樹莓果肉多糖超聲提取工藝優(yōu)化及其抗疲勞作用

吳 云，陳 薇，田文慧，楊永晶,2*

1青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院；2青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室，西寧 810016

樹莓(RubusidaeusL.)是一類薔薇科植物，進一步分類后，屬于懸鉤子屬，從分布情況來看，北半球溫帶分布的樹莓較多[1]。據研究，樹莓中能夠檢測出多種活性成分，如多糖、氨基酸、酚類等。這些活性成分使得樹莓在抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)、降糖降脂、抗菌、抗紫外[2]等方面效果突出。樹莓廣泛的生物活性使其在功能性食品開發(fā)、美容美體和藥物研發(fā)等諸多方面均展示出極為廣闊的開發(fā)前景。

多糖是植物重要的生物活性成分[3]，植物多糖也早已成為研究的熱點之一。樹莓果實中多糖含量較高，是多糖提取的理想原料。關于樹莓多糖已有一些相關報道，主要涉及多糖的分離純化、結構表征、藥理活性和應用。如Yu[4]從樹莓中分離得到一種新型水溶性多糖RCP-II，其具有良好的抗氧化能力和非酶糖基化抑制活性。本團隊前期在樹莓果肉多糖體內抗腫瘤活性研究時發(fā)現其具有顯著的免疫增強活性，在荷瘤小鼠模型中表現出良好的抑制黑色素瘤活性，且能明顯增強化療藥物多西他賽的體內抗腫瘤效果，有望用作免疫增強劑或化學治療輔助劑以治療惡性黑色素瘤[5]。此外，Mierczynska[6]用檸檬酸從樹莓中提取到富含果膠的餾分，并發(fā)現該果膠可在食品工業(yè)中作為增稠劑和膠凝劑使用。相信隨著研究的不斷拓展和深入，樹莓多糖也將成為一種極具開發(fā)前景的純天然植物多糖。

研究和優(yōu)化提取工藝對很多生物活性物質的規(guī)模開發(fā)和利用具有重要促進作用。本文利用響應面法對樹莓多糖的超聲提取工藝進行了優(yōu)化，為其規(guī)?；崛√峁﹨⒖?。此外，關于樹莓多糖的抗疲勞活性研究尚未見報道。故本文采用小鼠游泳實驗研究樹莓果肉多糖的體內抗疲勞作用，并通過測定小鼠負重游泳時間和游泳后肝糖原、血糖、血清尿素氮及肌酸激酶等多項生理生化指標進一步闡明樹莓果肉多糖的抗疲勞機理，進一步拓展樹莓多糖的活性研究內容，為其開發(fā)利用提供依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

樹莓冷凍果，購自青海樹莓農林產業(yè)化有限公司(青海湟源)；共于甘肅中醫(yī)學院購買小白鼠80只，體重處于19～21 g之間；糧食酒精、濃硫酸(兩者質量分數分別為95%和98%)、分析純的苯酚、葡萄糖、氟乙酸(TFA)及氯仿等均采購于青海天順化學試劑公司；多種單糖標準品，如木糖、半乳糖等全部在中國藥品生物制品檢定所采購；測試生理生化指標的測試盒，于南京建成生物工程中心采購。

1.2 儀器與設備

高速連續(xù)型超微粉碎機(CLF-30B，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠)；旋轉蒸發(fā)儀、低速臺式離心機、紫外-可見分光光度計、冷凍干燥機、常溫離心機(RE-2000A、TDL-50C、UV-759、FD10、TDL-50C，上海精密科學儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(DZKW-D-4，河南鄭州南北儀器設備有限公司)；超聲清洗儀(KQ-100VDB，昆山市超聲儀器有限公司)；傅里葉變換紅外光譜分析儀(Bruker Tensor 27，天津市金貝爾科技有限公司)；凝膠滲透色譜(LC-20AT，島津)；渦旋混合儀(TD-RS-1，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；掃描電鏡(JSM-7500，深圳瑞盛科技有限公司)；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(7890A-5975c，Agilent Technology)；超高溫型電熱恒溫干燥箱(202-3，沅澤科技有限公司)；安瓿瓶(如皋市天豐包裝材料廠)；酒精噴燈(北京鑫骉騰達儀器設備有限公司)；酶標儀(RT-6000，北京裕天醫(yī)療技術)；冷凍離心機(4-5R，湖南恒諾儀器設備有限公司)；組織勻漿儀(FSH-2A，金壇市友聯(lián)儀器研究所)。

