探析參附注射液治療新型冠狀病毒肺炎合并急性腎損傷的網(wǎng)絡(luò)藥理分子機(jī)制

張 廈，姜茗宸，陶嘉磊，袁 斌

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029

由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)是一種具有強(qiáng)傳染性的急性呼吸道疾病，主要是以呼吸道飛沫和密切接觸的途徑傳播，人群普遍易感，潛伏期約為1～14天，常合并其他器官功能損害[1]。COVID-19早期病程的癥狀與一般病毒性感冒十分相似，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力、肌肉酸痛。隨著病情的發(fā)展，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸困難、低氧血癥等，危重者可發(fā)生多器官功能障礙，如：急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)、急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克等[2]。AKI作為新型冠狀病毒肺炎的主要并發(fā)癥之一，與患者住院死亡率增長(zhǎng)呈正相關(guān)[3]。COVID-19 病原體基因序列與嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(sever acute respiratory syndrome，SARS)的病原體相似性高達(dá)79%，據(jù)報(bào)道，有6.7%的SARS患者發(fā)展為AKI，而AKI患者的死亡率為91.7%[4]。COVID-19與SARS均可通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶II(angiotensin-converting enzyme II，ACE2)感染細(xì)胞，由于ACE2在腎臟中的高濃度表達(dá)，使其成為病毒侵犯的重要靶器官之一[5]。目前多項(xiàng)臨床研究報(bào)告顯示，在所有COVID-19住院患者中AKI合并發(fā)生率為3%，當(dāng)患者被送入ICU時(shí)，AKI的發(fā)生率增加到了19%，大多數(shù)患者在入院后第7天出現(xiàn)AKI[6]。所以在COVID-19的常規(guī)治療中，無論過去是否有腎臟病史，臨床醫(yī)生都應(yīng)采取措施保護(hù)患者腎臟功能。

目前臨床對(duì)于COVID-19合并AKI的治療方案包括一般治療、支持治療以及腎臟替代治療，尚無有效的抗病毒治療，中醫(yī)藥在臨床治療中發(fā)揮著“未病先防、既病防變”的防治特色，這對(duì)于減少COVID-19所致AKI患者的死亡率具有重要意義。由國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)出臺(tái)的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》從試行第五版開始，明確提出不同階段可根據(jù)中醫(yī)辨證療法進(jìn)行中醫(yī)藥干預(yù)，在危重癥患者治療中，推薦使用參附注射液。參附注射液在國(guó)家、各省市出臺(tái)的23種中醫(yī)藥防治COVID-19的治療方案中都有重要地位[7]。參附注射液由紅參和附子兩味中藥組成，是由古方“參附湯”衍變制成的中藥注射劑。參附注射液具有回陽救逆，益氣固脫的功效，主治厥脫及陽虛諸證，可應(yīng)用于各種休克、心力衰竭、心律不齊、急性腎損傷等臨床病癥中[8]。對(duì)于COVID-19合并AKI患者，參附注射液具有維持促炎/抗炎平衡，雙向調(diào)節(jié)嚴(yán)重膿毒癥免疫紊亂的作用，可改善臨床療效[9]，但是其藥理分子機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于“疾病—基因—靶點(diǎn)—藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，中藥研究通過網(wǎng)絡(luò)分析，可以系統(tǒng)綜合地觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的奧秘，與中藥及其復(fù)方的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理殊途同歸[10]。再通過分子對(duì)接驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要活性成分與關(guān)鍵蛋白結(jié)合，為今后實(shí)驗(yàn)方向提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)；Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)；STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)；PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)；Venny 2.1在線軟件作圖平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Cytoscape 3.8.0軟件；DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)；Open Babel 2.3.2軟件；PYMOL 2.3.4軟件；Autodock 4.2.6軟件；AutoDock Vina 1.1.2軟件等。

1.2 方法

1.2.1 參附注射液中化合物篩選與潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫[11]中檢索紅參、附子的化學(xué)成分，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充。每個(gè)化合物通過Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得2D化學(xué)結(jié)構(gòu)文件，保存為SDF格式用于靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。因參附注射液給藥方式為靜脈注射，故將收集到的化合物全部納入分析[12]。將化合物的SDF文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[13]，以“homo sapiens”為研究物種，篩選得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。通過UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范統(tǒng)一。整合、去重后得到參附注射液的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2.2 COVID-19與AKI疾病靶點(diǎn)的獲取

利用Genecards數(shù)據(jù)庫，以“novel corona virus ”、“acute kidney injury”為關(guān)鍵詞檢索，得到COVID-19和AKI的相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.2.3 參附注射液治療COVID-19及AKI共同靶點(diǎn)的篩選

