基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討黃芪-女貞子藥對(duì)治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制

陳博威，易 健，劉柏炎,3*，唐榮梅，曾 鋮

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007；3益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，益陽(yáng) 413000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年性癡呆的主要類(lèi)型，以認(rèn)知、生活功能逐漸下降為主要臨床表現(xiàn)。隨著人口老齡化的逐漸加劇，我國(guó)AD的發(fā)病幾率逐年遞增，導(dǎo)致大量老年人日常生活質(zhì)量難以逆轉(zhuǎn)的下降，給家庭、社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。AD發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前主要考慮與β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)的沉積和微管相關(guān)蛋白Tau的過(guò)度磷酸化有關(guān)，包括突觸丟失、特異性神經(jīng)遞質(zhì)減少、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元死亡等多種病理過(guò)程[1]。多年以來(lái)，美國(guó)FDA僅批準(zhǔn)了極少數(shù)治療AD的藥物上市，即乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)拮抗劑，但目前的藥物效果均不理想。如今，如何有效的防治AD，延緩老年人記憶及認(rèn)知功能的下降已成為研究熱點(diǎn)之一。

中醫(yī)藥治療AD在我國(guó)已有數(shù)百年的歷史，其療效已經(jīng)得到認(rèn)可[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，相較既往單純以補(bǔ)腎填髓治療AD的方法，現(xiàn)代中醫(yī)常在此基礎(chǔ)上配伍益氣活血藥[3]，黃芪-女貞子藥對(duì)(Astragalus Radix-Ligustri Lucidi Fructus，AR-LLF)便是其思想體現(xiàn)。黃芪味甘性溫，可外固表虛、充盈腠理、升陽(yáng)舉陷；女貞子味甘、苦、性涼，能滋補(bǔ)肝腎，長(zhǎng)養(yǎng)精神。課題組前期研究表明，女貞子的活性成分齊墩果酸能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]，此外黃芪提取物黃芪多糖也具有減輕AD小鼠神經(jīng)炎性反應(yīng)，并改善認(rèn)知功能的功效[5]。然而，既往的研究多針對(duì)單一靶點(diǎn)與單一機(jī)制，無(wú)法系統(tǒng)的分析黃芪女貞子配伍治療AD多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用特點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新興的藥物研究方法，可有效彌合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)之間的鴻溝，極大地促進(jìn)中藥協(xié)同作用的機(jī)理研究，能夠系統(tǒng)揭示中醫(yī)藥的多靶點(diǎn)效應(yīng)。目前，研究者已將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)廣泛應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、復(fù)方及藥對(duì)配伍規(guī)律的認(rèn)識(shí)和新藥開(kāi)發(fā)等[6]。因此，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，輔以生物信息學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，希望進(jìn)一步闡明黃芪女貞子藥對(duì)治療AD的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選與作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃芪、女貞子的活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。依據(jù)藥物的藥動(dòng)學(xué)特性，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類(lèi)藥性(drug like，DL)≥0.18為篩選條件[7]，并通過(guò)手工篩選，保留部分有明確實(shí)驗(yàn)依據(jù)證明其對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用的成分。如有文獻(xiàn)報(bào)道黃芪甲苷可能通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)來(lái)改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[8]，而齊墩果酸能夠改善AD大鼠的突觸可塑性[4]，且對(duì)AChE有很好的抑制作用[9]。隨后在該數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入各活性成分，查詢(xún)其潛在作用靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)，獲取靶點(diǎn)官方基因名。

1.2 疾病靶點(diǎn)的收集

從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載編號(hào)為GSE28146的基因原始數(shù)據(jù)，該基因數(shù)據(jù)來(lái)自美國(guó)肯塔基州立大學(xué)，包含22個(gè)阿爾茨海默病患者的大腦標(biāo)本，及8個(gè)健康捐獻(xiàn)者的大腦標(biāo)本，基因探針平臺(tái)為GPL570(http://www.agilent.com)。通過(guò)R語(yǔ)言(https://www.r-project.org)“l(fā)imma”包進(jìn)行基因數(shù)據(jù)挖掘，得出差異表達(dá)基因，并用R語(yǔ)言“pheatmap”包繪制火山圖及熱圖。同時(shí)以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞，檢索人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，https://www.genecards.org)，獲取AD已知靶點(diǎn)后，將上述已知標(biāo)靶與GEO篩選出的差異表達(dá)基因合并，構(gòu)建AD的靶點(diǎn)庫(kù)。