2 實驗方法

2.1 樹莓果肉多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 樹莓果肉多糖的提取

2.1.1.1 標準曲線的繪制

在105 ℃溫度下對葡萄糖標準品進行干燥，并在保證重量穩(wěn)定后，通過天平進行標準品的稱量，精準稱量0.1 g，并轉到量杯中，進一步采用純水定容到1 L，以此得到濃度為0.1 g/L的葡萄糖溶液，依次吸取該溶液，吸取量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，并分別加入試管，通過加入純水，使最終的體積達到2 mL。再取出濃度為5%的苯酚，各加入1 mL，再于所有試管中加入濃硫酸，加入量為5 mL，振蕩混合，保證充分混合后于室溫下靜置，時長30 min，再測定所有試管490 nm波長下的吸光值，取一支空試管，向其中加入2 mL純水，以此得到空白對照。橫縱坐標分別設置為多糖濃度(C，g/mL)以及吸光值(A)，以此得到標準曲線，并進一步明確回歸方程A=1.82C(R2=0.999)。

2.1.1.2 樹莓果肉多糖的提取及含量測定

得到樹莓果粉后，向其中加入質量分數為80%的乙醇(W∶V=1∶4)，再進行加熱回流，溫度設置為60 ℃，以此除去果粉中存在的色素、單糖以及寡糖，重復2次。稱取揮干乙醇的樹莓果粉0.1 g放于錐形瓶中，之后完成超聲提取，在這個過程中，保證提取溫度、時間、功率等參數的適宜，提取完畢之后進行離心，離心速度設置為3 500 rpm，時間設置為15 min，再將得到的上清中含有的蛋白去除，該步驟通過Sevag法來實現，反復進行3次此項操作。將水溶液置于60 ℃，通過減壓濃縮，從而能夠得到原體積1/4的溶液，再向其中加入4體積95%的糧食酒精，再進行沉淀，沉淀溫度為4 ℃，在沉淀24 h之后進行離心。后將樹莓果肉多糖沉淀、冷凍、干燥，可獲得淺粉色樹莓果肉多糖粉末，并按如下公式計算樹莓果肉多糖提取得率：樹莓果肉多糖提取得率=(樹莓果肉多糖含量/樹莓果粉質量)×100%。此外，采用硫酸-蒽酮法和考馬斯亮藍法分別測定樹莓果肉多糖中的多糖含量與蛋白質含量。

2.1.2 樹莓果肉多糖提取工藝的優(yōu)化

2.1.2.1 單因素實驗

選擇料液比、超聲提取時間、溫度和超聲功率四項因素進行單因素實驗，當其中一項因素改變時，其它因素恒定，單次實驗重復3次。

2.1.2.2 響應面法及數據分析方法

通過單因素實驗篩選出明顯影響樹莓果肉多糖提取得率的幾個主要因素，而后遵循Box-Behnken設計原理，以影響較顯著的因子作自變量進行組合，并分別以-1、0、+1表示各個自變量的低、中、高3個水平。通過運用Design expert 8.0軟件完成實驗所得數據的處理和分析，從而得到如下二次多項式方程。

在該方程中，Y所代表的含義是預測響應值，由此可以明確提取得率；Xi以及Xj所代表的含義是自變量編碼水平(i≠j)；k所代表的是變量個數；A0、Ai、Aij所代表的含義分別是常數項、線性回歸系數以及二次項回歸系數。

通過計算R2能夠明確所得方程的擬合可靠性，若該數值越趨近于1，則表示可靠性越好；通過進行F值檢驗，能夠得到兩變量之間的相關性程度，并且F值與相關性顯著之間為正比關系；通過進行P值檢驗，能夠得到線性效應、平方效應、交互效應的顯著性，并且P值與顯著性之間呈現出反比關系[7]，P<0.05時影響顯著，P<0.01時影響極顯著。

2.2 樹莓果肉多糖結構初步分析

2.2.1 樹莓果肉多糖的紅外光譜分析

取適量光譜級的溴化鉀粉末，將其加入到樣品中，并將二者完全混合，之后置于紅外光譜儀，進而完成測定，掃描范圍設置在400～4 000 cm-1之間，分辨率設置為4 cm-1，共進行64次掃描。