將化合物、COVID-19和AKI的相關(guān)基因通過Venny2.1在線作圖工具平臺(tái)繪制韋恩圖，得到三者交集，獲得參附注射液治療COVID-19及AKI的共同靶點(diǎn)。

1.2.4 (蛋白相互作用)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“1.2.3”項(xiàng)下篩選得到的共有靶標(biāo)蛋白上傳至STRING平臺(tái)，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設(shè)為“homo sapiens”，篩選條件為“medium confidence(0.400)”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù) Degree值篩選出核心靶點(diǎn)，圖中節(jié)點(diǎn)的大小與Degree值呈正相關(guān)。

1.2.5 基因富集分析

利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，將“1.2.3”項(xiàng)下獲得的潛在共同靶點(diǎn)上傳進(jìn)行GO和KEGG的富集分析。選取“gene ontology”，進(jìn)行生物過程、細(xì)胞組分和分子功能的富集分析；選取“pathways”進(jìn)行KEGG通路分析，以FDR≤0.05作為條件篩選，P值從小到大排列，選取與疾病相關(guān)的前20條進(jìn)行可視化分析。

1.2.6 構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

將“1.2.5”項(xiàng)下得到的前20條通路、其包含的靶點(diǎn)、靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的藥物活性分子及成分對(duì)應(yīng)的中藥，利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建為中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)，用Network Analyzer功能對(duì)方中的主要活性成分、靶點(diǎn)、通路進(jìn)行分析。篩選出大于中位度值的核心活性分子。

1.2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

通過Pubchem數(shù)據(jù)庫下載主要活性成分的結(jié)構(gòu)，保存為SDF文件并利用Open Babel 2.3.2將SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從PDB數(shù)據(jù)庫中檢索獲得受體蛋白ACE2(PDB ID:1R42)、Mpro(PDB ID:6LU7)，利用PYMOL 2.3.4對(duì)受體蛋白進(jìn)行去水、去配體等操作，采用Autodock 4.2.6對(duì)兩個(gè)受體蛋白進(jìn)行加氫以及計(jì)算電荷處理，將受體蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式，利用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行核心相關(guān)活性成分的分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 參附注射液潛在活性成分與潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充，紅參中化合物74種、附子65種，共139種。刪除重復(fù)項(xiàng)后共有137種。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)潛在作用靶點(diǎn)，去重后共有714個(gè)。

2.2 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及共同靶點(diǎn)篩選

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫得到COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn) 351個(gè)，AKI的相關(guān)靶點(diǎn)6 354個(gè)。將參附注射液、COVID-19及AKI的相關(guān)靶點(diǎn)輸入Venny 2.1在線作圖工具平臺(tái)獲得韋恩圖，得到三者交集靶點(diǎn)共64個(gè)，韋恩圖見圖1。

圖1 參附注射液、COVID-19、AKI靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.1 Venn diagram analysis of Shenfu Injection and COVID-19 with AKI

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點(diǎn)篩選

在STRING中錄入?yún)⒏阶⑸湟褐委烠OVID-19合并AKI的64個(gè)共同靶點(diǎn)。除PCSK7、F10、ENPP1、PTGDR與其他蛋白之間無相互作用被排除。由圖2可知，該網(wǎng)絡(luò)包括60個(gè)節(jié)點(diǎn)、495條邊、平均度值(degree)為15.5，節(jié)點(diǎn)的度值越大說明其在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用越重要。排名前十的靶點(diǎn)見圖3，為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素 6(IL6)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、胱天蛋白酶3(CASP3)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、白細(xì)胞介素2(IL2)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)，提示可能是通過這些關(guān)鍵靶點(diǎn)使參附注射液發(fā)揮治療COVID-19合并AKI的臨床療效。

圖2 參附注射液治療COVID-19合并AKI的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Target PPI network of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息Fig.3 Information of key targets注：：PPI網(wǎng)絡(luò)所有靶點(diǎn)度值平均值；：靶點(diǎn)度值。 Note::The average value of all target degree values of PPI network;:Target degree value.