1.3 篩選藥物-疾病核心作用基因

通過(guò)Perl軟件相關(guān)腳本，將黃芪、女貞子的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與AD的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲取藥物-疾病關(guān)鍵作用基因。運(yùn)用Cytoscape軟件創(chuàng)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。接著通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入上述獲得的關(guān)鍵作用基因，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，最低互動(dòng)得分設(shè)置為0.4，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。String數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)儲(chǔ)存蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，可對(duì)每個(gè)蛋白相互作用信息進(jìn)行評(píng)價(jià)賦分，由此可以得到黃芪-女貞子藥對(duì)治療AD中排名前列的核心作用基因。

1.4 核心作用基因的富集分析

運(yùn)用R語(yǔ)言將得到的關(guān)鍵作用基因進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析描述了基因產(chǎn)物可能形式的分子功能，參與的生物過(guò)程和所處的細(xì)胞環(huán)境。KEGG通路富集分析是指通過(guò)將已知的基因組注釋信息進(jìn)行分類(lèi)，得出最顯著的生物學(xué)過(guò)程。由此可以預(yù)測(cè)黃芪-女貞子活性成分治療AD的可能作用機(jī)制。

1.5 分子對(duì)接分析

先用ChemOffice 16.0軟件將主要活性成分的3D結(jié)構(gòu)保存為mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載主要靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)PDB格式，運(yùn)用PyMOL軟件(www.pymol.org)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫等操作，利用Auto Dock 4.2軟件將化合物及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后進(jìn)行對(duì)接，能量范圍設(shè)置為3，精度為8，輸出9個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果，并選取其中結(jié)合能最小的對(duì)接模型。一般認(rèn)為結(jié)合能小于-5 kJ/mol時(shí)[7]，配體與受體可以較好結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分篩選與作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)平臺(tái)得到黃芪、女貞子的活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，輔以手工檢索，刪除重復(fù)或暫無(wú)靶點(diǎn)的活性成分后，共計(jì)獲得活性成分26個(gè)，挖掘作用靶點(diǎn)213個(gè)，藥物活性成分詳見(jiàn)表1。

2.2 阿爾茨海默病的相關(guān)靶點(diǎn)的收集

基于GSE28146的GEO基因原始數(shù)據(jù)，以L(fǎng)og2(FC)的絕對(duì)值大于1.5和P<0.05為篩選條件，總共得出372個(gè)差異基因(見(jiàn)圖1和圖2)。同時(shí)檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中AD的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，與GEO篩選出的差異表達(dá)基因合并，刪除重復(fù)項(xiàng)后共計(jì)挖掘出阿爾茨海默病的靶點(diǎn)937個(gè)。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes

圖2 差異表達(dá)前50位基因的熱圖Fig.2 Heat map of top 50 differentially expressed genes

2.3 篩選藥物-疾病核心基因

運(yùn)用Perl軟件，將AD的疾病相關(guān)基因與黃芪、女貞子的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)取交集，獲取有效成分21個(gè)，疾病-藥物關(guān)鍵作用基因41個(gè)。運(yùn)用Cytoscape軟件創(chuàng)建包含62個(gè)節(jié)點(diǎn)及144條邊的活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。其中，活性化合物的節(jié)點(diǎn)度排名依次為槲皮素(quercetin，MOL000098)、山奈酚(kaempferol，MOL000422)、木犀草素(luteolin，MOL000006)及芒柄花黃素(formononetin，MOL000392)(見(jiàn)表2)。借助String數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入上述已獲得的關(guān)鍵作用基因，繪制包含41個(gè)節(jié)點(diǎn)及330條邊的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。另外節(jié)點(diǎn)度排名前列的核心作用基因依次為AKT1、IL6、CASP3、JUN、IL1B、MAPK1、PTGS2、VEGFA、MAPK8、CCL2等(見(jiàn)圖5)。

圖3 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Active component-target network注：圖中綠色代表黃芪的有效成分；黃色代表女貞子的有效成分；紅色為共有的有效成分；橙色代表基因。 Note:Green:Astragalus Radix;Yellow:Ligustri Lucidi Fructus;Red:Multidrug;Orange:Gene.