2.2.2 樹莓果肉多糖表面結構觀察

用真空鍍膜儀在樹莓果肉多糖樣品表面薄薄地鍍一層金，并將樣品放到掃描電鏡下進行觀察，以詳細明確其表面結構，將加速電壓設置為5 kV，放大倍數為10 000、5 000、2 000和1 000。

2.2.3 樹莓果肉多糖其單糖組分分析

借助于GC-MS分析，可以對樣品的單糖組分進行明確，具體分析方法參照Yang等[8]的實驗。

2.3 樹莓果肉多糖的抗疲勞作用

2.3.1 動物分組及給藥方案

購買后正常喂養(yǎng)小鼠，在1周后開始進行實驗，并且在喂養(yǎng)期間，應保證室溫在22 ℃左右，濕度在45%左右，保證供水和食物充足。1周之后，對參與實驗的80只小鼠基于平均和隨機的原則進行分組，共分為4組，各小組中包含了20只小鼠，四個小組有空白對照組(完全為生理鹽水)以及樹莓果肉多糖高(RPP-H：200 mg/kg)、中(RPP-M：100 mg/kg)、低(RPP-L：50 mg/kg)劑量組，樹莓果肉多糖用生理鹽水配制。所有的小鼠每日接受一次灌胃，并保證每日灌胃的時間、劑量固定，持續(xù)28天。

2.3.2 小鼠負重游泳實驗

在灌胃28天之后，即可從所有分組內隨機選取小鼠完成負重游泳實驗，在各小組取10只，通過于小鼠尾部增添鉛皮來完成負重處理，重量為小鼠體重的5%，保證游泳水溫為25±0.5 ℃。若小鼠沉入水底后時長不低于9 s，則為游泳終止時間，以此對游泳時長進行測定和記錄。

2.3.3 血糖、血清中乳酸、乳酸脫氫酶、尿素氮和肌酸激酶的測定

剩余的40只小鼠在水溫為25±0.5 ℃的水中進行游泳，時長為90 min，再休息1 h之后摘眼球完成血液采集，并將其放于室溫下靜置，時長為30 min，靜置完畢后離心，3 000 rpm，4 ℃，10 min，從而得到血清樣本。依據于測試盒中的說明書完成相關生理生化指標的檢測，如乳酸、葡萄糖等。

2.3.4 肝糖原與肌糖原的測定

通過脫頸椎處死血液采集后的小鼠，并在最短時間內分離出肝臟以及股四頭肌。肝臟與肌肉組織稱重后分別在冰浴中用事先預冷的勻漿介質(pH7.4、Tris-HCl、EDTA-2Na以及蔗糖的濃度分別為0.01、0.000 1、0.01 mol/L、0.8% NaCl溶液)充分混合之后得到10%勻漿液。再進行離心，3 000 rpm，4 ℃，10 min后取上清備用。肝糖原和肌糖原的分析均按照其測試說明書進行。

2.3.5 數據處理

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 超聲提取溫度對樹莓果肉多糖提取得率的影響

改變超聲提取溫度，并保證其他參數的固定，來完成超聲提取溫度與樹莓果肉多糖提取得率相關性的探究，在進行溫度設置時，分別在40～80 ℃之間設置五個梯度，時間、功率以及料液比分別為40 min、70 W、1∶20。結果如圖1所示，樹莓果肉多糖提取得率在40～60 ℃之間隨溫度的升高而增加，在提取溫度60 ℃時，多糖提取得率最大。之后多糖提取得率隨提取溫度的升高而逐漸下降。因此，將60 ℃設定為響應面實驗中超聲提取溫度的中間水平值。

圖1 溫度與樹莓果肉多糖提取得率之間的相關性分析Fig.1 Correlation analysis between temperature and extraction rate of RPP

3.1.2 超聲功率對樹莓果肉多糖提取得率的影響

改變超聲功率，并保證其他參數的固定，來完成超聲功率與樹莓果肉多糖提取得率相關性的探究，分別設置六個超聲功率，分別為50、60、70、80、90以及100 W。時間、溫度以及料液比分別為40 min、50 ℃、1∶20。結果如圖2所示，當超聲功率在50～60 W時，樹莓果肉多糖的提取得率不斷增加，到60 W時達到峰值。之后隨超聲功率的加大開始逐漸下降。因此，將60 W設定為響應面實驗中超聲提取功率的中間水平值。

