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    基于處方挖掘與藥效團(tuán)模型的新型冠狀病毒RdRp抑制成分篩選

    2020-02-02 01:21:36韋繽琪李可馨蘇學(xué)燕張志鋒
    天然產(chǎn)物研究與開發(fā) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:模型

    李 婧,韋繽琪,李可馨,蘇學(xué)燕,3,張志鋒,3*

    1西南民族大學(xué)藥學(xué)院;2四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041;3四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,成都 610225

    2019年12月,一種新型冠狀病毒疾病在武漢市暴發(fā),截止到2020年10月21日,全世界已累計(jì)有4 000多萬人被感染,死亡110萬余人,給全世界人民的生命和健康構(gòu)成巨大威脅,目前已被世界衛(wèi)生組織(WHO)評估認(rèn)定為進(jìn)入全球大流行狀態(tài)。2020年2月11日,WHO將該疾病命名為新型冠狀病毒疾病(COVID-19),是一種由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性感染性肺炎[1],患者初始癥狀多為呼吸道癥狀、發(fā)熱、咳嗽、氣促和呼吸困難等,重癥患者可導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭,甚至死亡[2]。2020 年3 月4 日,國家衛(wèi)健委發(fā)布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[3],治療主要采用α-干擾素、洛匹那韋/利托那韋、利巴韋林、磷酸氯喹、阿比多爾等抗病毒藥物治療,同時推薦采用連花清瘟膠囊、清肺排毒湯等中藥聯(lián)合治療。然而,目前針對SARS-CoV-2 感染尚無特效藥物,因此,研究針對抗COVID-19 療效顯著的新治療方法和藥物十分迫切。

    COVID-19具有強(qiáng)烈的傳染性和流行性,以“濕、熱、毒、瘀”為主要特征,治療原則為早治療、早診斷,重祛邪,防傳變[4]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》推薦中藥包括:清肺排毒湯、藿香正氣膠囊、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、疏風(fēng)解毒膠囊、喜炎平注射液以及多種中藥復(fù)方[3]。在臨床實(shí)踐中,各大醫(yī)院根據(jù)其臨床經(jīng)驗(yàn)及病人的情況采用中西藥結(jié)合進(jìn)行個性化治療,也總結(jié)出一系列具有較好臨床療效的中藥處方。這些復(fù)方的療效經(jīng)過了臨床檢驗(yàn),在我國抗COVID-19 的過程中發(fā)揮了獨(dú)特的作用,為尋找抗新冠活性成分提供了豐富的物質(zhì)和理論基礎(chǔ)。

    SARS-CoV-2是一種RNA病毒,病毒自身編碼的RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),在病毒的RNA復(fù)制過程中起到關(guān)鍵作用。因此RdRp抑制劑可作為抗RNA 病毒的廣譜抗病毒藥物[5],目前療效明確的新冠RdRp抑制劑包括瑞德西韋、利巴韋林及法匹拉韋[6]等。近期“清華大學(xué)-上??萍即髮W(xué)抗新冠病毒聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)”在全世界率先成功解析新型冠狀病毒“RdRp-nsp7-nsp8復(fù)合物”近原子分辨率的三維空間結(jié)構(gòu),揭示了該病毒遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)器核心“引擎”的結(jié)構(gòu)特征,為開發(fā)針對新冠肺炎的藥物奠定了重要基礎(chǔ)。

    藥效團(tuán)模型是一種基于配體的藥物設(shè)計(jì)工具,從已知活性化合物的結(jié)構(gòu)出發(fā)尋找共有的藥效特征信息,從而指導(dǎo)新化合物的理性設(shè)計(jì)或虛擬篩選[7]。近年來,藥效團(tuán)模型被廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的篩選[8]。本文收集了目前幾種療效確切的RdRp小分子抑制劑作為訓(xùn)練集,利用HipHop方法建立三維藥效團(tuán)模型。將產(chǎn)生的藥效團(tuán)與常用抗新冠處方藥材中活性成分進(jìn)行匹配,預(yù)測“抗新冠候選活性成分”中具有潛在新冠病毒RdRp抑制作用的成分及其與該靶標(biāo)的結(jié)合模式,并且建立一種快速高效的新冠病毒RdRp抑制劑篩查模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 常用中藥處方挖掘及藥材候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫建立

