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    鴉膽子中黃酮及其抗炎、抗補體活性的研究

    2020-02-02 01:20:56郭文靜吳佳輝熊紫微馮育林楊世林
    天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:黃酮

    何 瀟,郭文靜,吳佳輝,熊紫微,譚 婷,馮育林,,楊世林,溫 泉*

    1江西中醫(yī)藥大學(xué);2創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點實驗室,南昌 330006

    鴉膽子是苦木科鴉膽子Bruceajavanica(L.) Merr.的干燥成熟果實,主要分布于我國的廣東、廣西等地區(qū)。全世界鴉膽子屬植物有6種,我國有2種,為鴉膽子和柔毛鴉膽子,均不同程度地作為民間傳統(tǒng)用藥,具有多種藥理活性。據(jù)2020版《中國藥典》記載,鴉膽子具有良好的清熱解毒、截瘧、止痢、腐蝕贅疣等作用,內(nèi)用治療各種瘧疾、痢疾,外用治療贅疣、雞眼等[1]?,F(xiàn)代藥理活性研究表明,鴉膽子有抗炎、拒食、抗瘧、抗病毒、抗?jié)?、降血糖和除草等多方面的作用[2]。鴉膽子含有豐富的化學(xué)成分,主要包括苦木內(nèi)酯類、三萜類、生物堿類、黃酮類、脂肪酸類等化合物,文獻報道及研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子中的黃酮類化合物主要以木犀草素及其衍生物為主[3]。雖然之前已有文獻報道過相關(guān)黃酮類成分的抗炎及抗補體活性[4],但大多是非同一骨架類型之間的活性比較,而本研究對從鴉膽子中分離得到一系列木犀草素骨架類型的黃酮進行分析,這對于闡明這類黃酮的抗炎、抗補體活性構(gòu)效關(guān)系具有重要參考意義。

    目前,有關(guān)黃酮類化合物體外抗炎作用機制的研究主要集中在小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7),而對小鼠肺泡巨噬細胞(MH-S)的研究鮮有報道。肺泡巨噬細胞是急性肺損傷發(fā)病使動環(huán)節(jié)的關(guān)鍵靶細胞,是抵御外來入侵者進入肺組織的第一道防線,研究發(fā)現(xiàn),肺泡巨噬細胞可以調(diào)節(jié)氣道中的促炎和抗炎反應(yīng),對肺部炎癥起著關(guān)鍵性作用[5]。本文首次研究了鴉膽子果實中木犀草素骨架類型黃酮化合物在MH-S細胞中的抗炎效果,闡明其構(gòu)效關(guān)系,并研究了黃酮的抗補體活性及其構(gòu)效關(guān)系,為進一步闡明木犀草素骨架類型黃酮的抗炎與抗補體之間的關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    Bruker Avance 600型核磁共振儀(德國布魯克公司);Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);HPLC:LC-XR20(日本島津公司);Agilent 1100 Series制備液相色譜(美國Agilent公司); HP20大孔吸附樹脂(日本三菱公司);Sephadex LH-20凝膠(美國GE Healthcare公司);YMC-Pack ODS-A HPLC半制備柱(250 mm×20 mm,5 μm,日本);YMC-Pack ODS-A HPLC半制備柱(250 mm×10 mm,5μm,日本);柱色譜硅膠、薄層色譜硅膠板(青島海洋化工廠分廠)。

    小鼠肺泡巨噬細胞株(MH-S );CCK-8(大連美倫生物技術(shù)有限公司);磺胺(Sigma公司,美國);N-1-萘乙二胺鹽酸鹽(Sigma公司,美國);96孔細胞培養(yǎng)板;1640培養(yǎng)基(Solarbio公司,美國);PBS(Solarbio公司,美國);胰蛋白酶(Solarbio公司,美國);BI血清(FBS,澳洲);脂多糖(LPS,Sigma公司,美國);95%磷酸(國藥)。

    鴉膽子藥材來自廣西省(2016年11月),由江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國躍教授鑒定為苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子的干燥成熟果實,標(biāo)本(YD20161107)保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 提取分離