圖2 超聲功率與樹莓果肉多糖提取得率的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between ultrasonic power and extraction rate of RPP

3.1.3 超聲提取時間對樹莓果肉多糖提取得率的影響

改變提取時間，并保證其他參數的固定，來完成提取時間與樹莓果肉多糖提取得率相關性的探究，采用五個提取時間，即20、40、60、80以及100 min。功率、溫度以及料液比分別為70 W、50 ℃、1∶20。結果如圖3所示，當提取時間在20～60 min時，提取得率呈現出緩慢升高的趨勢。當時間高于60 min之后，提取得率出現劇烈上升趨勢，并且當時間為80 min時，提取得率最高，80 min之后，提取得率出現劇烈降低趨勢。因此，將80 min設定為響應面實驗中超聲提取時間的中間水平值。

圖3 提取時間與樹莓果肉多糖提取得率的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between extraction time and extraction rate of RPP

3.1.4 料液比對樹莓果肉多糖提取得率的影響

料液比是影響多糖提取得率的重要因素之一，過小的料液比不能充分提取材料中的多糖，過大的料液比則會造成提取耗時長、耗能多，成本高等諸多不便。改變料液比，并保證其他參數的固定，來完成料液比與樹莓果肉多糖提取得率相關性的探究，采用五個不同的料液比，即1∶10、1∶15、1∶20、1∶25以及1∶35。時間、溫度以及功率分別為40 min、50 ℃、70 W。最終測定結果見下圖4，料液比在1∶10～1∶20之間，則二者為正相關，而高于1∶20后，提取得率不再有明顯改變。從時間和能耗方面考慮，最終選擇1∶20作為響應面實驗的恒定料液比。

圖4 料液比與樹莓果肉多糖提取得率的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between material liquid ratio and extraction rate of RPP

3.2 響應面法優(yōu)化樹莓果肉多糖提取工藝

3.2.1 Box-Benhnken設計因素水平及編碼

結合單因素實驗中所得到的數據結果，分別將超聲提取溫度、時間以及功率設置為三因素，將60 ℃、80 min、60 W設定為中間水平值、進行響應面實驗，具體因素水平及編碼詳見表1。

表1 Box-Benhnken設計因素水平及編碼Table 1 Box benhnken design factor level and coding

3.2.2 響應面分析方案與結果

響應面詳細方案及結果如表2所示。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design matrix and the response values

由表3可見，三個因素的交互項、線性及平方項對樹莓果肉多糖的提取得率都呈現出顯著相關性(P<0.05)，并且是極為明顯的線性關系。計算R2的結果為0.998 9，該數值在一定程度上說明所構建的模型具有較好的擬合度，以此也能夠證實可以采用該方程來進行實際分析。除此之外，通過計算F值能夠發(fā)現，可以基于相關性的顯著程度對三個因素進行排序，其中提取時間與提取得率之間的相關性最為顯著，超聲功率居中，提取溫度相關性相對較小。

基于擬合模型，進一步得到三維響應面圖以及等高線圖，通過兩圖能夠使響應面的最高點更加直觀地呈現出來，即極值及三因素的相互作用與響應值的相關性，以此能夠使最佳提取工藝參數范圍得到明確[9]。圖5顯示出超聲提取功率為58.38 W時，提取時間及溫度與提取得率間的相關性。當超聲提取溫度為50～60 ℃時，樹莓果肉多糖提取得率維持在11.46%以上。

表3 方差分析結果Table 3 Result of ANOVA analysis

圖5 超聲提取時間與溫度對樹莓果肉多糖提取得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time (X2) and temperature (X1) on extraction rate of RPP注：A：3D響應面圖；B：等高線圖,下同。Note:A:Response surface plot;B:Contour plot,the same below.