表2 主要活性成分的節(jié)點(diǎn)度排名Table 2 Node ranking of main active ingredients

2.4 關(guān)鍵作用基因的富集分析

將篩選出的41個(gè)關(guān)鍵作用基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，共獲得1 205個(gè)GO功能富集與136個(gè)KEGG通路富集，富集的分子功能為血紅素結(jié)合、輔因子結(jié)合及四吡咯結(jié)合等(見(jiàn)圖6)；生物過(guò)程主要富集在對(duì)脂多糖、細(xì)菌及氧化應(yīng)激的反應(yīng)(見(jiàn)圖7)；細(xì)胞組成主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞膜膜筏及細(xì)胞膜小窩上(見(jiàn)圖8)。KEGG主要富集在阿爾茨海默病通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、白介素-17(IL-17)信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡等(見(jiàn)圖9)。最后將排名前20的KEGG富集結(jié)果可視化(見(jiàn)圖10)。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein-protein interaction network map

圖5 核心作用基因排名Fig.5 Core gene ranking

2.5 分子對(duì)接分析

依據(jù)活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)度值排名并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，課題組將主要活性成分黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素分別與治療AD的公認(rèn)靶點(diǎn)AChE(PDB ID：1B41)、NMDAR(PDB ID：2HQW)進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果可知，各化合物與目標(biāo)受體蛋白對(duì)接的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，說(shuō)明各分子與目標(biāo)受體均能較好結(jié)合，結(jié)果見(jiàn)表2。其中主要活性成分黃芪甲苷和齊墩果酸的分子對(duì)接圖見(jiàn)圖11～14。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”多層次網(wǎng)絡(luò)，來(lái)觀(guān)察藥物對(duì)疾病的干預(yù)和影響，具有整體性和系統(tǒng)性特點(diǎn)；而生物信息學(xué)則在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上系統(tǒng)的分析了疾病的基因變化，這與中醫(yī)辨證論治的整體思想不謀而合。本研究篩選出黃芪-女貞子藥對(duì)的有效成分21個(gè)，主要包括黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素等，關(guān)鍵靶點(diǎn)有AKT1、IL6、CASP3、JUN、IL1B及MAPK1等。相關(guān)基礎(chǔ)研究也證實(shí)了上述成分及靶點(diǎn)的作用，如黃芪甲苷能夠通過(guò)減輕氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，改善AD患者的記憶能力[10]；齊墩果酸能夠改善AD大鼠的突觸可塑性，且對(duì)AChE有很好的抑制作用[9]；山奈酚能夠調(diào)控MAPK通路的活性，降低AD模型的氧化應(yīng)激并抑制AchE活性，從而改善其認(rèn)知功能[11]。槲皮素能夠延緩Aβ沉積速度，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生，并改善AD大鼠記憶功能[12]。木犀草素能通過(guò)減輕大腦神經(jīng)炎性病變，降低細(xì)胞凋亡及抑制Aβ和Tau的聚集[13]，從而改善AD大鼠的記憶功能。芒柄花黃素可通過(guò)MAPK、TNF及PI3K/Akt等信號(hào)通路，抑制AD腦內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，并改善海馬區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)[14]，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。分子對(duì)接結(jié)果亦表明黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素均能與AD標(biāo)志性靶點(diǎn)AChE和NMDAR結(jié)合，一定程度上驗(yàn)證了本研究的準(zhǔn)確性。此外，通過(guò)圖2，發(fā)現(xiàn)黃芪與女貞子在治療過(guò)程中既有自己?jiǎn)为?dú)的活性成分與作用靶點(diǎn),亦有共同的活性成分與作用靶點(diǎn)，并且不同活性成分可以作用于共同的靶標(biāo)，同一活性成分亦可同時(shí)從網(wǎng)絡(luò)上影響不同的靶點(diǎn)，體現(xiàn)出了兩藥具有多成分、多靶點(diǎn)，可協(xié)同治療的作用特征。

圖6 GO富集分析(分子功能)Fig.6 GO enrichment analysis (molecular function)

圖7 GO富集分析(生物過(guò)程)Fig.7 GO enrichment analysis (biological process)

圖8 GO富集分析(細(xì)胞組成)Fig.8 GO enrichment analysis (cellular component)

圖9 KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment analysis

圖10 KEGG富集分析的可視化圖Fig.10 Visualization diagram of KEGG enrichment analysis

表3 主要有效成分分子對(duì)接的結(jié)合能Table 3 The binding energy of active molecules and related core targets

圖11 黃芪甲苷-AChE分子對(duì)接圖Fig.11 Molecular docking pattern map of astragaloside-AChE

圖12 黃芪甲苷-NMDAR分子對(duì)接圖Fig.12 Molecular docking pattern map of astragaloside-NMDAR

圖13 齊墩果酸-AChE分子對(duì)接圖Fig.13 Molecular docking pattern map of oleanolic acid-AChE

