大黃素調(diào)控miR-21介導(dǎo)細(xì)胞自噬減輕糖尿病腎病小鼠腎臟氧化性損傷機(jī)制研究

齊寶寧，熊永愛(ài)，潘艷芳，徐守竹，紀(jì)明睿，王嘉欣，王 一，鄒佳盈

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院，西安712046；2遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遵義563000；3陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，西安712046

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)的嚴(yán)重繼發(fā)性腎小球疾病，也是慢性腎衰竭的常見(jiàn)原因。血糖過(guò)高可引發(fā)腎臟氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)在腎臟固有細(xì)胞內(nèi)蓄積，可造成足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞等的氧化損傷，加劇DN的發(fā)生發(fā)展[1]。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要內(nèi)降解機(jī)制，作用在通過(guò)溶酶體蛋白的降解，清除受損的結(jié)構(gòu)或過(guò)度表達(dá)的蛋白，參與維持細(xì)胞更新和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。DN病理生理過(guò)程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，細(xì)胞自噬清除錯(cuò)誤的折疊蛋白和受損細(xì)胞器，促使自噬體形成和自噬-溶酶體的融合，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的ROS可誘導(dǎo)自噬發(fā)生，自噬可以清除自由基緩解氧化應(yīng)激對(duì)腎組織和細(xì)胞的損傷，是細(xì)胞的重要促生存機(jī)制。有效誘導(dǎo)自噬，控制炎癥過(guò)程是治療DN的有效策略。

近年來(lái)研究表明，微RNAs(microRNAs，miRNAs)在DN患者中異常表達(dá)并參與系膜細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)聚集及足細(xì)胞損傷等DN的病理過(guò)程，尤其是microRNA-21(miR-21)更是成為研究的熱點(diǎn)。miR-21普遍存在并調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增生、凋亡，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，DN患者血清miR-21濃度顯著高于正常人，且在DN患者腎組織活檢中發(fā)現(xiàn)miR-21與腎小管間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)[2,3]。因此，沉默miR-21或抑制其表達(dá)對(duì)抑制糖尿病長(zhǎng)期或短期并發(fā)癥有重要意義。而miR-21被報(bào)道可通過(guò)調(diào)控Akt/mTOR、PTEN等信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞自噬[4]。但目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中未見(jiàn)通過(guò)調(diào)控miR-21介導(dǎo)細(xì)胞自噬減輕糖尿病腎病腎臟氧化性損傷相關(guān)報(bào)道。

大黃素(emodin，EM)是蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.和藥用大黃RheumoffcihaleBaill.的有效活性成分，屬于蒽醌類(lèi)化合物，具有抑菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、改善腎功能等藥理作用[5,6]。前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，大黃素可通過(guò)抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡來(lái)延緩DN的進(jìn)展。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，25 mmol/L葡萄糖可以顯著促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞miR-21的表達(dá)。本研究擬從調(diào)控miR-21介導(dǎo)細(xì)胞自噬探討大黃素減輕糖尿病腎病小鼠腎臟氧化性損傷的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(陜)2012-002。

大黃素(emodin，CAS：518-82-1，成都格利普生物科技有限公司)；anti-P62(貨號(hào)ab227207，英國(guó)abcam公司);anti-Atg7(貨號(hào)ab80639，英國(guó)abcam公司)，anti-LC3(貨號(hào)ab128025，英國(guó)abcam公司);小鼠血尿素氮(BUN)Elisa試劑盒(貨號(hào)YS06475B，上海雅吉生物科技有限公司);肌酐(Cr)Elisa試劑盒(貨號(hào)YS059871B，上海雅吉生物科技有限公司);尿白蛋白排泄率(uAE)Elisa試劑盒(貨號(hào)YS035742B，上海雅吉生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司。血糖試紙購(gòu)自三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

JEM-F200型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)；BJ005266型PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；BG-verMIDI型垂直式電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司)；Image Lab型凝膠分析系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；MK3型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)；FPMIC-razoII型病理切片機(jī)(孚光精儀(中國(guó))有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DN模型建立