    根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》以及全國各地新型冠狀病毒處方全面搜集抗新冠中藥處方,根據(jù)研究報(bào)道篩選臨床療效較好的處方作為候選處方。根據(jù)對處方中的藥材進(jìn)行搜集及用藥頻次統(tǒng)計(jì),以高頻藥材作為重點(diǎn)研究對象,建立候選藥材數(shù)據(jù)庫。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP)搜集候選藥材數(shù)據(jù)庫中每種藥材的主要化學(xué)成分。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug-like,DL)≥0.18為參考評估候選化合物。此外,在CNKI及PubMed數(shù)據(jù)庫中查候選藥材相關(guān)文獻(xiàn),搜集每種藥材主要活性成分,與在TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選到的活性物質(zhì)進(jìn)行整合及確證,建立“抗新冠候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”,并在TCMSP數(shù)據(jù)庫及PubChem數(shù)據(jù)庫下載化合物3D結(jié)構(gòu),確認(rèn)結(jié)構(gòu)無誤后保存。

    1.2 藥效團(tuán)的構(gòu)建及驗(yàn)證

    1.2.1 訓(xùn)練集化合物的選取及HipHop藥效團(tuán)模型建立

    Discovery Studio 軟件中Pharmacophore項(xiàng)下Common Feature Pharmacophore Generation 模塊可用于發(fā)現(xiàn)一系列配體小分子化合物共有的化學(xué)特征,根據(jù)這些共同特性結(jié)構(gòu)比對疊合自動生成藥效團(tuán)模型[9]。參照Liu等[10]的藥效團(tuán)構(gòu)建方法,本研究使用Discovery Studio 2016軟件構(gòu)建基于小分子配體的HipHop藥效團(tuán)模型。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取6個具有RdRp抑制活性的小分子化合物作為訓(xùn)練集[5,6,11,12],訓(xùn)練集化合物結(jié)構(gòu)及RdRp抑制活性(EC50)見圖1,其中rbavirin、remdesivir、favipiravir及penciclovir 的EC50值為對SARS-CoV-2抑制活性,Galidesivir的EC50值為對SARS病毒(SARS-CoV)抑制活性,sofosbuvir的EC50值為對丙型肝炎病毒(HCV)的抑制活性?;谟?xùn)練集中小分子的共同特征結(jié)構(gòu)比對疊合自動生成藥效團(tuán)模型。將訓(xùn)練集中SARS-CoV-2 RdRp抑制活性最高的化合物瑞德西韋(remdesivir,EC50=0.77 μM)Principal值預(yù)設(shè)為2,作為建立藥效團(tuán)的建模時主要需參考配體的構(gòu)象,其他5個化合物Principal 值預(yù)設(shè)為1,作為建立藥效團(tuán)的建模時次要需參考配體的構(gòu)象。所有化合物MaxOmitFeat 值設(shè)為1,表示建模結(jié)果可以有一個特征元素與之不匹配。在HipHop模塊輸入?yún)?shù)時選擇氫鍵受體(hydrogen bond acceptor,A)、氫鍵供體(hydrogenbond donor,D)、疏水基團(tuán)(hydrophobic region,H)、正電中心(positive ionizable,PI)、芳環(huán)(ringaromatic,R)等5項(xiàng)作為藥效團(tuán)的特征元素,每個藥效元素的范圍設(shè)定為0~5,藥效團(tuán)模型設(shè)定為采用Best模式進(jìn)行疊合,經(jīng)過運(yùn)算后得出10個得分最高的藥效團(tuán)模型作為候選模型。

    圖1 訓(xùn)練集化合物的結(jié)構(gòu)與EC50Fig.1 Chemical structures and EC50 of training set compounds

