3 CCK-8法檢測(cè)不同藥物對(duì)MG-63細(xì)胞活力的影響

    調(diào)整MG-63細(xì)胞至1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板,DMEM培養(yǎng)基至每孔100 μL,設(shè)置濃度梯度,EGCG組:0(對(duì)照組)、20、40、60、80、100 μmol/L;CDDP組:0(對(duì)照組)、20、40、60、80、100 μmol/L,每組細(xì)胞接種5個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后加入不同濃度EGCG及CDDP,常規(guī)培養(yǎng)72 h后每孔加入CCK-8試劑100 μL,孵育2 h后酶標(biāo)儀測(cè)定其450 nm處吸光度值(A),取對(duì)照組抑制率為0%。后收集各組培養(yǎng)基,加入乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒中的NAD+/INT/diaphorase配置成的混合液,室溫下孵育30 min,最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板中490 nm波長(zhǎng)處的吸光度,吸光度值表示LDH水平,以培養(yǎng)基中LDH水平反映細(xì)胞壞死情況。

    2.4 Transwell侵襲試驗(yàn)

    將Transwell小室放入24孔板中,在小室的上室中加入50 μL Martrigel基質(zhì)膠(Martrigel膠與無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基1∶8稀釋),置于37 ℃培養(yǎng)箱中,風(fēng)干5 h,待Martrigel基質(zhì)膠凝固后棄去上層培養(yǎng)液,收集MG-63細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL,接種于Transwell小室的上室中,加入EGCG組、CDDP組、聯(lián)合用藥組(EGCG+CDDP)培養(yǎng)液(分組同“2.1”),以DMSO為對(duì)照,下室加入500 μL含20% FBS培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出小室,用棉簽試去小室膜內(nèi)層細(xì)胞,置于4%多聚甲醛固定15 min,風(fēng)干后置于結(jié)晶紫中染色20 min,超純水洗滌,干燥后將小室倒置于顯微鏡下,隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)侵襲至小室下層的細(xì)胞,計(jì)算平均值。

    2.5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

    胰蛋白酶消化MG-63細(xì)胞后接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%左右時(shí)用100 μL槍頭在孔中劃一條直線(xiàn),PBS漂洗后,加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基與EGCG組、CDDP組、聯(lián)合用藥組(EGCG+CDDP)培養(yǎng)液(分組同“2.1”),每組重復(fù)3次,分別培養(yǎng)24、48 h后拍照。

    2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EGCG聯(lián)合CDDP對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響

    分別收集對(duì)照組、EGCG組、CDPP組和聯(lián)合用藥組MG-63細(xì)胞后轉(zhuǎn)入5 mL離心管中,1 000 ×g 4 ℃離心10 min,收集細(xì)胞,棄上清。用預(yù)冷PBS液洗細(xì)胞2次,棄上清,收集細(xì)胞沉淀,將細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL Annexin V-PE混勻后加入5 μL 7-ADD,混勻后于室溫避光孵育15 min。1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

    2.7 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

    同“2.1”方法分組培養(yǎng)48 h后,PBS漂洗后分別提取各組細(xì)胞總蛋白,使用BCA法測(cè)定各組蛋白濃度,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,之后將膠內(nèi)蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后再用相應(yīng)二抗孵育2 h,適當(dāng)漂洗,化學(xué)發(fā)光后放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察條帶,分析結(jié)果。目的蛋白包括Bax、Bcl-2、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9、Caspase-3、及cleaved Caspase-3。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用單因素方差分析,并通過(guò)Scheffe檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 形態(tài)學(xué)觀察