圖14 齊墩果酸-NMDAR分子對(duì)接圖Fig.14 Molecular docking pattern map of oleanolic acid-NMDAR

本研究通過(guò)GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)生物過(guò)程主要與血紅素結(jié)合、輔因子結(jié)合、四吡咯結(jié)合及對(duì)脂多糖的反應(yīng)等有關(guān)，而排名最前的KEGG通路富集結(jié)果即為阿爾茨海默病相關(guān)信號(hào)通路，體現(xiàn)出黃芪-女貞子配伍治療AD具有較強(qiáng)的靶向性。此外其他主要富集的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及IL-17信號(hào)通路均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。有關(guān)研究表明，AD的主要病理特征為大腦出現(xiàn)Aβ蛋白沉積所形成的神經(jīng)炎性斑即老年斑，而AD患者腦內(nèi)所存在的免疫和炎癥反應(yīng)，是Aβ蛋白沉積所致的慢性非可控性炎癥過(guò)程。目前，炎癥因子與老年斑之間的相互作用已經(jīng)被證實(shí)：AD患者大腦中存在大量的炎癥介質(zhì)，特別在老年斑塊周?chē)梢?jiàn)TNF-α與IL-1β炎癥因子大量表達(dá)；使用TNF-α、IL-1β抑制劑干預(yù)后，可顯著改善AD大鼠的運(yùn)動(dòng)認(rèn)知功能，并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少老年斑聚集[15]。AGE-RAGE信號(hào)通路是“損傷反應(yīng)基因”的十字路口，研究發(fā)現(xiàn)AD患者大腦內(nèi)老年斑中有AGEs聚積，同時(shí)與AD病理改變有關(guān)的異常結(jié)構(gòu)成分如極低密度脂蛋白、C反應(yīng)蛋白及載脂蛋白E均存在糖基化現(xiàn)象，此外AGE-RAGE信號(hào)通路可通過(guò)影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬及氧化應(yīng)激等多種途徑促進(jìn)AD的發(fā)生和發(fā)展[16]；而阻斷AGE-RAGE信號(hào)通路可以降低NF-κB的活性，抑制炎癥反應(yīng)，并減少氧化應(yīng)激，改善認(rèn)知功能障礙[17]。此外，AD患者癥狀嚴(yán)重程度與腦內(nèi)TNF-α的表達(dá)水平呈正性相關(guān)，相反抑制TNF-α的表達(dá)可以有效改善AD患者的認(rèn)知功能[18]。IL-17是炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，AD患者大腦中IL-17的表達(dá)會(huì)顯著升高[19]。IL-17可通過(guò)影響下游NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而激活小膠質(zhì)細(xì)胞及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的方式，參與AD的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，而封閉IL-17受體后可以降低炎癥反應(yīng)并抑制細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[20]。綜上，課題組推測(cè)降低炎癥反應(yīng)可能是黃芪女貞子配伍治療AD的作用機(jī)制之一。

此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡可能是黃芪女貞子潛在治療途徑。細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元丟失的主要形式之一，也是AD的重要病理變化，有研究表明，Aβ蛋白會(huì)誘導(dǎo)大腦神經(jīng)元的凋亡，加重腦損傷。近年來(lái)的研究也證實(shí)黃芪、女貞子的活性成分可以通過(guò)減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其在治療AD上的優(yōu)勢(shì)[21]。值得注意的是，本研究主要富集的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路也均是調(diào)控細(xì)胞凋亡的上游信號(hào)位點(diǎn)[22]。而本次蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中排名前列的核心作用基因如AKT1、CASP3、JUN、MAPK1與PTGS2等亦均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[23]。這表明黃芪-女貞子藥對(duì)的治療靶標(biāo)具有多網(wǎng)絡(luò)、多環(huán)節(jié)、相互交叉的協(xié)同作用特點(diǎn)，也體現(xiàn)出中醫(yī)“整體治療理念”的科學(xué)內(nèi)涵。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，輔以生物信息學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，初步探討了黃芪-女貞子藥對(duì)治療AD的潛在分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)其治療機(jī)制涉及到有效成分21個(gè)和關(guān)鍵作用基因41個(gè)，主要與抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等多個(gè)病理過(guò)程有關(guān)，并通過(guò)分子對(duì)接初步驗(yàn)證了其主要有效成分黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素等均能與靶點(diǎn)結(jié)合，能夠?yàn)榻窈蟮呐R床運(yùn)用和藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。但考慮中藥煎煮及在體內(nèi)活性成分可能發(fā)生變化的復(fù)雜性，故仍有必要通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。