    1.2.2 藥效團(tuán)模型的評價(jià)驗(yàn)證

    選取具有RdRp抑制活性的6種化合物和30種未見RdRp抑制活性報(bào)道的化合物組成測試集。用測試集化合物對藥效團(tuán)模型的性能進(jìn)行評價(jià),采用Discovery Studio中Pharmacophore 項(xiàng)下的Ligand Profiler 模塊,選擇Best 模式進(jìn)行評價(jià),選取在評分值盡可能高的情況下與活性化合物匹配度高及與非活性化合物匹配度較低的藥效團(tuán)作為優(yōu)選藥效團(tuán)模型。

    1.2.3 基于藥效團(tuán)模型SARS-CoV-2 RdRp抑制活性成分虛擬篩選

    得到優(yōu)選藥效團(tuán)后,將“1.1”項(xiàng)中得到的“抗新冠候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”中活性成分結(jié)構(gòu)與優(yōu)選藥效團(tuán)采用Discovery Studio進(jìn)行匹配并分析結(jié)果。模式為Best Search,MaxOmitFeat 值設(shè)為0,其余為默認(rèn)參數(shù)。選取匹配值(FitValue)較高的化合物作為潛在活性化合物。

    1.3 潛在活性化合物的分子對接驗(yàn)證

    將“1.2.3”中得到的潛在活性化合物小分子化合物3D坐標(biāo)文件,在pymol中檢查空間結(jié)構(gòu)無誤后,利用openbabel轉(zhuǎn)換為pdb格式。將結(jié)構(gòu)文件載入autodocktool 1.5.6程序,添加原子電荷,分配原子類型,所有柔性鍵均默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)。保存為pdbqt格式,作為對接配體。本研究靶蛋白“SARS-CoV-2病毒RdRp-nsp7-nsp8復(fù)合物”蛋白結(jié)構(gòu)由上??萍即髮W(xué)饒子和院士團(tuán)隊(duì)提供。采用AutoDock Tools1.5.6 軟件刪除RdRp蛋白中水分子,分離配體和受體,添加非極性氫,計(jì)算Gasteiger電荷,保存為pdbqt文件。根據(jù)研究報(bào)道的remdesivir與SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白結(jié)合位點(diǎn)設(shè)置RdRp蛋白對接的Gridbox坐標(biāo)及大小[13]。以SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白作為受體,以潛在活性化合物為配體,采用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接,根據(jù)對接結(jié)果初步評價(jià)小分子配體與受體的結(jié)合情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 根據(jù)常用中藥處方建立“抗新冠候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”

    根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》及全國各地新型冠狀病毒常用處方篩選到31個中藥處方作為候選處方。分析處方藥材并進(jìn)行藥材使用頻數(shù)統(tǒng)計(jì),使用頻數(shù)≥5的藥材作為高頻使用藥材。共搜集到候選藥材92種,其中高頻使用藥材21種,包括甘草、藿香、黃芩、麻黃、石膏、連翹、厚樸、黃芪、杏仁、白術(shù)、半夏、金銀花、柴胡、蒼術(shù)、茯苓、陳皮、生姜、草果、葶藶子、梔子及檳榔。以高頻使用藥材為重點(diǎn)搜集對象,通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%,DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到的候選活性成分與文獻(xiàn)收集的主要成分及抗病毒活性成分相整合,共得到1 384個候選成分,建立“抗新冠候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”。候選活性成分篩選流程圖見圖2。

    圖2 抗新冠候選活性成分篩選流程圖Fig.2 Screening flow chart of the candidate active ingredients against COVID-19