實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，喂養(yǎng)高脂高糖飼料(實(shí)驗(yàn)室自制。配方：豬油∶蔗糖∶蛋黃∶基礎(chǔ)飼料=18∶20∶3∶59)，連續(xù)8周，自實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始按100 mg/kg劑量腹腔注射STZ檸檬酸鈉溶液，連續(xù)7天。實(shí)驗(yàn)第8天尾靜脈檢測(cè)小鼠血糖水平，以血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病模型成模標(biāo)準(zhǔn)。DN小鼠需具備以下條件：隨機(jī)血糖大于13.8 mmol/L，并伴有胰島素抵抗；出現(xiàn)尿蛋白、腎功能異常及相應(yīng)腎組織病理學(xué)特征，視為模型建立成功[5]。造模及各實(shí)驗(yàn)組給藥時(shí)間節(jié)點(diǎn)見(jiàn)圖1。

圖1 造模及各實(shí)驗(yàn)組給藥時(shí)間節(jié)點(diǎn)Fig.1 Model and administration time points of each group

2.2 分組與給藥

選擇模型建立成功的小鼠，按體重隨機(jī)分為模型組(model)、格列美脲組(glim，0.6 mg/kg/d，ig)、Emo高劑量組(50 mg/kg/d，ig)、Emo低劑量組(25 mg/kg/d，ig)，每組10只。另取10只未建立模型小鼠作為正常組(normal)。自造模第7周開(kāi)始灌胃(ig)給藥，連續(xù)7天。實(shí)驗(yàn)第8天，尾靜脈取血檢測(cè)血糖(blood glucose，BG)，取血后用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，頸椎離斷處死后取腎臟，置冰臺(tái)上去除被膜，濾紙吸干血跡后稱(chēng)質(zhì)量。部分小鼠腎臟處理如下：取少量左腎上極皮質(zhì)固定于預(yù)冷的2.5%戊二醛中，用于電鏡檢測(cè)；其余腎臟縱向切開(kāi)，1/4置于10%中性福爾馬林中固定，然后進(jìn)行PAS染色，另外1/4腎臟進(jìn)行冰凍切片。部分小鼠腎臟用于分離腎小球。

3 檢測(cè)指標(biāo)

3.1 腎臟重量系數(shù)檢測(cè)

以左右兩側(cè)腎臟重量(mg)除以小鼠體重(g)來(lái)作為腎臟重量系數(shù)(mg/g)。

3.2 病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟組織，經(jīng)10%中性福爾馬林固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，電子顯微鏡檢測(cè)腎臟病理形態(tài)改變。

3.3 腎小球ROS含量檢測(cè)

采用ROS熒光探針-二氫乙啶法(dihydroethidium，DHE)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟ROS含量。DHE可自由透過(guò)活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化形成氧化乙啶，氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。再利用流式細(xì)胞儀測(cè)定ROS陰性細(xì)胞和ROS陽(yáng)性細(xì)胞的比值即可表征腎小球ROS含量。

3.4 腎臟生化指標(biāo)檢測(cè)

取各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟組織，以生理鹽水為勻漿介質(zhì)手動(dòng)勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上清勻漿液，ELISA測(cè)定腎臟組織BUN、Cr、uAE含量。

3.5 電鏡檢測(cè)

取小鼠腎臟皮質(zhì)組織，用3%的戊二醛固定3 h，再用1%的鋨酸固定1 h，50%～90%的丙酮梯度脫水，Epon812包埋。取包埋塊進(jìn)行薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下半薄定位后進(jìn)行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，最后在透射電鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組腎臟足細(xì)胞自噬情況。

3.6 RT-qPCR檢測(cè)

TRIzol法提取腎臟組織RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，進(jìn)一步使用SYBR-Green在PIKO Red96 RT-PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行qPCR。以U6為內(nèi)參，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟miR-21水平。所用引物如下：miR-21：5′-UACTAUUCCAAAGAAGTCACCAC-3′；U6：5′-CGATGTTGACATCCGTAAAGACC-3′。

3.7 Western blot檢測(cè)

取腎臟組織約100 mg，樣品加適量RIPA buffer細(xì)胞裂解液，細(xì)胞樣品器反復(fù)吹打，組織樣品使用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，然后冰上孵育30 min。12 000 rpm，4 ℃離心20 min，轉(zhuǎn)移上清至新管。使用Lowry法測(cè)定上清液中蛋白含量，根據(jù)蛋白含量制作樣品。SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS中封閉，加入一抗，4 ℃封閉過(guò)夜；第2天用TBS洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下?lián)u床上孵育1 h；取出 PVDF膜，用TBST洗3次，每次5 min。應(yīng)用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像，使用ScionImage軟件對(duì)蛋白電泳帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來(lái)表示p62、Atg7、LC3的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖2 大黃素對(duì)DN小鼠腎臟重量指數(shù)的影響Fig.2 Effects of emodin on kidney weight index in DN mice注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。Note:Compared with normal,△ P<0.05;Compared with model,* P< 0.05.

