化瘀通絡中藥通過TAK1/JNK通路抑制巨噬細胞浸潤及活化改善糖尿病腎病大鼠腎臟炎癥

郭 帥，方 敬，李雅純，楊 帆，陳志強,3*

1河北中醫(yī)學院；2河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院；3河北省中醫(yī)院，石家莊 050000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見且嚴重的并發(fā)癥，是世界范圍內(nèi)導致終末期腎病的首要原因[1]。目前對DN的治療主要是限制膳食鈉攝入、控制血糖、降壓及阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)等，雖可以一定程度上延緩DN的進展，但其療效并不理想[2]。越來越多的證據(jù)表明，炎癥反應在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用，巨噬細胞浸潤及活化是腎臟炎癥的中心環(huán)節(jié)[3]。TAK1/JNK信號通路是調(diào)節(jié)巨噬細胞浸潤及活化的重要通路[4]。因此，阻斷TAK1/JNK信號通路是防治DN的有效策略。

本課題組認為“瘀血阻絡”是DN的基本病機，在辨證論治的基礎(chǔ)上加化瘀通絡中藥成為治療DN的基本原則。化瘀通絡類中藥包含藥物眾多，本課題組經(jīng)過20余年的臨床實踐，反復篩選，最終確定了川芎、丹參、地龍、水蛭、全蝎5味中藥作為相對固定的治療DN的基本藥物。本課題組前期研究證實化瘀通絡中藥可以抑制DN大鼠腎臟RAS的激活，可以減少足細胞裂孔膜蛋白及骨架蛋白的丟失，延緩DN的進展[5,6]。但尚無該藥對DN狀態(tài)下炎癥反應的研究。鑒于此，本研究以SD大鼠為研究對象，觀察化瘀通絡中藥對DN大鼠腎組織巨噬細胞浸潤、活化及TAK1/JNK信號通路的影響，進一步明確化瘀通絡中藥的作用靶點，為其臨床推廣應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠40只，3～5周齡，體質(zhì)量60～80 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥物

化瘀通絡中藥顆粒劑：丹參(1.8 g/袋，相當于飲片10 g，批號：8080971)、川芎(1.3 g/袋，相當于飲片6 g，批號：8122561)、地龍(1.0 g/袋，相當于飲片10 g，批號：7125701)、水蛭(1.5 g/袋，相當于飲片3 g，批號：8081351)、全蝎(1.0 g/袋，相當于飲片3 g，批號：8050111)，由廣東一方制藥有限公司惠贈。

1.3 實驗儀器和試劑

IX71熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；Nano Drop 2000C紫外分光光度計(Thermo Scientific公司)；DYCZ-24DN電泳儀(北京六一公司)；WSE-4040半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(ATTO公司)；Odyssey紅外激光掃描儀(LI-COR公司)。

大鼠尿蛋白ELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)；大鼠MCP-1 ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)；大鼠IL-1βELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)；大鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)；β-actin抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；CD68抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；iNOS抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；TAK1抗體(CST公司)；p-TAK1抗體(CST公司)；JNK抗體(CST公司)；p-JNK抗體(CST公司)。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

實驗大鼠40只，普通飼料適應性喂養(yǎng)1周，檢測血糖、尿糖和尿蛋白，均為陰性者用于實驗。隨機分為正常組(C組)10只、造模組30只，C組大鼠予普通飲食，造模組大鼠予高糖高脂飼料(購自北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司，CAS號：HD001)喂養(yǎng)，6周后，所有動物禁食不禁水12 h，造模組大鼠予一次性腹腔注射STZ(40 mg/kg)，72 h后尾靜脈連續(xù)3次采血檢測隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。造模過程中無大鼠死亡，2只大鼠血糖<16.7 mmol/L予以剔除。將造模成功的大鼠隨機分為2組：模型組(M組)14只和化瘀通絡中藥組(Z組)14只。C組給予等體積不含STZ的枸櫞酸緩沖液腹腔注射。

2.2 給藥方法

Z組大鼠灌服中藥。成人臨床使用劑量為：丹參15 g、川芎12 g、地龍10 g、水蛭6 g、全蝎6 g。按照人和大鼠體表面積法，計算大鼠的給藥劑量為：丹參1.35 g/(kg·d)，川芎1.08 g/(kg·d)，地龍0.9 g/(kg·d)，水蛭0.54 g/(kg·d)，全蝎0.54 g/(kg·d)。以上劑量均指中藥飲片量。灌胃1次/日，連續(xù)給藥16周。C組和M組灌服相應體積的蒸餾水。

2.3 標本采集

干預16周末，在代謝籠中收集24 h尿液并記錄尿量。大鼠禁食12 h后稱重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主動脈取血；留取部分腎組織立即置入4%中性甲醛，4 ℃保存，待行免疫熒光檢查；留取部分腎組織置于凍存管中，迅速放入液氮，短暫冷卻后移入-80 ℃超低溫冰箱保存，待行Western blot檢測。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 24 h UTP的檢測