    2.2 HipHop藥效團(tuán)模型建立及驗(yàn)證

    以訓(xùn)練集6個活性化合物采用HipHop方法共產(chǎn)生10個藥效團(tuán)模型,結(jié)果參數(shù)見表1。評分值參考了訓(xùn)練集分子與藥效團(tuán)模型的匹配度,第01、02、03、07、08、09號藥效團(tuán)藥效特征為DAA,第04、05、06、10號藥效團(tuán)藥效特征為DDA,6個化合物有5個與所有藥效團(tuán)完全匹配,1個部分匹配。生成的10個藥效團(tuán)評分都超過了40分,說明測試集所選的分子共同特征較為明顯,排前幾位的藥效團(tuán)評分較為接近,因此結(jié)合圖3中藥效團(tuán)熱圖的結(jié)果選取最佳藥效團(tuán),其中冷色調(diào)代表對配體響應(yīng)較低,而暖色調(diào)代表藥效團(tuán)對配體響應(yīng)度較高。由圖可見,匹配共命中10個化合物,其中編號1001~1006的5個化合物為活性化合物(1001-ribavirin、1002-remdesivir、1004-galidesivir、1005-penciclovir、1006-sofosbuvir),其他5個化合物為非活性化合物。藥效團(tuán)02對于測試集中活性化合物的響應(yīng)度較高,而對于非活性化合物的響應(yīng)值較低,符合本研究對于藥效團(tuán)的要求,結(jié)合圖3中幾種藥效團(tuán)打分情況,02藥效團(tuán)打分(Rank)最高,故選擇藥效團(tuán)02作為優(yōu)選藥效團(tuán)模型進(jìn)行后續(xù)研究。優(yōu)選藥效團(tuán)模型如圖4A,由圖可見,優(yōu)選藥效團(tuán)02主要由1個氫鍵供體(HBD)和2個氫鍵受體(HBA)和構(gòu)成。而整個模型的氫鍵供體與遠(yuǎn)端的氫鍵配體距離為17.698?,對所匹配的小分子配體的尺寸有一定的限制作用。活性最強(qiáng)的化合物remdesivir與優(yōu)選藥效團(tuán)的FitValue為3.0,與藥效團(tuán)疊合效果見圖4B。

    表1 10個基于分子共同特征的藥效團(tuán)的結(jié)果參數(shù)Table 1 The parameters of ten common features of pharmacophore

    圖3 10個生成的藥效團(tuán)對測試集分子的驗(yàn)證熱圖Fig.3 Heat map of 10 generated pharmacophore models evaluated by test set注:1001-Ribavirin;1002-Remdesivir;1004-Galidesivir;1005-Penciclovir;1006-Sofosbuvir。

    表2 候選活性成分中FitValue排名前30且結(jié)合自由能低于remdesivir的主要活性成分信息Table 2 Basic information of the potential active ingredients in candidate active ingredients ranking according to FitValue (top 30) and binding free energy (

    2.3 優(yōu)選藥效團(tuán)對“抗新冠活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”中SARS-CoV-2 RdRp潛在抑制成分的虛擬篩選

    用“2.1”中優(yōu)選的RdRp抑制劑藥效團(tuán)模型對“1.1”中得到的“抗新冠活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”中1 384種成分進(jìn)行虛擬篩選,命中104個化合物,選取其FitValue排名前30的化合物(FitValue>2.3)作為新型冠狀病毒RdRp潛在抑制活性成分進(jìn)行后續(xù)研究,潛在活性化合物信息見表2,表中為FitValue排名前30且與RdRp結(jié)合自由能低于remdesivir(<﹣7.2 kcal/mol)的重要潛在活性化合物。藥效團(tuán)匹配到的FitValue最高的6種潛在活性化合物見圖5,由圖可見,從圖中可以看出6種化合物藥效團(tuán)的3個特征元素都能很好地匹配,主要為酚羥基對應(yīng)氫鍵供體,羥基或羰基對應(yīng)氫鍵受體。

    圖4 HipHop產(chǎn)生的最優(yōu)藥效團(tuán)模型(A)及其與remdesivir疊合結(jié)果(B)Fig.4 The optimized pharmacophore model (A) and mapping of compound remdesivir on it (B)

    圖5 藥效團(tuán)02匹配到的候選成分中FitValue最高的6種潛在活性化合物Fig.5 The matching pattern diagram between pharmacophore model 02 and top 6 potential active constituents from candidate ingredients注:A.Liquiritin apioside;B.Iridin;C.Liquiritin;D.Forsythiaside;E.Procyanidin B-5,3′-O-gallate;F.Saikosaponin C。

