長鏈非編碼RNA與復發(fā)性流產(chǎn)及反復著床失敗關系的研究進展

趙小萱 馮曉玲 陳 璐 王 瑋

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(哈爾濱，150040)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院

在真核生物基因組中，雖然有90%以上的DNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但最終只有1%～2%的基因組轉(zhuǎn)錄本被翻譯為蛋白質(zhì)[1]。而大部分基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物屬于非編碼RNA( ncRNAs)[2]。這些ncRNA根據(jù)其長度可分為短非編碼RNA和長非編碼RNA (lnc RNA)。其中l(wèi)nc RNAs 是轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA[3]，其作為表觀遺傳修飾的核心之一，在細胞生物學層面調(diào)控各個生理過程，如參與X染色體失活[4]、染色質(zhì)修飾、基因組印記、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾及核內(nèi)運輸?shù)?，同時還能影響胚胎干細胞的多能性和分化，調(diào)控細胞凋亡和細胞周期等，在人類生命的起源、生長發(fā)育、進化選擇等方面有重要作用[5-7]。lnc RNA在生命信息調(diào)控中所展現(xiàn)出的重要性與廣泛性啟發(fā)學者開始關注其對生殖疾病病因?qū)W的潛在作用。其中l(wèi)nc RNA在流產(chǎn)相關疾病如復發(fā)性流產(chǎn)(RSA)、反復著床失敗(RIF)中的調(diào)控機制成為學者的研究熱點。RSA被定義為連續(xù)≥2次自然流產(chǎn)[8]。RIF指的是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療中3次以上優(yōu)質(zhì)胚胎移植后的妊娠失敗或多次移植10個以上胚胎后的妊娠失敗[9]。無論是RSA還是RIF都受到諸多病理因素的影響，如代謝異常、免疫紊亂、炎癥損傷、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常等。目前已有諸多研究表明，lnc RNA在妊娠并發(fā)癥如先兆子癇、宮內(nèi)高血糖、胎兒宮內(nèi)受限等疾病的病理機制中發(fā)揮調(diào)控作用[10-12]，然而lnc RNA在流產(chǎn)相關疾病的領域中研究較少。筆者廣泛閱讀國內(nèi)外文獻，從lnc RNA調(diào)控胚胎發(fā)育能力、子宮內(nèi)膜容受性、胎盤發(fā)育、胚胎-母源交互作用4個方面歸納lnc RNA對RSA與RIF的影響。

1 概述

盡管lnc RNAs與mRNA有相同的結(jié)構(gòu)基礎，通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，5′端加帽和 3′端多腺苷酸化，但lnc RNAs缺乏蛋白質(zhì)編碼的潛力[13]。與傳統(tǒng)的蛋白編碼基因相比，lnc RNAs具有表達豐度較低、表達特異性較強、序列保守性較低、位置保守性較高等特點[14]。據(jù)此可以將其分為4種類型[15-16]：①信號原型，作為轉(zhuǎn)錄活性的分子信號或指標；②誘餌原型，結(jié)合目標RNA或蛋白質(zhì)并去除無關的RNA或蛋白質(zhì)；③引導原型，指導核糖核蛋白復合物定位到特定目標指導定位；④支架原型——具有結(jié)構(gòu)作用，為組裝相關的分子成分(蛋白質(zhì)和或RNA)提供平臺。近年來，越來越多的證據(jù)證實lnc RNA與轉(zhuǎn)錄因子和基因表達的表觀遺傳學調(diào)控因子協(xié)同工作，幾乎調(diào)節(jié)基因生命周期中的每一個步驟?；诓煌臋C制，lnc RNA可以進一步調(diào)控不同的代謝途徑，參與廣泛的生物過程[17]。目前研究證實，lnc RNA可通過3個水平參與基因表達的調(diào)控[18-19]：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、表觀修飾水平(包括組蛋白及 DNA 甲基化、組蛋白乙?；皖惙核鼗{(diào)控)和轉(zhuǎn)錄后水平(m RNA前體加工和剪接、轉(zhuǎn)運、翻譯和降解)。通過這些調(diào)控機制，lnc RNAs可以誘導細胞分化、增殖和細胞保護等程序，這也使得lnc RNAs在調(diào)控人類疾病中所發(fā)揮的作用日益得到認可。