將收集到的24 h尿液，離心10 min(3 500 rpm)，取上清，按照ELISA試劑盒操作說明檢測各組大鼠尿蛋白濃度。

2.4.2 MCP-1、IL-1β和TNF-α的檢測

將采集的血液，離心10 min(3 500 rpm)，取上清，采用ELISA試劑盒檢測血清中MCP-1、IL-1β和TNF-α的濃度。

2.4.3 免疫熒光法檢測腎組織CD68和iNOS的表達

石蠟切片脫蠟至水，高壓修復(CD68的修復液是檸檬酸，iNOS修復液為EDTA修復液)，血清封閉，加一抗(CD68 1∶100，iNOS 1∶100)4 ℃孵育過夜，加二抗避光37 ℃孵育30 min，DAPI復染細胞核，淬滅組織自發(fā)熒光，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.4 Western blot法檢測腎組織TAK1、p-TAK1、JNK和p-JNK蛋白的表達

從大鼠腎組織提取總蛋白，用BCA法定量。5×上樣緩沖液稀釋，95 ℃變性5 min。蛋白質(zhì)樣品在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜室溫封閉1 h后，在4 ℃與一抗(TAK1 1∶600，p-TAK1 1∶750，JNK 1∶600，p-JNK 1∶750)孵育過夜，在37 ℃與二抗孵育1 h。使用ECL發(fā)光試劑反應后，充分洗膜。掃描存檔，PhotoShop整理去色，用Quantity one軟件測定條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠死亡情況

干預16周內(nèi)，M組大鼠死亡4只，Z組大鼠死亡3只。

3.2 各組大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平的比較

與C組比較，M組大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平均明顯升高(P<0.001)；與M組比較，Z組大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低(P<0.001，P<0.001，P<0.01，P<0.001)。提示化瘀通絡中藥可以降低DN大鼠蛋白尿，下調(diào)炎癥因子水平(見表1)。

表1 各組大鼠24 h UTP、MCP-1、IL-1β和TNF-α水平的比較Table 1 Compariton of 24 h UTP,MCP-1,IL-1β and TNF-α of rats in different groups

3.3 各組大鼠腎組織CD68和iNOS蛋白表達水平的比較

免疫熒光結(jié)果顯示，C組僅在腎間質(zhì)有少量CD68和iNOS蛋白的沉積，而M組在腎間質(zhì)有大量CD68和iNOS蛋白的沉積，Z組CD68和iNOS蛋白的沉積較M組顯著減少。提示化瘀通絡中藥可以抑制DN大鼠腎臟巨噬細胞浸潤和活化(見圖1)。

3.4 各組大鼠腎組織TAK1、p-TAK1、JNK和p-JNK蛋白表達水平的比較

Western blot結(jié)果顯示，與C組比較，M組大鼠p-TAK1和p-JNK蛋白的表達量明顯增多(P<0.001)；與M組比較，Z組p-TAK1和p-JNK蛋白的表達量均顯著減少(P<0.05)；而TAK1和JNK在各組的表達量無明顯差異(P>0.05)。提示化瘀通絡中藥可以抑制DN大鼠TAK1/JNK信號通路(見圖2)。

圖1 各組大鼠腎組織CD68和iNOS蛋白表達水平的比較(×200)Fig.1 Expression of CD68 and iNOS proteins in each group by Immunofluorescent(×200)

圖2 各組大鼠腎組織TAK1、p-TAK1、JNK和p-JNK蛋白表達水平的比較Fig.2 Expression of TAK1,p-TAK1,JNK and p-JNK proteins in each group by Western blot注：與C組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；與M組比較，#P<0.05；##P<0.01； ###P<0.001。Note:Compared with C group, *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;Compared with M group,#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001.