    2.4 RdRp抑制作用潛在活性成分分子對接驗(yàn)證

    以“2.2”中得到的“抗新冠候選成分?jǐn)?shù)據(jù)庫” 中RdRp抑制作用潛在活性成分為配體,以SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白為受體,根據(jù)研究報(bào)道[13]的remdesivir與SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白結(jié)合位點(diǎn)設(shè)置RdRp蛋白對接的Gridbox坐標(biāo)及大小,配體設(shè)置為柔性,受體剛性,采用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對接。選取打分最高(affinity數(shù)值最低)的構(gòu)象作為對接構(gòu)象,利用pymol對對接構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。每種活性成分對接結(jié)果幾種結(jié)合構(gòu)象中,選取結(jié)合能較低且構(gòu)象較好的結(jié)果作為分子對接結(jié)果。分子對接結(jié)合自由能越小說明受體配體之間親和力越大,我們以remdesivir與RdRp的結(jié)合自由能(-7.2 kcal/mol)作為參考來判定待測化合物的親合力。候選成分中RdRp抑制作用潛在活性成分對接結(jié)果見表2(結(jié)合自由能低于remdesivir)。FitValue最高的6種潛在活性化合物與SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白分子對接圖如圖6。根據(jù)研究報(bào)道[13],SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白與remdesivir結(jié)合的活性口袋位于RdRp復(fù)合物蛋白中心的空腔,潛在結(jié)合位點(diǎn)包括545、555、682、623、687、691、759、760、761等。由圖6可見,以上6種化合物能與報(bào)道的SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白中心活性口袋結(jié)合,并與以上關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)中的多個發(fā)生了相互作用。圖中l(wèi)iquiritin apioside 及iridin均在LYS-621位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用;liquiritin apioside 及pocyanidin B-5,3′-O-gallate均在ASP-760位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用;Iridin及procyanidin B-5,3′-O-gallate均在ASP-761位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用;liquiritin apioside及forsythiaside均在ASP-164位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用;liquiritin apioside及Iridin均在GLU-811及TRP-800位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用;iridin及procyanidin B-5,3′-O-gallate均在LYS-798位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用;iridin、procyanidin B-5,3′-O-gallate及saikosaponin C均在TYR-619位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵作用。

    此外以上多個化合物與PRO-620發(fā)生Pi-Alkyl相互作用,與ASP-618發(fā)生Pi-Cation相互作用。以上這些位點(diǎn)可能是活性成分與RdRp蛋白作用的潛在位點(diǎn)。

    2.5 基于篩選結(jié)果的潛在活性結(jié)構(gòu)分析

    我們將表2中FitValue排名前30且結(jié)合自由能低于remdesivir(-7.2 kcal/mol)的化合物進(jìn)行分類,發(fā)現(xiàn)其中53%的化合物骨架類型為黃酮類,主要為黃酮、二氫黃酮、雙黃酮、黃酮醇類。提示黃酮類化合物可能具有潛在SARS-CoV-2 RdRp抑制活性。RdRp抑制劑主要有兩類,即核苷/核苷酸類似物(NI)和非核苷抑制劑(NNI)。NI能成為RNA依賴的RNA聚合酶的底物,可參入到RNA鏈中抑制病毒。NNIs與RdRp變構(gòu)位點(diǎn)之一結(jié)合,這種結(jié)合改變酶的3D構(gòu)象,從而在起始步驟破壞聚合酶活性[11,12]。有研究表明,多種黃酮類化合物對HCV病毒的RdRp具有抑制活性[13]。該研究發(fā)現(xiàn)黃酮醇、黃酮、二氫黃酮及其苷類對HCV病毒的RdRp具有不同程度的抑制活性,與本研究篩選到的黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性。