圖6顯示了超聲提取時間為84.32 min時不同超聲提取功率和溫度對樹莓果肉多糖提取得率的影響。由圖可知，在超聲功率設置為55～60 W之間，溫度設置為50～65 ℃之間的情況下，樹莓果肉多糖提取得率維持在頂峰水平。

圖7顯示了超聲提取溫度為58.63 ℃時不同超聲提取功率和時間對樹莓果肉多糖提取得率所產生的影響。由圖可見，時間設置在80～90 min之間，功率設置在50～65 W之間，樹莓果肉多糖提取得率達到最高。

圖6 超聲提取功率與溫度對樹莓果肉多糖產率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power (X3) and temperature (X1) on extraction rate of RPP

圖7 超聲提取功率和時間對樹莓果肉多糖提取得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power (X3) and time (X2) on extraction rate of RPP

3.2.3 樹莓果肉多糖最優(yōu)提取工藝的確定

3.3 樹莓果肉多糖的紅外光譜分析

通過進行紅外光譜分析后得到光譜圖如下圖8所示，對該圖進行分析后發(fā)現，3 300～3 500 cm-1范圍內得到了O-H的吸收峰，而于2 900～2 940 cm-1范圍內得到了C-H吸收峰[10]。1 740 cm-1以及1 600～1 650 cm-1分別為糖醛酸結構和C=O的吸收峰[11]。1 485～1 350 cm-1之間的一系列吸收峰是-CH(O-CH2)結構的變性吸收峰，1 000～1 200 cm-1的范圍內得到的是吡喃糖基團的吸收峰[12]。850～810 cm-1之間得到C-O-S的吸收峰。350～600 cm-1的吸收峰為吡喃糖環(huán)結構[13]。

3.4 樹莓果肉多糖電鏡下的表面結構

圖9為使用掃描電鏡在10 000倍、5 000倍、2 000倍和1 000倍下觀察到的樹莓果肉多糖超微結構。從圖中可以看出，樹莓果肉多糖表面比較粗糙，且分布著大小不一的卵圓形顆粒。該結果與蟲草多糖在電鏡下的超微結構非常類似，這種卵圓形顆?？赡芘c多糖的分支和網狀結構關系密切[14]。

圖9 掃描電鏡下觀察到的樹莓果肉多糖表面結構Fig.9 SEM images of RPP

3.5 樹莓果肉多糖的單糖組成

3.5.1 標準曲線的繪制

在進行標準曲線繪制時，橫縱坐標分別設置為濃度和衍生產物，再實現各單糖標準品的線性回歸，設置線性范圍是25～400 μg/mL。最終得到的結果如下表5。

3.5.2 單糖標準品乙酰化衍生物的GC-MS圖譜

乙?；苌a物的分析結果見下圖10，通過對該圖進行分析可以發(fā)現，分離效果較佳，無明顯雜質產生，并進一步分析后得到如下表6中的結果，就目前所采用的多糖衍生方法來看，硅烷化以及乙?；膽妙l率相對較高。前者的優(yōu)點眾多，如耗時短、操作簡便等，但是其缺點也是不可忽視的，即多峰以及重疊峰等現象出現可能性較高，使得后續(xù)的分析工作極為困難[8,15]。所以本實驗選取了鹽酸羥胺肟化以及乙酸酐乙酰化衍生法，以此能夠最大可能地減少副衍生物的產生，有效防止多峰等現象出現，不同類型的單糖對應單一的色譜峰，使得后續(xù)分析能夠順利進行[16]。

3.5.3 樹莓果肉多糖的單糖組成分析

通過對樹莓果肉多糖進行乙?；苌螅軌虻玫紾C-MS圖譜，即圖11所示?；趩翁菢藴势繁Ａ魰r間以及離子碎片，能夠進一步分析得到樹莓果肉多糖中的單糖組成，即半乳糖(含量為40.57 μg/mL)、鼠李糖(32.06 μg/mL)、葡萄糖(127 μg/mL)、木糖(15.13 μg/mL)、甘露糖(19.63 μg/mL)以及阿拉伯糖(298.49 μg/mL)，進一步得到摩爾比為2.3∶2.0∶7.1∶1.0∶1.1∶19.9，該圖譜中并未發(fā)現果糖。從該結果中可以發(fā)現，含量較高的有阿拉伯糖以及葡萄糖。這與本團隊前期對樹莓多糖的單糖組成研究結果一致[8]，但Yu[4]、Teng[17]對單糖結果的研究結果中并未檢測到甘露糖，其樹莓果實樣品產地為哈爾濱，Yang與本實驗的樹莓樣品產地為青海湟源，推測可能是受到樹莓生長地光照與氣候等環(huán)境條件的影響。