    取鴉膽子藥材20 kg,粉碎后用石油醚脫脂3次,待藥渣揮干石油醚后,用95%乙醇進行提取,每次2 h,合并提取液,濾過,減壓濃縮至無醇味,得粗浸膏。浸膏加適量蒸餾水溶解,用乙酸乙酯萃取得459 g浸膏,之后上樣于HP-20大孔吸附樹脂,依次用水和30%、60%、95%乙醇洗脫,取60%乙醇洗脫部位浸膏157 g,經(jīng)硅膠柱色譜分離,以二氯甲烷-甲醇(20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1)梯度洗脫后,各部位再經(jīng)制備液相(乙腈-0.1%甲酸水36∶64)分離,得化合物2(8.9 mg)、4(10.6 mg)、9(4.4 mg),經(jīng)制備液相(乙腈-0.1%甲酸水28∶72)分離,得化合物1(3.4 mg)、5(6.8 mg)、7(20.0 mg),經(jīng)制備液相(乙腈-0.1%甲酸水33∶67)分離,得化合物3(3.5 mg)、6(10.8 mg)、11(9.8 mg),經(jīng)制備液相(乙腈-0.1%甲酸水18∶82)分離,得化合物8(6.7 mg)、10(9.0 mg)、12(7.8 mg)。

    1.2.2 活性測定

    CCK-8法細胞毒性試驗:取對數(shù)生長期的MH-S細胞接種于96孔板中(1×104個細胞/孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜,棄去上清,將含不同藥物濃度化合物1~12(100、50、25、12.5、6.25 μmol/L)的細胞培養(yǎng)液100 μL/孔加入96孔板中,另設(shè)正常細胞對照組中加入無藥物的細胞培養(yǎng)液,每組6個副孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,棄去上清液加入10%的CCK-8溶液,每孔100 μL,酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度(OD值),計算細胞活力。

    1.2.3 NO抑制試驗

    采用Griess法檢測對LPS刺激下的MH-S細胞分泌NO的抑制作用。取對數(shù)生長期MH-S細胞接種于96孔板中(5×104個細胞/孔),37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后,棄去舊培養(yǎng)基,給藥組每孔加入100 μL含藥1640完全培養(yǎng)基,模型組每孔加入100 μL空白1640完全培養(yǎng)基,空白對照組每孔加入200 μL空白1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)1 h后,除空白對照組外,每孔加入100 μL的LPS(2 μg/mL)溶液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,24 h后,取出96孔板于顯微鏡下觀察細胞狀態(tài),后每孔吸取100 μL上清液于新的96孔板中,加入Griess Ⅰ液50 μL,放置到細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min,取出,再加入Griess Ⅱ液50 μL,放置培養(yǎng)箱中10 min,取出,搖床振搖5 min,用酶標(biāo)儀在550 nm處測其OD值,計算NO抑制率。

    1.2.4 補體經(jīng)典途徑測試

    將樣品溶于DMSO,不同濃度的樣品(BBS緩沖液稀釋)加入臨界濃度的補體(1∶1稀釋的豚鼠血清),溶血素和2%綿羊紅細胞(SRDC)。根據(jù)文獻[6],配制中藥測定組、中藥對照組、補體組以及全溶血組樣品。放置37 ℃水浴30 min后,低溫(4℃)離心(3 000 rpm)5 min后,分別取每個樣品上清0.2 mL于96孔板,用酶標(biāo)儀在405 nm下測定吸光度(A)值。計算出不同濃度的中藥測定組的各溶血抑制率,以供試品濃度為橫坐標(biāo)(X),溶血抑制率為縱坐標(biāo)(Y),利用Graphpad Prism 7.0軟件,計算半數(shù)抑制溶血濃度(CH50)。

    抑制率=[1-(A中藥測定-A中藥對照)/A補體]×100%

    2 結(jié)果與討論

    2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

    化合物1黃色針晶(甲醇);mp.325~327 ℃,ESI-MS:m/z287 [M+H]+,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.40(2H,m,H-2′,6′),6.85(1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),6.54(1H,s,H-3),6.45(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.17(1H,d,J=2.0 Hz,H-6);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:165.6(C-2),103.7(C-3),182.5(C-4),162.9(C-5),99.7(C-6),164.6(C-7),94.6(C-8),158.3(C-9),104.8(C-10),122.7(C-1′),114.4(C-2′),147.6(C-3′),151.5(C-4′),116.6(C-5′),119.3(C-6′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的基本一致,故鑒定化合物1為木犀草素,結(jié)構(gòu)見圖1。