2.4 GO生物過程和KEGG的基因富集分析

將“2.2”得到的參附注射液治療COVID-19合并AKI的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，得到(FDR≤0.05)GO生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)條目分別為24、15、6條。按P值從小到大排列，各選取前5條進(jìn)行可視化，見圖4。KEGG富集分析以FDR≤0.05作為條件篩選得到條目67條，按P值從小到大排列，選取與COVID-19合并AKI疾病相關(guān)的前20條進(jìn)行可視化分析，見圖5。在之前得到的64個(gè)共同靶點(diǎn)中，有46個(gè)靶點(diǎn)基因參與了這前20條相關(guān)通路富集，主要涉及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT(蛋白激酶B)信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT signaling pathway)信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、低氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、鞘脂信號(hào)通路(sphingolipid signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)、mTOR信號(hào)通路(mTOR signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)等。

2.5 構(gòu)建中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)1.2.5篩選后，利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建為中藥—成分—靶點(diǎn)—通路的多維網(wǎng)絡(luò)，見圖6。篩選出大于中位度值的活性成分和靶點(diǎn)作為核心活性分子和核心靶點(diǎn)，活性分子有21種，其中紅參14種、附子6種、紅參和附子的共有成分1種，見表1。推測(cè)這21種成分是參附注射液治療COVID-19合并AKI的主要活性成分，用于后續(xù)的分子對(duì)接驗(yàn)證。

圖4 參附注射液治療COVID-19合并AKI靶點(diǎn)GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

圖5 參附注射液治療COVID-19合并AKI靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

2.6 參附注射液主要活性成分與COVID-19關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

ACE2是SARS-CoV-2感染細(xì)胞的必需蛋白，SARS-CoV-2與SARS-CoV均可與ACE2結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞[5]。SARS-CoV-2 3CL水解酶(Mpro)是單正鏈RNA病毒前體多聚蛋白水解的核心蛋白酶，在單正鏈RNA病毒復(fù)制過程是十分依賴于Mpro活性的，并且人體內(nèi)缺乏同源的蛋白酶，使其成為一個(gè)有吸引力的蛋白酶抑制劑作用靶標(biāo)[14]。故在“2.5”獲得的21種核心相關(guān)活性成分后，與目前臨床COVID-19治療推薦用藥利巴韋林(ribavirin)、洛匹那韋(lopinavir)分別與COVID-19關(guān)鍵靶點(diǎn)Mpro、ACE2進(jìn)行分子對(duì)接，配體和受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能越低，結(jié)合力越強(qiáng)，各活性成分的結(jié)合能顯示于圖7。分子對(duì)接的結(jié)果顯示，參附注射液的主要活性成分都能與ACE2和Mpro結(jié)合，其中人參皂苷Rc(ginsenoside Rc)、人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)、人參皂苷Rg3_qt(ginsenoside Rg3_qt)、人參皂苷Rg3(ginsenoside Rg3)、烏頭生物堿-苯甲酰萘胺(benzoylnapelline)與ACE2和Mpro的結(jié)合能較低，且在中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)中度值較高，可能是參附注射液治療COVID-19合并AKI的主要成分。其中ACE2受體蛋白與人參皂苷Rc配體小分子結(jié)合能最低(-9.4 kcal/mol)、Mpro受體蛋白與人參皂苷Rh2配體小分子結(jié)合能最低(-9 kcal/mol)，利用PyMOL進(jìn)行三維展示，見圖8、9。

圖6 參附注射液治療COVID-19合并AKI的中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Drug-composition-target-pathway diagram of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

表1 參附注射液中大于中位度值的活性成分Table 1 Compounds in Shenfu Injection greater than the median degree

3 討論

參附注射液具有回陽救逆、益氣固脫的功效，因注射針劑起效迅速、使用方便、避免了因煎煮不當(dāng)而附子中毒可能性，已成為多地中成藥防治COVID-19推薦用藥。為了探究參附注射液治療COVID-19合并AKI的作用機(jī)制，通過研究參附注射液(紅參、附子)的有效成分，構(gòu)建中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)，分析活性成分、靶點(diǎn)、通路相互作用的關(guān)系，結(jié)合分子對(duì)接的驗(yàn)證、為參附注射液多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療COVID-19合并AKI提供了理論基礎(chǔ)。