    此外,該研究以槲皮素為例進(jìn)行了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)槲皮素能在病毒RNA模板通道的入口處與病毒結(jié)合,通過非核苷抑制作用抑制RNA與酶的結(jié)合發(fā)揮RdRp抑制作用,可能是一種與高泛基因組活性和高抗性屏障有關(guān)的新作用機(jī)制。該研究也為黃酮類物質(zhì)的化學(xué)改良和大規(guī)?;诮Y(jié)構(gòu)的抗病毒藥物分子篩選提供了參考。還有研究表明,黃酮類物質(zhì)水飛薊素對HCV病毒RdRp有抑制作用,水飛薊素可能不是通過阻斷HCV細(xì)胞系與細(xì)胞的結(jié)合,而是抑制了病毒假顆粒(pp)的進(jìn)入,從而抑制了HCVpp與脂質(zhì)體的融合發(fā)揮抑制病毒作用[14]。還有研究表明雙黃酮類化合物對登革病毒聚合酶DENV-NS5 RdRp具有抑制作用[15],本研究篩選到procyanidin B1與procyanidin B-5,3′-O-gallate為雙黃酮類成分,且與RdRp結(jié)合自由能均<﹣8 kcal/mol,提示這兩種化合物與RdRp可能具有潛在作用。以上研究為本研究結(jié)果提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù),然而黃酮類化合對于SARS-CoV-2 RdRp是否有抑制作用尚需后期實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    從對接的結(jié)果可以看出,由于黃酮類結(jié)構(gòu)含有多個富電子的氧原子,易于與RdRp 靶點(diǎn)殘基中的供電子基團(tuán)形成氫鍵,故黃酮類結(jié)構(gòu)作為潛在的抗RdRp活性化合物的骨架是合理的。我們把FitValue排名靠前且結(jié)合自由能低于remdesivir的30個黃酮類化合物作為重要黃酮類活性成分進(jìn)行分析,與RdRp蛋白殘基互作圖見圖7。在黃酮活性化合物中,氫鍵多在黃酮骨架上A 環(huán)的C-7位(liquiritin apioside、liquiritin、procyanidin B-5,3′-O-gallate、rutin、isovitexin、ochnaflavone、Procyanidin B1及l(fā)icorice glycoside E)及C環(huán)的C-3位(iridin、procyanidin B-5,3′-O-gallate、hesperidin、neohesperidin、procyanidin B1、ochnaflavone及isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole)或C-4位(cynaroside、veronicastroside、neoliquiritin 及procyanidin B1)上產(chǎn)生,由此推測上述位置的取代基可能對化合物的活性有一定影響。

    圖7 潛在活性成分中重要黃酮類成分與RdRp蛋白殘基互作圖Fig.7 Interaction of protein residues between RdRp and the important flavonoids in potential active ingredient注:A.Liquiritin apioside;B.Iridin;C.Liquiritin;D.Procyanidin B-5,3′-O-gallate;E.Neohesperidin;F.Cynaroside;G.Veronicastroside;H.Naringin;I.Procyanidin B1;J.Hesperidin;K.Ochnaflavone;L.Neoliquiritin;M.Isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole;N.Licorice glycoside E;O.Isovitexin,P. Rutin。

    3 討論

    COVID-19屬于“瘟疫”范疇,以“濕、熱、毒、瘀”為主要特征,并與運(yùn)氣、地理、氣候和人群的易感性相關(guān),其病位在膜原,涉及三焦、肺、脾、胃,采用清熱除濕解表藥在新冠肺炎的防治中有重要的作用[16]。本研究對于臨床常用的31個抗新冠常用中藥處方的組成藥物進(jìn)行頻次統(tǒng)計(jì),其中使用頻次≥5 的有21味中藥(圖1)。使用頻次較高的藥材大致歸納為:補(bǔ)氣健脾藥、清熱藥、解表藥、祛濕藥。補(bǔ)氣健脾藥(黃芪、甘草、白術(shù)、厚樸、杏仁);清熱藥(金銀花、甘草、連翹、麻黃、黃芩、石膏、葶藶子、梔子);解表藥(金銀花、連翹、藿香、麻黃、柴胡、生姜);祛濕藥(白術(shù)、藿香、陳皮、蒼術(shù)、黃芩、茯苓、厚樸、半夏、草果、檳榔)等。

