失荅剌知丸對動脈粥樣硬化模型大鼠自噬因子Beclin1影響的研究＊

文/左艷麗，竇楠，李占濤，王娜琳，賈孟輝（.銀川市第一人民醫(yī)院；.寧夏醫(yī)科大學(xué)）

本研究基于在基礎(chǔ)水平的自噬可抑制AS 的發(fā)展進(jìn)程。通過建立大鼠動脈粥樣硬化模型，觀察失荅剌知丸對自噬因子Beclin1 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

SD大鼠，30只，雄性，SPF級，月齡2月，體質(zhì)量（300±20）g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。30 只大鼠隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組、失荅剌知丸組，每組10 只。

1.1.2 藥品

失荅剌知丸，柴胡31g、黑訶子31g、蘆薈62g、失荅剌知（元胡）6g、菖蒲6g、番鹽6g、沙哈木罕荅里（藥西瓜）9g、阿里公（松蕈）9g、安息香9g、撒額冰（阿魏）9g、干姜9g、蓽茇9g、胡椒9g、白芥子9g、蕓香9g、巴豆霜9g。方中除巴豆霜、安息香、阿魏三味藥物，余均在涼水浸泡60min 后，使用TC-15 套式恒溫器220V 電壓加熱煎煮；巴豆霜9g（先煎），安息香9g、阿魏9g（后下），沸騰后調(diào)低電壓，保持微沸狀態(tài)煎煮30min，濾取煎液；藥渣再加入涼水浸泡30min 后煎煮，方法同前，濾取煎液；合并兩次煎液，將藥液于恒溫水浴鍋（100℃）內(nèi)濃縮至111.11ml，濃度為2.088g/m1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

維生素D3：（ 瑞 士，DSM Nutritional Products Ltd.，注冊證號：H20090622）。

阿托伐他汀鈣（輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號：CJ7029）。

1.1.3 主要實驗試劑

兔抗大鼠Beclin1 抗體：博士德生物公司。

濃縮型正常山羊血清：博士德生物公司。

1.1.4 主要儀器

FX4-2 型電熱恒溫干燥箱：Shella 公司。

1.2 方法

造模與給藥：30 只大鼠均飼以高脂飼料（由2%膽固醇、5%豬油、10%蛋黃粉、83%基礎(chǔ)飼料組成）復(fù)制大鼠AS 模型，于實驗開始當(dāng)日一次腹腔注射維生素D3315萬U/kg，共計12 周。造模開始6 周、10 周、12 周后隨機(jī)處死1 只大鼠檢驗造模情況，檢測主動脈彈性下降、內(nèi)膜增厚、肉眼可見脂質(zhì)斑塊，為造模成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為3 組，其中模型組10 只，失荅剌知丸組10 只，阿托伐他汀組10 只。按上述分組灌胃給藥，給藥容積為100g/ml（灌胃容積為100g/ml，失荅剌知丸每日給予2 次灌胃，阿托伐他汀給予每日一次灌胃），連續(xù)給藥8 周。

2 觀察指標(biāo)

免疫組化法檢測Becilin1：Beclin1 主要在腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿中表達(dá)。大鼠麻醉后,取出動脈，進(jìn)行沖洗、包埋，切片，加入I 抗、II 抗，DAB 顯色，放于顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。觀察每張切片隨機(jī)選擇3 個觀察區(qū)域，根據(jù)細(xì)胞的染色程度和顯色深淺，以及陽性細(xì)胞所占的百分比率進(jìn)行計分。顯色程度評分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞不顯色為0 分；細(xì)胞顯色為黃色記為1 分；細(xì)胞顯色為棕黃色記為2分；細(xì)胞顯色為深棕色記為3分；陽性細(xì)胞所占百分比率評分標(biāo)準(zhǔn)：無顯色的細(xì)胞為0%記為0 分；顯色細(xì)胞≤30%記為1 分；顯色細(xì)胞30%-50%記為2 分；顯色細(xì)胞>50%記為3 分。將兩次評分結(jié)果相加；0-1 分記為陰性（-），2-4 分記為陽性（+），5-6 分記為強陽性（++）。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計。計數(shù)資料以率（%）表示，之間比較采用卡方x2檢驗，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。顯著性水準(zhǔn)取α ＝0.05。

4 結(jié)果

免疫法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1：Beclin1 在模型組、阿托伐他汀組、失荅剌知丸組的陽性表達(dá)率分別為20%、60%、90%。其中，與模型組相比，失荅剌知丸組Beclin1 陽性表達(dá)率增加更顯著（x2=9.90,P<0.05）。見表1。

表1 失荅剌知丸對動脈粥樣硬化性大鼠Beclin1表達(dá)的影響

5 討論

AS 的發(fā)生是很多心腦血管疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，AS 的形成是一個時間持續(xù)較長的過程，在AS 發(fā)生的初期，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的自噬細(xì)胞可通過自身調(diào)節(jié)減少泡沫細(xì)胞的聚集，減緩動脈粥樣硬化的進(jìn)程。

Beclin1 是第一個被確認(rèn)的哺乳動物的自噬基因，是自體吞噬發(fā)生的重要起始因子[1]，也是形成自噬體的必須分子[2]，其表達(dá)量的多少在一定程度上也反映著自噬的活性程度。

動脈粥樣硬化在中醫(yī)學(xué)中無統(tǒng)一命名，可屬于“胸痹”、“中風(fēng)”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，氣虛為本，痰瘀等致病因素互結(jié)，導(dǎo)致瘀阻脈絡(luò)，氣血運行不暢而致。因此，以辛香溫通、截痰開結(jié)、逐水破瘀為治則。失荅剌知丸運用多種辛溫藥物，菖蒲、藥西瓜、松蕈、安息香、阿魏、干姜、蓽茇、胡椒、白芥子以溫煦體內(nèi)陽氣，以祛濕散寒；運用柴胡、元胡以理氣止痛，蘆薈、巴豆霜化瘀、逐痰，以達(dá)辛香溫通、截痰開結(jié)、逐水破瘀之效。

在本實驗中，免疫組化結(jié)果顯示，失荅剌知丸組的Beclin1 陽性表達(dá)率增加顯著，這可能是該方抗動脈粥樣硬化的重要作用機(jī)制。