細(xì)胞因子是由基質(zhì)細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的一組小蛋白，主要用于細(xì)胞間信號(hào)傳遞和交流，并具有多種生物學(xué)功能，例如調(diào)節(jié)先天免疫、適應(yīng)性免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化以及修復(fù)損傷組織。細(xì)胞因子主要包括白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子和生長(zhǎng)因子等。當(dāng)人體被細(xì)菌和病毒入侵時(shí)，免疫系統(tǒng)會(huì)釋放出大量的細(xì)胞因子，促炎性細(xì)胞因子的過度釋放和失控導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴。這次COVID-19感染的患者在后期會(huì)突然惡化，細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-γ)明顯升高，尤其是IL-6，最終死于多器官功能衰竭，加重的主要原因是細(xì)胞因子風(fēng)暴[15]。本研究再次強(qiáng)調(diào)了COVID-19炎癥反應(yīng)異常，PPI網(wǎng)絡(luò)顯示TNF、IL-6、IL-2、FGF2、ICAM1等靶點(diǎn)，同時(shí)與參附注射液作用靶點(diǎn)產(chǎn)生交集。其中TNF是觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，能誘導(dǎo)如IL-6等其他細(xì)胞因子的釋放，而CCR1、CCR3等趨化因子受體則可介導(dǎo)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，MAPK1、MAPK3等絲裂原活化蛋白激酶家族成員也影響著機(jī)體免疫反應(yīng)。從GO生物富集結(jié)果和KEGG通路顯示，參附注射液治療COVID-19合并AKI的作用機(jī)制涉及了炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、血小板活化生物功能，以及JAK-STAT、VEGF、TNF信號(hào)通路，從生物功能及通路詮釋了炎癥的在病理過程中的重要性。事實(shí)上，蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸，另一種是酪氨酸。絲氨酸磷酸化的主要作用是變構(gòu)蛋白質(zhì)以激活蛋白質(zhì)的活力，主要是指酶活力。酪氨酸則結(jié)合蛋白提供一個(gè)結(jié)構(gòu)基因，以促進(jìn)其和其他蛋白質(zhì)相互作用而形成多蛋白復(fù)合體，蛋白復(fù)合體的形成再進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)的磷酸化。通路富集分析結(jié)果中的JAK-STAT信號(hào)通路似乎解釋了本研究的生物富集結(jié)果，當(dāng)STAT蛋白被JAK磷酸化、二聚化后通過核膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，這樣就以簡(jiǎn)單有效的方式促進(jìn)由過量細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞因子風(fēng)暴[16]，而且各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子都可通過JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳遞信號(hào)，包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等，IL-6(依賴JAK-STAT的細(xì)胞因子)也可以通過JAK1、JAK2和/或TYK2發(fā)出信號(hào)，并激活T細(xì)胞中的STAT3[17]。因此，參附注射液可能通過減輕促炎性細(xì)胞因子的過度釋放，有助于防止進(jìn)一步的傷害，眾所周知，有多種抗炎藥，包括JAK抑制劑。此類藥物在重癥COVID-19的治療中特別重要。

圖7 參附注射液主要成分分子對(duì)接結(jié)果Fig.7 Docking results of main components of Shenfu Injection注：: 各活性成分與ACE2的結(jié)合能；:各活性成分與Mpro的結(jié)合能。Note::The binding energy of each active ingredient and ACE2; : The binding energy of each active ingredient and Mpro.

圖8 人參皂苷Rc與ACE2受體蛋白的分子對(duì)接模式Fig.8 Molecular docking pattern of ginsenoside Rc with ACE2

圖9 人參皂苷Rh2與Mpro受體蛋白的分子對(duì)接模式Fig.9 Molecular docking pattern of ginsenoside Rh2 with Mpro

值得注意的是，GO生物富集結(jié)果涉及了PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控，同時(shí)在KEGG通路研究中發(fā)現(xiàn)了PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路作為藥物—疾病交集靶點(diǎn)，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、增殖、凋亡、逆轉(zhuǎn)錄和自噬的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]。當(dāng)病毒進(jìn)入體內(nèi)后，普遍對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路產(chǎn)生影響，如：人類乳頭瘤病毒、粘液瘤病毒，包括與COVID-19同源性極高的中東呼吸綜合征冠狀病毒，在病毒感染期間都能夠維持激活A(yù)KT通路，從而激活mTORC1，這種持續(xù)激活是啟動(dòng)病毒復(fù)制、存活必備條件之一，目前抑制PI3K/AKT/mTOR和ERK/MAPK的信號(hào)通路的持續(xù)激活，已被廣泛的作為病毒病原體的靶向治療和預(yù)防[19]。此外，眾所周知，在臨床上COVID-19及AKI患者最終威脅生命來自于肺纖維化、腎纖維化，PI3K/AKT/mTOR通路的異常激活在纖維化疾病中十分重要，因?yàn)閙TOR信號(hào)不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，還調(diào)節(jié)肺纖維化，研究表明抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可以起到抗肺纖維化作用，藥物通過阻斷PI3K/AKT/mTOR通路上游TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)后，可以減少腎組織中系膜基質(zhì)的積聚，防止腎組織的纖維化[20]，說明參附注射液可能通過對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)，起到了減少病毒啟動(dòng)/存活，減輕臟器(肺腎)的炎癥損傷，預(yù)防受損臟器纖維化作用，這從理論上似乎解釋了參附注射液臨床上對(duì)COVID-19合并AKI患者的部分療效機(jī)制。