    化合物2淡黃色粉末(甲醇);mp.340~341 ℃,ESI-MS:m/z271 [M+H]+,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.93(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,H-6′),6.94(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,H-5′),6.76(1H,s,H-3),6.18(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.53(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),12.89(1H,s,5-OH);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:164.7(C-2),103.3(C-3),182.2(C-4),157.8(C-5),99.3(C-6),164.2(C-7),94.4(C-8),161.9(C-9),104.1(C-10),121.6(C-1′),128.9(C-2′,C-6′),116.4(C-3′,C-5′),161.7(C-4′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[8]報道的基本一致,故鑒定化合物2為芹菜素。

    化合物3黃色無定型粉末(甲醇);mp.>300 ℃,ESI-MS:m/z449 [M+H]+,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.62(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.40(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′),6.99(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.75(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.88(1H,s,H-3)6.60(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),5.62(1H,d,J=7.3 Hz,H-1′′),4.33~4.68(6H,m,Sugars-H);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:165.0(C-2),103.8(C-3),182.6(C-4),162.3(C-5),100.3(C-6),163.7(C-7),95.0(C-8),157.6(C-9),106.3(C-10),122.4(C-1′),114.4(C-2′),147.6(C-3′),151.7(C-4′),116.6(C-5′),119.4(C-6′),101.5(C-1′′),74.6(C-2′′),79.0(C-3′′),70.9(C-4′′),78.2(C-5′′),62.1(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[9]報道的基本一致,故鑒定化合物3為木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

    化合物4黃色粉末(甲醇);mp.328~330 ℃,ESI-MS:m/z287 [M+H]+,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.88(1H,s,5-OH),9.68(1H,s,3′-OH),9.38(1H,s,4′-OH),6.93(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′),7.35(1H,s,H-2′),7.28(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.88(1H,s,H-3),6.51(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.52(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),3.69(3H,s,7-OCH3);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:164.6(C-2),103.3(C-3),182.1(C-4),161.9(C-5),99.3(C-6),164.3(C-7),94.3(C-8),157.7(C-9),104.1(C-10),121.9(C-1′),113.8(C-2′),146.2(C-3′),150.2(C-4′),116.5(C-5′),119.4(C-6′),49.5(7-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]報道的基本一致,故鑒定化合物4為7-甲氧基木犀草素。

    化合物5棕黃色粉末(甲醇);mp.178~180 ℃,ESI-MS:m/z449 [M+H]+,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.22(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.68(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),7.37(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6′),6.72(1H,s,H-3),6.40(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.24(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),5.38(1H,s,H-1′′),3.05~3.77(4H,m,Rha-H),1.35(3H,d,J=6.2Hz,RhaCH3);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:156.9(C-2),134.6(C-3),178.2(C-4),161.7(C-5),99.2(C-6),164.7(C-7),94.1(C-8),157.7(C-9),104.5(C-10),121.6(C-1′),115.9(C-2′),145.7(C-3′),148.9(C-4′),116.1(C-5′),121.2(C-6′),102.3(C-1′′),70.8(C-2′′),71.1(C-3′′),71.6(C-4′′),70.5(C-5′′),18.0(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[11]報道的基本一致,故鑒定化合物5為槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

    化合物6黃色粉末(甲醇);mp.244 ~246 ℃,ESI-MS:m/z447 [M-H]-,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:7.59(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.87(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.55(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz,H-6′),6.32(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.88(1H,s,H-3)6.22(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.27(1H,s,H-1′′),12.93(1H,s,5-OH),4.90(1H,d,J=7.2,H-1′);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:164.6(C-2),103.7(C-3),182.2(C-4),161.8(C-5),99.3(C-6),163.9(C-7),94.6(C-8),157.8(C-9),104.2(C-10),122.2(C-1′),114.8(C-2′),146.1(C-3′),151.0(C-4′),116.9(C-5′),122.2(C-6′),102.3(C-1′′),73.8(C-2′′),76.4(C-3′′),70.5(C-4′′),77.8(C-5′′),61.3(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的基本一致,故鑒定化合物6為木犀草素-3’-O-β-D-葡萄糖苷。