4 討論

近年來，中醫(yī)對DN有較深入的認識，多數(shù)醫(yī)家以瘀血立論。消渴發(fā)病，氣虛無力運血則血行遲緩，日久漸致血瘀；陰虛火旺，煎熬津液，則津虧血少，血液粘稠不暢，日久而致血瘀。《血證論·瘀血》謂：“瘀血在經(jīng)絡臟腑之間，則結(jié)為癥瘕”，《醫(yī)宗必讀》曰：“蓋積之為義，日積月累，匪伊朝夕”，瘀血遷延不愈，由經(jīng)及絡，絡病乃成。DN病程冗長，故其進展符合中醫(yī)學聚而成形、久而成積、瘀而絡阻的變化?！梆鲅杞j”貫穿DN始終，是其基本病機，活血化瘀通絡法已成為DN的基本治療法則。然此瘀血息以成積不易消散，非常規(guī)活血化瘀藥所能及，故本課題組在應用丹參、川芎等常規(guī)活血化瘀藥基礎(chǔ)上，加用水蛭、地龍、全蝎等功專疏通絡脈蟲類藥。丹參是活血祛瘀之要藥，其主要有效成分為丹參酚酸類和丹參酮類物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學研究表明丹參可以調(diào)節(jié)DN患者和實驗動物的糖脂代謝，抑制氧化應激、炎癥及纖維化，保護腎功能[7,8]。川芎具有活血行氣之功效，其主要有效成分為川芎嗪和阿魏酸，現(xiàn)代藥理學研究表明川芎具有抑制血小板聚集和血栓形成，降低血液粘滯度，減少系膜細胞增殖，抑制內(nèi)皮細胞增生等多種生物活性[9]。水蛭功效為破血，逐瘀，通經(jīng)。水蛭的主要有效成分是水蛭素，具有抗凝，抗栓，降脂，抑制炎癥反應，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，減少腎小管上皮細胞凋亡，減輕腎纖維化等作用[10]。地龍治療腎病取其通絡，利尿之功效。地龍含蚓激酶，具有改善纖溶系統(tǒng)的失衡，抑制血小板活化，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，抑制腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)過度積聚的作用[11]。全蝎具有祛風，通絡，散結(jié)的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，全蝎可抗凝，抗血栓，促纖溶，增加腎血流量，降低蛋白尿[12,13]。此五味藥合用，可使絡脈得通，瘀滯盡去。

近期研究表明，巨噬細胞浸潤是DN炎癥反應的特征性表現(xiàn)之一[3]。在DN患者和DN動物模型腎組織中均發(fā)現(xiàn)有巨噬細胞浸潤，且其浸潤程度與DN蛋白尿程度和腎功能減退呈正相關(guān)[14-17]。研究表明，決定腎臟疾病發(fā)展方向的主要因素并不在于巨噬細胞浸潤的數(shù)量，而是在于局部組織中巨噬細胞的活化狀態(tài)[18]。腎臟損傷后，血液中的單核細胞遷入腎組織分化成巨噬細胞，巨噬細胞在特定的微環(huán)境中獲得兩種不同的活化表型，即經(jīng)典活化巨噬細胞(M1)和非經(jīng)典活化巨噬細胞(M2)。M1巨噬細胞通過分泌iNOS、趨化因子(MCP-1、IL-8)及促炎因子(TNF-α、IL-1β)等，介導腎臟的炎癥和纖維化；而M2產(chǎn)生抗炎因子IL-1、IL-10等，具有抗炎和組織修復功能。iNOS是M1巨噬細胞活化的標志。在腎損傷早期階段以M1巨噬細胞浸潤為主，并釋放MCP-1、IL-1β、TNF-α、ROS等炎癥因子，誘導并加強炎癥反應。在本研究中，與正常組比較，模型組大鼠腎組織CD68陽性巨噬細胞聚集增加，M1巨噬細胞活化標志物iNOS的表達增多，MCP-1、IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平升高?；鐾ńj中藥可以抑制DN大鼠腎臟巨噬細胞的浸潤、活化及炎癥因子的釋放，減輕腎臟炎癥反應。

DN腎組織中巨噬細胞的浸潤和激活與TAK1/JNK信號通路密切相關(guān)。JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)。每個MAPK家族都由一組三個順序起作用的激酶組成：MAPKK激酶(MAPKKK)，MAPK激酶(MAPKK)和MAPK?；罨腗APKKK可磷酸化MAPKK而將其激活，活化的MAPKK將MAPK磷酸化而激活，活化的MAPK可以轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來，動物實驗和細胞實驗已證實，JNK通路促進腎臟炎癥反應[19-21]。TAK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于MAPKKK家族的一員，位于JNK的上游，是JNK信號轉(zhuǎn)導的重要信號分子。在人類DN、IgA腎病、腎移植缺血/再灌注等腎臟疾病中，均可見TAK1/JNK信號通路的激活，且與炎癥反應的進展密切相關(guān)[22,23]。在UUO小鼠中，抑制TAK1/JNK信號通路可以減少巨噬細胞浸潤，抑制M1巨噬細胞活化，降低炎癥因子水平[4,19]。在本研究中，與正常組比較，DN大鼠TAK1/JNK信號通路顯著激活?；鐾ńj中藥可以顯著降低TAK1/JNK信號通路相關(guān)蛋白的表達，抑制TAK1/JNK信號通路的激活。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，化瘀通絡中藥可以改善DN大鼠的蛋白尿，減輕腎臟炎癥反應，作用機制可能與其抑制TAK1/JNK信號通路介導的巨噬細胞浸潤、活化以及炎性因子的釋放有關(guān)。