表5 7種單糖標準品的標準曲線方程與相關系數Table 5 The standard curve equation and correlation coefficient of seven monosaccharide standards

圖10 7種單糖標準品的乙?；苌颎C-MS圖譜Fig.10 The acetyl derivatives of seven monosaccharide standards

表6 7種單糖標準品的保留時間及特征離子Table 6 The retention time and characteristic ion of seven monosaccharide standards

圖11 樹莓果肉多糖水解衍生產物GC-MS色譜圖Fig.11 The acetyl derivatives of RPP

3.6 樹莓果肉多糖對小鼠負重游泳時間的影響

通過相關數據整理得到下表7，對表中的數據進行分析后發(fā)現，樹莓果肉多糖與游泳時間之間有著顯著相關性，并且所應用的濃度越高，小鼠力竭游泳時間越長。樹莓果肉多糖低劑量組小鼠的平均力竭游泳時間為647.3±85.4 s，空白對照組的游泳時間為477.5±102.1 s，將兩組數據進行對比發(fā)現，二者差異顯著(P<0.05)；樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠的平均力竭游泳時間分別為872.9±95.7 s和1 072±111.5 s，與空白組相比較，存在極顯著性差異(P<0.01)。

在持續(xù)高強度勞動之后，工作能力呈現出短時間內的降低，這種生理現象即疲勞[18]。力竭游泳時長可以在一定程度上代表運動能力。本研究表明，與空白對照相比，樹莓果肉多糖在50～200 mg/kg的濃度下能顯著提高負重游泳小鼠的運動耐力。

表7 樹莓果肉多糖對小鼠負重游泳時間的影響Table 7 Effect of RPP on loaded-swimming time of mice

3.7 樹莓果肉多糖對小鼠血糖、肝糖原和肌糖原的影響

如表8所示，樹莓果肉多糖處理過的小鼠運動后血清葡萄糖濃度比空白對照組高，且葡萄糖濃度隨樹莓果肉多糖的濃度增加而升高。其中，樹莓果肉多糖低劑量組小鼠運動后的平均血清葡萄糖濃度為8.85±0.71 mmol/L，空白對照組的結果為9.50±0.70 mmol/L，對兩組數據進行對比分析發(fā)現，差異較小；但樹莓果肉多糖中、高劑量組的小鼠運動后平均血清葡萄糖濃度分別為10.55±0.70 mmol/L和12.65±0.68 mmol/L，極顯著地高于空白組(P<0.01)。

此外，樹莓果肉多糖也能較好地維持小鼠運動后肝糖原和肌糖原的水平，且兩種糖原的濃度與兩種樹莓果肉多糖的濃度成正比。如表8所示，樹莓果肉多糖低劑量組小鼠運動后的平均肝糖原的量為6.43±0.31 mg/g，空白對照組的結果為6.12±0.39 mg/g，對兩組數據進行對比分析發(fā)現，差異較小。樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠的運動后平均肝糖原極顯著地高于空白對照組(P<0.01)。樹莓果肉多糖低、中和高劑量組與空白對照組相比，運動后平均肌糖原水平更高，且差異均極其顯著(P<0.01)。

血糖的含量除了可以用來評估機體的糖代謝水平，還可以反映出中樞系統(tǒng)的疲勞情況。多數情況下，機體處于高強度運動狀態(tài)時，依靠糖類物質實現能量的供給，肝糖原和肌糖原水平迅速降低，因此通過明確機體內糖原具體的儲備量，能夠進一步得到機體的運動能力。所以在運動后產生的疲勞恢復時，糖原的合成以及儲備起著關鍵作用[19]。在本研究中，樹莓果肉多糖在100～200 mg/kg濃度時能顯著增加運動小鼠的血糖濃度和肝糖原含量，在50～200 mg/kg濃度時能明顯增加運動小鼠的肌糖原水平。說明樹莓果肉多糖能通過提高小鼠的血糖和糖原水平，為小鼠運動提供充足的能量，從而有效提高小鼠的運動耐力。

表8 樹莓果肉多糖對小鼠血糖、肝糖原和肌糖原的影響Table 8 Effect of RPP on blood glucose,liver glycogen and muscle glycogen of mice