    化合物7黃色針晶(甲醇);mp.210~212 ℃,ESI-MS:m/z455 [M+Na]+,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.69(1H,s,5-OH),7.83(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.99(2H,d,J=8.0Hz,H-3′,5′),6.47(1H,br s,H-8),6.26(1H,br s,H-6),5.44(1H,br s,H-1′′),3.92(1H,br s,H-2′′),3.36(1H,dd,J=8.8,3.2 Hz,H-3′′),3.15~3.23(1H,m,H-4′′,H-5′′),0.86(3H,d,J=5.2 Hz,-CH3);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:157.0(C-2),134.6(C-3),178.1(C-4),161.7(C-5),99.3(C-6),165.1(C-7),94.3(C-8),157.0(C-9),104.4(C-10),120.9(C-1′),131.0(C-2′,6′),115.8(C-3′,5′),160.5(C-4′),102.2(C-1′′),70.8(C-2′′),71.1(C-3′′),71.6(C-4′′),70.5(C-5′′),17.9(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[13]報道的基本一致,故鑒定化合物7為山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

    化合物8黃色粉末(甲醇);mp.228~230 ℃,ESI-MS:m/z432 [M]+,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.88(1H,s,5-OH),10.49(1H,s,4′-OH),7.92(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.91(2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),6.81(1H,s,H-3),6.43(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.84(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),5.35(1H,d,J=5.0 Hz,H-1′′),3.32~3.81(5H,m,Sugars-H);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:163.4(C-2),103.5(C-3),182.5(C-4),157.4(C-5),99.9(C-6),164.7(C-7),95.3(C-8),161.6(C-9),105.8(C-10),121.4(C-1′),129.1(C-2′),116.5(C-3′),161.9(C-4′),116.5(C-5′),129.1(C-6′),,100.3(C-1′′),73.6(C-2′′),76.9(C-3′′),69.9(C-4′′),77.6(C-5′′),61.0(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的基本一致,故鑒定化合物8為芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

    化合物9淡黃色粉末(甲醇);mp.252~255 ℃,ESI-MS:m/z299 [M-H]-,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.92(1H,s,5-OH)7.40(2H,m,H-2′,6′),6.81(1H,d,J=8.0Hz,H-5′),6.60(1H,s,H-3),6.25(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.11(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),3.91(3H,s,3′-OCH3);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:164.3(C-2),104.0(C-3),182.5(C-4),162.9(C-5),99.7(C-6),165.7(C-7),94.7(C-8),158.3(C-9),104.8(C-10),122.3(C-1′),110.1(C-2′),148.7(C-3′),152.2(C-4′),116.7(C-5′),121.1(C-6′),55.8(-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的基本一致,故鑒定化合物9為3’-甲氧基木犀草素。

    化合物10黃色粉末(甲醇);mp.262~264 ℃,ESI-MS:m/z579 [M+H]+,1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.84(1H,s,H-3),6.18(1H,d,J=1.5 Hz,H-6),6.78(1H,d,J=1.5 Hz,H-8),7.33(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),6.82(2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),5.25(1H,d,J=8.5 Hz,H-1′′),5.12(1H,br s,H-1′′′),1.30(3H,d,J=6.0Hz,H-6′′′);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:165.1(C-2),101.2(C-3),197.1(C-4),163.3(C-5),96.4(C-6),163.6(C-7),79.3(C-8),157.7(C-9),103.5(C-10),127.8(C-1′),129.4(C-2′,6′),115.0(C-3′,5′),163.3(C-4′),42.6(-OCH3),97.9(C-1′′),77.8(C-2′′),77.5(C-3′′),70.0(C-4′′),76.7(C-5′′),60.8(C-6′′),95.3(C-1′′′),70.7(C-2′′′),70.8(C-3′′′),72.5(C-4′′′),68.6(C-5′′′),16.8(C-6′′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的基本一致,故鑒定化合物10為野漆樹苷。