    SARS-CoV-2 屬于β屬的新型冠狀病毒,SARS-CoV-2可通過刺突糖蛋白(S蛋白)的S1亞基上的受體結(jié)合域(RBD)與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)之間的結(jié)合,通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞[17]。SARS-CoV-2病毒進(jìn)入細(xì)胞后,核衣殼與病毒自身的正義鏈RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中,由木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLpro)和主蛋白酶(3CLpro)參與裂解,最終產(chǎn)生包括螺旋酶(Helicase)和RNA 依賴性RNA 聚合酶(RdRp)在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白,參與病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程[18]。病毒自身編碼的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)在SARS-CoV-2病毒的RNA復(fù)制過程中起到關(guān)鍵作用,RdRp也是目前針對SARS-CoV-2作用明確且研究較多的靶點(diǎn)。本研究探索從常用抗新冠中藥材中尋找RdRp抑制劑,也為更好的闡明中藥抗新冠作用機(jī)制提供參考。本研究根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)挖掘搜集了常用抗新冠藥材中1384種候選活性成分,根據(jù)已報(bào)道的具有RdRp抑制活性的6種化合物構(gòu)建了藥效團(tuán)模型并進(jìn)行了驗(yàn)證,選取最優(yōu)藥效團(tuán)模型與“抗新冠候選活性成分”進(jìn)行了虛擬篩選,在匹配得到的化合物中選取FitValue較高的化合物作為潛在RdRp抑制活性成分,本研究發(fā)現(xiàn)lquiritin apioside、iridin、liquiritin、forsythiaside、procyanidin B-5,3′-O-gallate、saikosaponin C等成分具有較高的FitValue,可作為RdRp抑制的潛在活性成分。通過分類分析發(fā)現(xiàn)篩選產(chǎn)物中有較多黃酮類成分,與文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮類化合物抑制病毒RdRp作用有一定相似性,提示黃酮骨架可能具有抑制SARS-CoV-2 RdRp的活性。我們還篩選到一些五環(huán)三萜類成分,主要是saikosaponin,有研究報(bào)道saikosaponins A、C、B、D具有抗流感、HBV、HCV等病毒活性[19-21]。研究還發(fā)現(xiàn)一些有苯丙素類具有RdRp潛在抑制活性,主要包括forsythiaside(連翹苷)及綠原酸類似物,有研究報(bào)道連翹苷A可通過抑制病毒復(fù)制控制甲型流感病毒感染[22];連翹苷A還可通過影響小鼠肺免疫細(xì)胞中RLRs信號通路,減輕流感病毒FM1株在小鼠肺中引起的炎癥反應(yīng)[23]。Isochlorogenic acid A及chlorogenic acid具有抗流感病毒、HBV等病毒活性[24,25]。然而五環(huán)三萜及苯丙素類成分是否對病毒RdRp具有抑制活性尚未見報(bào)道,需進(jìn)一步試驗(yàn)研究證實(shí)。本研究采用remdesivir作為重要模板進(jìn)行活性基團(tuán)模型構(gòu)建,有研究報(bào)道remdesivir三磷酸化后的形式為其活性形式[13],但考慮到remdesivir三磷酸化物的不穩(wěn)定性,因此研究采用了remdesivir原型作為藥效團(tuán)模型。

    綜上,本研究通過對抗新冠常用中藥處方挖掘及數(shù)據(jù)庫搜集,建立了“抗新候選活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”,基于已報(bào)道的具有RdRp抑制活性的化合物構(gòu)建了HipHop藥效團(tuán)模型并對候選成分進(jìn)行匹配,對FitValue排名并進(jìn)行分子對接驗(yàn)證,選取FitValue較高且結(jié)合自由低于對照藥物remdesivir的前30種化合物進(jìn)行分析,得到具有RdRp潛在抑制活性的化合物及活性結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果為抗SARS-CoV-2活性成分篩選提供了新思路及參考。

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