3.8 樹莓果肉多糖對小鼠血清中乳酸和乳酸脫氫酶活性的影響

由表9可知，樹莓果肉多糖低、中和高劑量組小鼠運動后血清中的平均乳酸含量分別為10.83±0.18、10.30±0.05、9.13±0.23 mmol/L，與空白對照組的11.74±0.10 mmol/L相比差異極顯著(P<0.01)，且樹莓果肉多糖組小鼠運動后血清中的平均乳酸含量隨多糖濃度呈負相關。相反，樹莓果肉多糖能明顯提高運動后小鼠血清中乳酸脫氫酶的活性，樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠運動后血清中乳酸脫氫酶的活性分別為37 967.21±15 729.42和97 180.33±2 191.45 U/L，空白對照組的結果為4 524.59±2 712.61 U/L，分析兩組數據發(fā)現，差異極大(P<0.01)，且小鼠的運動后血清中乳酸脫氫酶的活性與樹莓果肉多糖濃度呈正相關。

機體在進行高強度的運動時會產生大量的乳酸，但是借助于乳酸脫氫酶的作用，可以將所產生的乳酸轉化為丙酮酸，從而在一定程度上降低乳酸含量。本研究表明，樹莓果肉多糖在50～200 mg/kg濃度時能明顯減少運動小鼠血清中乳酸的產生，同時，在100～200 mg/kg濃度時能顯著增加運動小鼠血清中乳酸脫氫酶的活性。說明樹莓果肉多糖能通過加速乳酸的清除緩解小鼠運動疲勞。

表9 樹莓果肉多糖對小鼠血清中乳酸和乳酸脫氫酶的影響Table 9 Effects of RPP on lactic acid and lactic dehydrogenase in serum of mice

3.9 樹莓果肉多糖對小鼠血清中尿素氮和肌酸激酶的影響

由表10可見，樹莓果肉多糖處理過的小鼠運動后血清中的平均尿素氮含量和肌酸激酶活性較空白對照組都有明顯的下降，且兩者與樹莓果肉多糖的濃度呈負相關。樹莓果肉多糖低劑量組小鼠運動后平均血清尿素氮含量和肌酸激酶活性分別為0.773±0.068 mmol/L和1.393±0.176 U/mL，與對照相比無顯著性差異。樹莓果肉多糖中、高劑量組小鼠運動后平均血清尿素氮含量和空白對照的結果進行比較后發(fā)現，存在差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)，基于肌酸激酶活性進行對比分析，同血清尿素氮含量的結果。

血清中含有尿素氮以及肌酸激酶，有研究發(fā)現二者含量能夠顯著影響到運動適應性，含量越低，則機體的運動適應性越強[20]。在本研究中，與空白對照相比，樹莓果肉多糖在100～200 mg/kg濃度時能顯著降低小鼠運動后血清中尿素氮含量和肌酸激酶活性。說明樹莓果肉多糖能通過增強小鼠的運動適應性達到抗疲勞效果。

表10 樹莓果肉多糖對小鼠血清中尿素氮和肌酸激酶的影響Table 10 Effects of RPP on urea nitrogen and creatine kinase in serum of mice

以上研究結果與很多植物多糖抗疲勞的研究結果相似，如魔芋多糖可以明顯延長游泳時間，顯示出良好的抗疲勞作用[21]；又如巴戟天多糖能降低NIH小鼠體內的尿素氮和乳酸含量，升高肝糖原含量，達到抗疲勞的效果[22]。

4 結論

樹莓果肉多糖超聲提取的最佳工藝條件為提取溫度58 ℃、提取時間84 min、超聲功率58 W、料液比1∶20，其平均提取得率為11.75%。初步結構分析發(fā)現樹莓果肉多糖含有半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖以及阿拉伯糖6種單糖類型，阿拉伯糖和葡萄糖含量較高；其具有典型的多糖紅外光譜吸收峰，在電鏡下表面粗糙，呈大小不一的卵圓形顆粒?？蛊趯嶒灲Y果表明，樹莓果肉多糖能有效提高游泳小鼠的運動耐力和運動適應性，維持血糖及糖原水平，減少乳酸產生，加速其清除，顯示出較好的抗疲勞活性。下一步我們將進一步從細胞和分子水平揭示其抗疲勞的深層機理，為樹莓多糖的開發(fā)應用夯實理論基礎。