    化合物11黃色粉末(甲醇);mp.177~178 ℃,ESI-MS:m/z609 [M-H]-,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:6.18(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.48(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),7.43(1H,d,J=2.2 Hz,H-2′),6.82(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),7.54(1H,dd,J=8.2,2.2 Hz,H-6′),5.35(1H,d,J=7.4 Hz,H-1′′),4.39(1H,br s,H-1′′′),3.05~3.78(10H,sugars-H),12.63(1H,br s,5-OH),9.68(3H,br s,7,3′,4′-OH);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:156.1(C-2),133.2(C-3),177.1(C-4),162.3(C-5),98.4(C-6),163.6(C-7),93.3(C-8),157.7(C-9),103.5(C-10),121.8(C-1′),115.4(C-2′),144.0(C-3′),148.3(C-4′),116.5(C-5′),121.4(C-6′),101.9(C-1′′),74.8(C-2′′),76.5(C-3′′),70.0(C-4′′),76.7(C-5′′),68.8(C-6′′),100.3(C-1′′′),70.7(C-2′′′),70.8(C-3′′′),72.5(C-4′′′),68.6(C-5′′′),17.8(C-6′′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的基本一致,故鑒定化合物11為蘆丁。

    化合物12黃色粉末(甲醇);mp.218~220 ℃,ESI-MS:m/z431 [M-H]-,1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:6.48(1H,s,H-6),6.85(1H,s,H-8),8.05(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),6.82(2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),4.66(1H,d,J=9.6 Hz,H-1′′),3.35~3.78(6H,m,sugars-H),13.22(1H,br s,5-OH);13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:163.1(C-2),102.2(C-3),182.1(C-4),156.3(C-5),104.4(C-6),162.6(C-7),98.3(C-8),161.7(C-9),104.5(C-10),121.8(C-1′),130.4(C-2′,6′),115.0(C-3′,5′),160.3(C-4′),73.9(C-1′′),70.8(C-2′′),78.5(C-3′′),70.0(C-4′′),81.7(C-5′′),61.8(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的基本一致,故鑒定化合物12為異牡荊素。

    圖1 化合物1~12化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-12

    圖2 正常MH-S細胞與LPS誘導(dǎo)的MH-S細胞的形態(tài)Fig.2 The MH-S morphology of normal cell and LPS induction cell注:A1.正常MH-S細胞(100×);A2.正常MH-S細胞(200×);B1.LPS誘導(dǎo)MH-S細胞(100×);B2.LPS誘導(dǎo)MH-S細胞(200×)。 Note:A1.Normal MH-S (100×);A2.Normal MH-S(200×);B1.MH-S LPS induction (100×);B2.MH-S LPS induction (200×).

    2.2 細胞毒性及抗炎活性

    顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(正常MH-S細胞與LPS誘導(dǎo)MH-S細胞的形態(tài)見圖2),正常MH-S細胞和LPS誘導(dǎo)MH-S細胞均半懸浮生長,細胞呈圓形或不規(guī)則形;LPS造模后細胞懸液較為渾濁,細胞生長狀態(tài)未見明顯差別,說明本次實驗所用的LPS造模濃度不會對細胞生長造成影響。

    表1 化合物 1~12對 LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺泡巨噬細胞 MH-S的細胞毒性和一氧化氮產(chǎn)生的抑制效果Table 1 Cytotoxicity and inhibitory effects of compounds 1-12 against LPS-induced NO production in mouse alveolar macrophage MH-S cells

    由表1可知,化合物1、3、4、6、9、11在50 μmol/L濃度下對MH-S細胞24 h的細胞毒性較小,細胞存活率高,化合物2、8毒性較大,濃度為12.5 μmol/L時細胞存活率較高,化合物10、12毒性較小,在100 μmol/L濃度下細胞存活率較高,化合物5、7基本無毒性,且具有明顯的促進細胞增殖的生物活性。