    顯微鏡下見(jiàn)空白對(duì)照組MG-63細(xì)胞貼壁良好,細(xì)胞形態(tài)大小不一,分布均勻,多呈梭形,胞核清晰,胞質(zhì)均勻透亮;EGCG組可見(jiàn)部分細(xì)胞脫落降解,貼壁細(xì)胞數(shù)減少,部分脫落細(xì)胞形態(tài)由梭形變圓,變小,細(xì)胞間距增大,且隨著藥物濃度梯度增加細(xì)胞死亡數(shù)量越多;CDDP組可見(jiàn)較多細(xì)胞脫落,貼壁細(xì)胞密度減低,也隨藥物濃度梯度的增加細(xì)胞死亡數(shù)也增加;聯(lián)合用藥組可見(jiàn)大量細(xì)胞壞死脫落,細(xì)胞數(shù)量急劇減少,培養(yǎng)液中可見(jiàn)較多懸浮死細(xì)胞,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也愈加明顯(圖1)。

    3.2 不同濃度EGCG及CDDP均能抑制MG-63細(xì)胞增殖

    如圖2所示,CCK-8結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,不同濃度的EGCG及CDDP均能不同程度抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖(P<0.05),造成細(xì)胞活力下降,且隨著藥物濃度的增加,對(duì)細(xì)胞的抑制作用愈加明顯(P<0.05)。各組分別取100 μL細(xì)胞上清于酶標(biāo)板中檢測(cè)LDH釋放率,各組LDH釋放量如下:對(duì)照組LDH釋放量約為0.86±0.17 μU/mL,EGCG組、CDDP組釋放量分別為1.63±0.21 μU/mL與2.18±0.37 μU/mL,而聯(lián)合用藥組中約為5.61±0.53 μU/mL,表明單藥組中LDH釋放量水平均高于空白對(duì)照組,而聯(lián)合用藥組中LDH釋放量最高(P均<0.05),EGCG組及CDDP組兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在EGCG、CDDP濃度超過(guò)60 μmol/L后抑制率曲線(xiàn)進(jìn)入平臺(tái)期,表明這也是藥物效果最佳濃度。

    3.3 EGCG聯(lián)合CDDP對(duì) MG-63細(xì)胞增殖抑制作用更為顯著

    分別使用EGCG、CDDP單藥及EGCG+CDDP聯(lián)合用藥作用于MG-63細(xì)胞(分組同“2.1”),結(jié)果如圖3示,與對(duì)照組、ECGC組及CDDP組相比,聯(lián)合用藥組在不同時(shí)間(24、48、72 h)對(duì)MG-63細(xì)胞抑制作用更為顯著,表明加入EGCG聯(lián)合用藥后能夠增強(qiáng)CDDP對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖抑制作用,且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用也更強(qiáng)(P<0.05)。

    圖1 不同時(shí)間EGCG組、CDDP組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞生長(zhǎng)情況(×100)Fig.1 Cell growth in EGCG group,CDDP group and combination group at different time (×100)

    圖2 EGCG與CDDP對(duì)MG-63細(xì)胞抑制率(n=3)Fig.2 Inhibition rate of EGCG and CDDP on MG-63 cells (n=3)

    圖3 不同時(shí)間EGCG組、CDDP組及EGCG 聯(lián)合CDDP組對(duì)MG-63細(xì)胞抑制率(n=3)Fig.3 Inhibition rate of MG-63 cells in EGCG group, CDDP group and combination group at different time(n=3)注:與對(duì)照組相比,*P<0.05;與EGCG組相比,#P<0.05;與CDDP組相比,▲P<0.05;下同。Note:Compared with the control group,*P<0.05;Compared with the EGCG group,#P<0.05;Compared with the CDDP group,▲P<0.05;the following is the same.