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 對(duì)小鼠腎臟重量系數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟重量系數(shù)顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟重量系數(shù)顯著減小(P<0.05)。表明大黃素口服給藥可明顯減輕DN小鼠腎臟炎性水腫。同時(shí)Glim組小鼠腎臟重量系數(shù)較模型組比較也顯著減小(P<0.05)。

4.2 對(duì)小鼠腎臟病理形態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖3A所示，正常組小鼠毛細(xì)血管清晰，呈網(wǎng)狀，系膜區(qū)未見(jiàn)增生。DN小鼠炎癥性水腫、纖維化明顯，如圖3B所示。大黃素高、低劑量組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，圖3D和圖3E所示。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟病理形態(tài)(HE，×200)Fig.3 Pathological morphology of mouse kidney in each experimental group(HE，×200)注：A:Normal；B:Model；C:Glim；D:Emo 50 mg/kg；E:Emo 25 mg/kg，下同。 Note:A:Normal;B:Model;C:Glim;D:Emo 50 mg/kg;E:Emo 25 mg/kg,the same below.

4.3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟ROS含量比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟ROS含量顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟ROS含量顯著減少(P<0.05)。表明大黃素口服給藥可明顯清除DN小鼠腎臟ROS。Glim組小鼠腎臟ROS與模型組比較無(wú)顯著變化。

4.4 對(duì)DN小鼠血糖(BG)和腎臟BUN、Cr、uAE含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。與正常組比較，模型組小鼠BG、BUN、Cr和uAE含量均顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，大黃素高、低劑量組小鼠BG、BUN、Cr和uAE含量均顯著降低(P<0.05)。同時(shí)Glim組小鼠BG、BUN、Cr和uAE含量較模型組也均顯著降低(P<0.05)。

4.5 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟足細(xì)胞自噬的透射電鏡觀測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖5A可見(jiàn)，正常組小鼠腎臟足細(xì)胞可見(jiàn)較多自噬體及凋亡小體，表明正常情況下，腎臟足細(xì)胞自噬程度較高；DN發(fā)生時(shí)，足細(xì)胞自噬體和凋亡小體明顯減少；而大黃素作用后，小鼠腎臟足細(xì)胞自噬體及凋亡小體明顯增多，如圖5D、5E所示，表明大黃素口服可顯著促進(jìn)DN小鼠腎臟足細(xì)胞自噬。Glim組小鼠腎臟足細(xì)胞也能觀測(cè)到少量自噬體，但和模型組比較無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖5C)。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟ROS含量Fig.4 ROS content in kidney of mice in each experimental group注：與正常組比較，△ P<0.05；與模型組比較，* P<0.05。Note:Compared with normal,△P<0.05;Compared with model,*P<0.05.

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖和腎臟BUN、Cr、uAE含量Table 1 Blood glucose and kidney BUN,Cr,uAE contents of mice in each experimental group

4.6 對(duì)DN小鼠腎臟miR-21表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟miR-21表達(dá)顯著增多(P<0.05)；表明miR-21與DN的發(fā)生呈正相關(guān)。與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟miR-21表達(dá)顯著減少(P<0.05)，提示大黃素可下調(diào)DN小鼠腎臟miR-21的表達(dá)。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟足細(xì)胞自噬的電鏡檢測(cè)Fig.5 Electron microscope detection of autophagy of kidney podocytes of mice in each experimental group

4.7 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟p62、Atg7、LC3蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟p62、Atg7、LC3蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟p62、Atg7、LC3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。