    對化合物1~12在最佳給藥濃度下進行抗炎活性篩選,發(fā)現(xiàn)被測試化合物對LPS誘導(dǎo)的MH-S細胞均有一定的抗炎活性,化合物1、3、4、5、9、11在濃度為50 μmol/L時均表現(xiàn)出了較好的抑制NO生成的活性,化合物2在濃度為12.5 μmol/L時表現(xiàn)出了較好的抗炎活性,對于這些化合物的潛在抗炎活性還有待進一步研究,化合物8、10基本無抗炎活性。構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果表明不論在A環(huán)還是B環(huán),酚羥基有助于抗炎活性的增強,無羥基化合物幾乎無抗炎活性;酚羥基糖基化后,活性有所降低,甚至消失;B環(huán)鄰位羥基取代時,活性顯著增強;羥基甲氧基化后其抗炎活性顯著增強。

    2.3 抗補體活性結(jié)果

    抗補體活性實驗結(jié)果顯示,12個黃酮類化合物除化合物4、9外均具有一定的抗補體活性,其中化合物1、6和10活性最好,化合物7、8活性較差(見表2),分析其構(gòu)效關(guān)系可知,黃酮類化合物抗補體活性主要是由于其含有多個酚羥基,一般情況下酚羥基越多活性越好,這與文獻報道一致[4];當(dāng)黃酮C-3、C-7位雙糖苷取代后,黃酮抗補體活性略有增強;當(dāng)黃酮C-3、C-7位單糖苷取代同時C環(huán)鄰羥基取代時,化合物抗補體活性明顯增強;甲氧基取代后,活性顯著下降,基本無活性;B環(huán)糖取代后,活性顯著增強。

    表2 鴉膽子中黃酮抗補體活性結(jié)果

    3 結(jié)論

    巨噬細胞是吞噬細胞的一種,是機體抵抗外來病原體入侵的重要組成部分,其主要功能是對病原體進行吞噬并激活免疫細胞進而引起炎癥反應(yīng)。肺泡巨噬細胞(MH-S)長期存在于肺泡中,是肺抵御外部侵襲的重要防線,在肺部免疫系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[19]。肺部在受到外界致病因素的刺激時,會釋放大量炎癥因子,引起多種肺部疾病,如急性肺損傷、急性支氣管哮喘、肺纖維化等。炎癥反應(yīng)是抵御病原微生物入侵機體的一種重要防御反應(yīng),LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種成分,能夠誘導(dǎo)巨噬細胞釋放大量炎癥介質(zhì)。本文基于LPS誘導(dǎo)的MH-S細胞模型,對鴉膽子果實中黃酮類化學(xué)成分進行抗炎及抗補體活性篩選研究。結(jié)果表明,化合物1、3、4、6、9、11在50 μmol/L濃度下對MH-S細胞24 h的細胞毒性較小,細胞存活率高,化合物2、8毒性較大,濃度為12.5 μmol/L時細胞存活率較高,化合物10、12毒性較小,在100 μmol/L濃度下細胞存活率較高,化合物5、7基本無毒性,且具有明顯的促進細胞增殖的生物活性。被測化合物均表現(xiàn)出一定的一氧化氮(NO)抑制活性,構(gòu)效關(guān)系明顯,酚羥基越多活性越好,甲氧基化后,抗炎活性顯著增強,糖基化后,活性略有降低;B環(huán)羥基取代對化合物抗炎活性影響最大, 2個羥基時活性最好,1個羥基次之,無羥基幾乎無抑制作用,鄰位羥基取代時,活性顯著增強。此外,本實驗還對化合物1~12進行了抗補體活性篩選,分析其構(gòu)效關(guān)系可知,其抗補體活性主要與化合物所連接酚羥基的數(shù)目有關(guān),一般情況下酚羥基越多活性越好;當(dāng)黃酮C-3、C-7位雙糖苷取代后,黃酮抗補體活性略有增強,當(dāng)黃酮C-3、C-7位單糖苷取代同時C環(huán)鄰羥基取代時,化合物抗補體活性明顯增強;甲氧基取代后,活性下降,基本無活性;B環(huán)被糖取代后,活性增強。本文進一步豐富了苦木科鴉膽子屬植物的研究內(nèi)容,發(fā)現(xiàn)鴉膽子中成分通過抑制MH-S細胞的炎癥效應(yīng),可能對急性肺損傷有一定的治療作用,為鴉膽子的后期研究提供了一定的參考。

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