    3.4 EGCG聯(lián)合CDDP抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的侵襲能力

    用不同濃度EGCG、CDDP及聯(lián)合用藥組處理MG-63細(xì)胞,采用Transwell小室法檢測(cè)對(duì)MG-63細(xì)胞的侵襲能力,結(jié)果如圖4所示,對(duì)照組及DMSO組穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)分別為296.74±56.61個(gè)和275.26±31.12個(gè),EGCG組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為176.23±16.76個(gè),CDDP組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為121.26±10.15個(gè),聯(lián)合組穿個(gè)小室膜的細(xì)胞數(shù)為42.69±9.96個(gè),與對(duì)照組相比,EGCG組及CDDP組穿過(guò)小室膜細(xì)胞數(shù)均減少,MG-63細(xì)胞侵襲能力減弱;聯(lián)合用藥組穿過(guò)小室膜細(xì)胞數(shù)減少更為顯著,作用更明顯,表明聯(lián)合用藥對(duì)MG-63細(xì)胞的侵襲能力抑制作用最強(qiáng),加入EGCG后能夠增強(qiáng)CDDP對(duì)骨肉瘤MG-63的抑制作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖4 Transwell小室法檢測(cè)EGCG、CDDP及聯(lián)合用藥對(duì)MG-63細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Using Transwell chamber assay to detect the effects of EGCG,CDDP and their combination on the invasive ability of MG-63 cells

    3.5 EGCG聯(lián)合CDDP對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移能力影響

    細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組藥物對(duì)MG-63細(xì)胞遷移能力影響,結(jié)果如圖5所示,相比于對(duì)照組,EGCG組及CDDP組MG-63細(xì)胞遷移能力均下降,EGCG單藥組細(xì)胞劃痕劃痕面積愈合率為53.25%±6.21%,CDDP單藥組細(xì)胞劃痕面積愈合率為43.27%±5.76%,并伴隨少量細(xì)胞的脫落壞死,細(xì)胞向中線(xiàn)增殖減慢;而EGCG+CDDP聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移能力明顯減弱,細(xì)胞劃痕愈合率為22.69%±3.88%,幾乎未見(jiàn)細(xì)胞向中線(xiàn)增長(zhǎng),表明EGCG聯(lián)合CDDP能更有效的抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖,聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)骨肉瘤MG-63細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性(P<0.05)。

    圖5 EGCG、CDDP及聯(lián)合用藥對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷徙的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of EGCG,CDDP and their combination on the migration of osteosarcoma MG-63 cells

    3.6 EGCG聯(lián)合CDDP對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)如圖6所示,與對(duì)照組相比,EGCG組、CDDP組凋亡率增加,分別為 10.336%±0.028%、19.681%±3.755%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而EGCG+CDDP聯(lián)合用藥組凋亡率更高,凋亡率為48.279%±7.608%,與EGCG組及CDDP組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示兩藥聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡。

    圖6 EGCG聯(lián)合CDDP對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of EGCG combined with CDDP on apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells

    3.7 Western blot檢測(cè)MG-63細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況

    Western blot結(jié)果及灰度分析結(jié)果如圖7所示:顯影后的條帶越黑越粗說(shuō)明蛋白表達(dá)量越高,與對(duì)照組相比,分別單藥應(yīng)用EGCG、CDDP及將二者聯(lián)合用藥后,細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2與Bcl-xL表達(dá)水平下調(diào),同時(shí)Bax、Caspase-3以及cleaved Caspase-3蛋白水平上調(diào),其中以聯(lián)合用藥組作用效果更明顯,表明EGCG+CDDP對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞抑制作用效果最強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖7 EGCG組、CDDP組及聯(lián)合用藥組對(duì)MG-63細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of EGCG group,CDDP group and combination group on the expression of related proteins in MG-63 cells

    4 討論與結(jié)論

    骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤,好發(fā)于兒童與青少年[12],盡管有手術(shù)、新輔助化療及手術(shù)聯(lián)合輔助化療的治療方法,骨肉瘤患者的致死率仍較高,尤其對(duì)于肺轉(zhuǎn)移者治療效果極差,順鉑為臨床中治療骨肉瘤較為常用的化療藥物,但是近年來(lái)越來(lái)越多的患者對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性,尋找新的對(duì)抗骨肉瘤藥物及聯(lián)合順鉑增強(qiáng)其化療敏感性的方案有極為重要的意義,因此以順鉑為核心的聯(lián)合用藥也成為了骨肉瘤治療領(lǐng)域中的一大研究熱點(diǎn)。