5 討論與結(jié)論

糖尿病腎病患者及動(dòng)物模型腎組織中已被證實(shí)有氧化應(yīng)激和凋亡發(fā)生，體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥等事件。腎臟足細(xì)胞對(duì)于維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的完整性、調(diào)節(jié)腎小球的通透性具有重要作用。在此過(guò)程中，腎小球足細(xì)胞自噬與糖尿病腎病發(fā)病密切相關(guān)。一旦足細(xì)胞自噬活性改變，過(guò)度激活或者被抑制，都會(huì)造成足細(xì)胞炎性損傷、濾過(guò)屏障受損[8,9]。本實(shí)驗(yàn)中我們也觀察到DN小鼠腎臟足細(xì)胞自噬嚴(yán)重不足，同時(shí)ROS顯著增多，ROS是足細(xì)胞線粒體內(nèi)的信號(hào)分子，是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展始動(dòng)的環(huán)節(jié)[10]，減少ROS產(chǎn)生是一種潛在的預(yù)防DN 進(jìn)展的方法。小鼠灌胃給與大黃素以后，我們觀察到腎臟ROS顯著減少，自噬程度得到增強(qiáng)，進(jìn)而一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)得到改善，如腎臟炎性病理?yè)p傷明顯減輕、BUN、Cr和uAE含量顯著降低。因此，通過(guò)促進(jìn)自噬清除高糖誘導(dǎo)的小鼠腎臟ROS可能是大黃素改善DN小鼠的重要機(jī)制。同時(shí)我們也看到，Glim也可顯著降低DN小鼠BUN、Cr和uAE水平。Glim為磺酰脲類(lèi)降糖藥物，其作用機(jī)制是通過(guò)與胰腺β-細(xì)胞表面的磺酰脲受體結(jié)合而在體內(nèi)均勻、緩慢釋放。同時(shí)Glim可增強(qiáng)周?chē)M織對(duì)胰島素敏感性，同時(shí)具有改善胰島素抵抗作用，周?chē)M織對(duì)葡萄糖的利用增加，血糖下降明顯。血糖達(dá)標(biāo)后，糖基化終末產(chǎn)物生成減少，對(duì)腎臟的損害減輕。

圖6 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟miR-21表達(dá)Fig.6 MiR-21 expression in mouse kidney of each experimental group注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。Note:Compared with normal,△P<0.05;Compared with model,*P< 0.05.

miR-21作為廣譜基因，已被證實(shí)與DN發(fā)病成正相關(guān)。國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)表明，miR-21可通過(guò)介導(dǎo)TGF-β/Smad、PTEN/Akt、MMP-S/TIMPS等信號(hào)通路參與DN的發(fā)生發(fā)展[11]。自噬方面，也有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-21可干預(yù)Akt/mTOR信號(hào)通路抑制腎臟足細(xì)胞自噬而加重DN的發(fā)病[12]。這些證據(jù)都表明，抑制miR-21進(jìn)而調(diào)控其下游通路是改善DN的有效策略。本研究也看到，DN小鼠較正常組小鼠腎臟miR-21表達(dá)顯著上調(diào)，這可能與DN小鼠腎臟自噬減弱有關(guān)系。在非DN疾病中，miR-21也被證明通過(guò)負(fù)調(diào)控自噬參與到肺纖維化、巨噬細(xì)胞、缺氧卵圓細(xì)胞等生命活動(dòng)中。大黃素給藥后，DN小鼠腎臟miR-21表達(dá)顯著下調(diào)，而自噬抑制得到解除。但大黃素是否直接介導(dǎo)自噬還是通過(guò)調(diào)控miR-21介導(dǎo)細(xì)胞自噬需要借助靶基因預(yù)測(cè)分析進(jìn)行確證，因?yàn)橐灿醒芯空邎?bào)道大黃素可通過(guò)溶酶體途徑、線粒體途徑調(diào)控自噬，但是否與調(diào)控miR-21有關(guān)需要深入研究。

圖7 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟LC3、Atg7、p62蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of LC3,Atg7 and p62 proteins in the kidneys of mice in each experimental group注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。Note:Compared with normal,△P<0.05;Compared with model,*P<0.05.

在自噬機(jī)制探索方面，我們檢測(cè)了P62、Atg7和LC3三個(gè)經(jīng)典的自噬標(biāo)志性蛋白的表達(dá)，這三個(gè)蛋白是自噬溶酶體途徑的關(guān)鍵成員，而自噬溶酶體途徑在消除、降解受損細(xì)胞器、變性蛋白質(zhì)等生物大分子具有重要作用，是細(xì)胞的重要修復(fù)機(jī)制[13]。故我們推測(cè)大黃素增強(qiáng)自噬恢復(fù)DN小鼠腎臟病理、生理功能可能與自噬溶酶體途徑有關(guān)。結(jié)果表明，大黃素給藥后DN小鼠腎臟P62、Atg7和LC3三種蛋白表達(dá)上調(diào)，提示大黃素可能作用于腎臟足細(xì)胞自噬溶酶體途徑對(duì)DN小鼠腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用。