為了尋求參附注射液治療COVID-19合并AKI的物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步進(jìn)行分子對(duì)接。ACE2充當(dāng)SARS-CoV-2的Spike受體結(jié)合域(RBD)的特異性受體，靶向ACE2可以被認(rèn)為是阻止SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞的宿主特異性療法，并且可能有助于設(shè)計(jì)用于治療COVID-19的新型附著抑制劑。Mpro蛋白，對(duì)于SARS-CoV-2的蛋白水解成熟至關(guān)重要。Mpro裂解病毒多蛋白，生成12種非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsp4-Nsp16)。抑制Mpro將阻止病毒復(fù)制，因此構(gòu)成了潛在的抗冠狀病毒策略之一。經(jīng)與ACE2、Mpro靶點(diǎn)對(duì)接后發(fā)現(xiàn)，與利巴韋林、洛匹那韋相比，選定的人參皂苷-Rc和人參皂苷Rh2都對(duì)ACE2、Mpro表現(xiàn)出更好的結(jié)合親和力，人參皂苷-Rc在SARS-CoV-2細(xì)胞受體ACE2的活性位點(diǎn)與Ala99、Phe399、Asn397、Asp382、Arg393和Gln102等相互作用，并產(chǎn)生結(jié)合能(-9.4 kcal/mol)，人參皂苷Rh2在Mpro的活性位點(diǎn)與Phe304、Thr304、Phe294、Arg298、Thr111和Gln110產(chǎn)生了結(jié)合能(-9 kcal/mol)。從對(duì)接模式來看，人參皂苷Rc與ACE2結(jié)合較好，人參皂苷Rh2則與Mpro結(jié)合較好，這些位點(diǎn)活性未見相關(guān)報(bào)道。可以推測(cè)人參皂苷Rc可能用作限制病毒附著于宿主細(xì)胞的治療和/或預(yù)防劑，人參皂苷Rh2則可以用于ACE2介導(dǎo)的SARS-CoV-2抑制進(jìn)行深層次的研究。

以往研究表明，人參皂苷Rh1不但可以恢復(fù)輔助性T細(xì)胞的數(shù)量和功能，改善機(jī)體免疫防御能力[21]，也具有消除氧自由基、抗氧化損傷、增加NO含量、抑制中性粒細(xì)胞黏附、抑制 Na+內(nèi)流的作用，起到了保護(hù)臟器正常生理功能，對(duì)急性肺損傷和急性腎損傷有防治作用[22]。SARS-CoV-2感染后，炎癥細(xì)胞吞噬活動(dòng)頻繁，耗氧量增加，產(chǎn)生大量的氧自由基，活性氧(ROS)過多造成氧化應(yīng)激及組織損傷，再灌注后的復(fù)氧過程對(duì)缺氧階段損傷具有加重效應(yīng)，累及多臟器[22]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1通過醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收通路，作用于靶點(diǎn)ATP1A1，若可以抑制Na+內(nèi)流，從而不激活Na+/Ca2 +互換系統(tǒng)，則可以減少細(xì)胞質(zhì)中Ca2 +的堆積，減少細(xì)胞損傷[23]。通過分析中藥—成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖，參附注射液中人參皂苷Rg1等紅參活性成分可作用于CASP3、BCL2、BCL2L1等凋亡相關(guān)靶點(diǎn)基因，若能下調(diào)促凋亡蛋白CASP3表達(dá)、上調(diào)抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)，則能減少細(xì)胞的凋亡。即使再缺氧復(fù)氧后，腎小管上皮細(xì)胞的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)也呈高表達(dá)狀態(tài)，單核巨噬細(xì)胞會(huì)聚集、黏附和浸潤(rùn)，人參皂苷Rb1、Rg1可抑制MCP-1的表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)[24]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參附注射液治療COVID-19合并AKI的作用機(jī)制，并借助分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，揭示了參附注射液減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)抗細(xì)胞因子風(fēng)暴，預(yù)防臟器纖維化，改善氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡的治療機(jī)制。人參皂苷Rc、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg3_qt、人參皂苷Rg3可能是參附注射液發(fā)揮治療COVID-19合并AKI的物質(zhì)基礎(chǔ)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尚有局限性，目前COVID-19并發(fā)AKI的致病機(jī)制尚不完全明確，仍需后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療加以驗(yàn)證。