    順鉑(CDDP)屬鉑類(lèi)化療藥物中的一種,具有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用,其主要機(jī)制是通過(guò)抑制惡性腫瘤細(xì)胞中的DNA復(fù)制而發(fā)揮細(xì)胞毒性及抗腫瘤的作用[8],臨床上CDDP可用于治療多種惡性腫瘤如甲狀腺癌、肺癌、食道癌、骨肉瘤等,具有較好的化療效果,但是也存在不可避免的弊端如CDDP產(chǎn)生的腎毒性、耳毒性及耐藥性,這也限制了CDDP的臨床應(yīng)用,而腎毒性也是其最主要的副作用[7,13],因此為順鉑尋找合適的輔藥聯(lián)合作用以減少CDDP藥物毒性及提高整體化療敏感性成為一大熱點(diǎn),目前臨床中也多應(yīng)用以CDDP為核心的聯(lián)合化療方案,盡可能的在增強(qiáng)CDDP抗腫瘤作用的基礎(chǔ)性減少藥物對(duì)組織的損傷。兒茶素是茶中主要的活性物質(zhì),其中表沒(méi)食子酸兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)在綠茶中活性最高,具有多種生物特性如抗氧化、抗腫瘤及抗炎性反應(yīng)[14]。已有研究報(bào)道EGCG能夠延緩CDDP造成的腎臟腎小球?yàn)V過(guò)率下降,緩解所致HEK293細(xì)胞的氧化損傷,在CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中,隨著EGCG濃度的增加,HEK293細(xì)胞的存活率也逐漸增加,表明EGCG能夠在一定程度上對(duì)抗CDDP的藥物毒性[11]。CDDP對(duì)腎臟的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān),而EGCG具有較強(qiáng)的抗氧化性,能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激反應(yīng)。有研究證實(shí)EGCG能夠改善抗腎小球基底膜性腎小球腎炎,延緩CDDP造成的腎臟腎小球?yàn)V過(guò)率下降,對(duì)腎臟具有保護(hù)作用[15,6]。在腫瘤領(lǐng)域中,EGCG表現(xiàn)出廣泛的抗癌作用,已有研究發(fā)現(xiàn)EGCG能夠通過(guò)激活JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[17],通過(guò)下調(diào)p65的轉(zhuǎn)錄水平抑制膀胱癌的轉(zhuǎn)移[18]、上調(diào)miRNA-1抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[19],抑制宮頸癌[4]、肝癌[5]、胰腺癌[6]細(xì)胞增殖的作用,這些都為EGCG發(fā)揮保護(hù)腎功能與抗癌作用提供了充足的理論依據(jù)。在本研究中,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果及顯微鏡下觀察也表明EGCG具有抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的作用,且EGCG聯(lián)合CDDP能夠發(fā)揮更強(qiáng)的抑制效果,表明二者聯(lián)合作用能夠更有效抑制OS的進(jìn)展。

    通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),EGCG聯(lián)合CDDP對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于單藥,在顯微鏡下觀察各組藥物處理的細(xì)胞可見(jiàn),聯(lián)合用藥組的骨肉瘤MG-63細(xì)胞大量壞死,漂浮細(xì)胞明顯增多,對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于單藥組,表明EGCG聯(lián)合CDDP對(duì)MG-63細(xì)胞具顯著抑制作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)也證實(shí),單獨(dú)應(yīng)用EGCG能夠抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng),且隨著藥物濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞增殖抑制更明顯,說(shuō)明EGCG及CDDP對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞均有抑制作用,且具有劑量、時(shí)間依賴(lài)性,而在將EGCG與CDDP聯(lián)合應(yīng)用后結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制作用顯著強(qiáng)于單藥組;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組及DMSO處理組對(duì)比,EGCG、CDDP單藥應(yīng)用組細(xì)胞侵襲能力均降低,穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)也減少,而聯(lián)合用藥組的MG-63細(xì)胞侵襲能力最低,穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)也最少;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EGCG及CDDP單藥組細(xì)胞的遷移能力減弱,劃痕區(qū)域細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)減慢,而將EGCG與CDDP聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移能力大幅減弱,劃痕區(qū)幾乎沒(méi)有明顯細(xì)胞增長(zhǎng),同時(shí)細(xì)胞壞死數(shù)目也增多;Bcl家族是重要的凋亡相關(guān)基因,其中Bcl-2、Bcl-xL是其阻止細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因,而B(niǎo)ax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因,Bcl家族在胃腸道腫瘤、泌尿系腫瘤、骨肉瘤等惡性腫瘤中發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)聯(lián)[20]。通過(guò)western blot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGCG、CDDP單藥組作用后,抗凋亡蛋白Bcl-xL與Bcl-2水平均下調(diào),而促凋亡蛋白Bax水平明顯上調(diào),這一結(jié)果在EGCG+CDDP聯(lián)合用藥組更為顯著,提示EGCG能夠促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡,與CDDP聯(lián)合作用后效果更為明顯。Caspase家族是一組半胱氨酸蛋白酶,在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要作用,其中以Caspase-3最為關(guān)鍵,其激活是細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志[21]。細(xì)胞凋亡有多種途徑,但絕大多數(shù)途徑末端都是通過(guò)Caspase的級(jí)聯(lián)激活,最終激活為Caspase-3,形成具有活性的cleaved Caspase-3片段,進(jìn)而產(chǎn)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[22]。本研究結(jié)果表明在分別單藥應(yīng)用骨肉瘤MG-63細(xì)胞后,Caspase-3及cleaved Caspase-3表達(dá)水平均增高,而聯(lián)合用藥組升高最為明顯,提示EGCG也許能夠通過(guò)上調(diào)Caspase家族基因表達(dá)促進(jìn)MG-63細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而發(fā)揮抗骨肉瘤細(xì)胞的作用,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也提示EGCG能夠誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞發(fā)生凋亡,且EGCG+CDDP聯(lián)合用藥效果更為顯著?;|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類(lèi)蛋白水解酶,可通過(guò)破壞基質(zhì)降解平衡而促進(jìn)癌細(xì)胞突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的組織學(xué)屏障,侵犯周?chē)斑h(yuǎn)處組織,其中最具有代表性的便是MMP-2及MMP-9兩個(gè)家族基因,基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)水平越高,腫瘤的侵襲能力也越強(qiáng)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,藥物作用骨肉瘤細(xì)胞后MMP-2及MMP-9表達(dá)水平均下調(diào),且EGCG+CDDP聯(lián)合組下降最為明顯,表明EGCG聯(lián)合CDDP作用能夠發(fā)揮更為有效的抗骨肉瘤增殖的作用。以上結(jié)果均證實(shí)EGCG聯(lián)合CDDP能夠發(fā)揮更為顯著的抑制骨肉瘤的增殖作用。

    綜上,本研究表明EGCG能夠在體外抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的增殖,聯(lián)合CDDP用藥后較EGCG及CDDP單藥應(yīng)用效果更強(qiáng),由于EGCG對(duì)細(xì)胞具有一定的抗氧化性,能夠保護(hù)腎功能,減少CDDP的腎毒性,聯(lián)合用藥還能夠在發(fā)揮療效的基礎(chǔ)上減少CDDP對(duì)組織造成的損傷,是一類(lèi)理想的化療藥物輔藥,這也為骨肉瘤的臨床治療提供了新的理論依據(jù)與有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而本實(shí)驗(yàn)僅探討了在體外對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的影響,這也需繼續(xù)完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)以及進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中深入探究。

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