2 在流產(chǎn)相關疾病中的調(diào)控機制

2.1 通過影響胚胎發(fā)育能力導致流產(chǎn)發(fā)生

諸多研究表明，lnc RNA自人類胚胎發(fā)育的開始就已經(jīng)存在，并在胚胎基因活化后(約為4細胞至8細胞階段)成為主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物類型[20]。隨著胚胎的發(fā)育，lnc RNAs也隨之發(fā)生動態(tài)改變，以表觀遺傳調(diào)控方式影響胚胎形態(tài)學，然而具體的分子機制仍處于研究階段[21]。目前Inc RNAs與胚胎發(fā)育關系尚停留在胚胎干細胞(ESCs)階段。ESCs具有無限繁殖(自我更新)能力，其功能的優(yōu)劣直接決定妊娠結(jié)局[22]。研究表明ESCs中存在226個差異表達的Inc RNA，其中超過90%的Inc RNA調(diào)控ESCs基因表達，約74種與染色質(zhì)重構(gòu)蛋白相關的Inc RNA參與維持ESCs全能性[23]。Yin等[24]從生理層面分析了Inc RNA通過調(diào)控Haunt基因在視黃酸(RA)通路和同源盒基因(HOXA)通路下作用于胚胎干細胞的正常分化過程。Lu等[25]構(gòu)建Snhg3基因敲除的小鼠模型，從病理機制層面探究 lnc RNA小核仁RNA宿主基因3(Snhg3)與小鼠胚胎發(fā)育間的關系，發(fā)現(xiàn)在敲除Snhg3基因后小鼠胚胎干細胞的自我更新和多能性缺失，同時小鼠的早期胚胎發(fā)育受到干擾。由此可見，lnc RNA Snhg3對胚胎干細胞功能的實現(xiàn)以及對小鼠早期胚胎發(fā)育起重要的調(diào)控作用。另外，國外學者發(fā)現(xiàn)，使用siRNA沉默小鼠ESCs中介導siRNA的啟動子相關的lnc RNA后，胚胎發(fā)生致命性損傷，甚至造成流產(chǎn)的妊娠結(jié)局[26]。由上述一系列的實驗可以確切地證實lnc RNA可通過調(diào)控ESCs的分化和發(fā)育途徑影響妊娠結(jié)局。由此推測ESCs中l(wèi)nc RNA的調(diào)控異常也可能是RSA與RIF的原因之一，并且在胚胎移植前對lnc RNA的篩查有望成為胚胎植入前基因篩查的重要項目。

2.2 通過影響子宮內(nèi)膜容受性導致流產(chǎn)發(fā)生

子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對胚胎的接納能力[27]。美國的一項回顧性隊列研究，調(diào)查了2011-2015年經(jīng)過植入前基因篩查(以排除攜帶非整倍體的胚胎)的998個體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期，發(fā)現(xiàn)在基因篩查后植入率仍低于60%[28]。另外一項研究比較了88例經(jīng)歷和未經(jīng)歷植入前基因篩查的RIF患者的臨床妊娠率，結(jié)果顯示兩組結(jié)果沒有差異[29]。這使學者開始認識到子宮內(nèi)膜容受性不足和胚胎、子宮內(nèi)膜同步化失敗是RIF的主要原因。而現(xiàn)有研究恰恰表明lnc RNAs可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性而影響妊娠結(jié)局。Yan等[30]的研究表明，lnc RNA H19可通過吸附let-7下調(diào)整合素β3(Integrinβ3)的轉(zhuǎn)錄與翻譯，而Integrinβ3是反映子宮內(nèi)膜容受性的金指標，當其水平下降時會引起容受性減低，導致胚胎丟失。另外Zeng等[31]以RIF患者的子宮內(nèi)膜組織為研究對象，并以首次進行IVF-ET/冷凍胚胎移植周期后成功受孕患者的子宮內(nèi)膜作為對照組，比較兩組樣本中H19 lnc RNA和Integrinβ3蛋白的表達水平，結(jié)果表明H19 lnc RNA和Integrinβ3呈正向相關性，并且兩者均在 RIF 患者的子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)出低表達水平。由此可知H19和Integrinβ3協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)“種植窗口期”子宮內(nèi)膜的容受性。另外，F(xiàn)eng等[32]以RIF女性為觀察對象，借助生物信息分析技術(shù)，構(gòu)建與植入失敗相關的lnc RNA- mRNA網(wǎng)絡，并尋找預測子宮內(nèi)膜容受性的lnc RNA生物標志物。經(jīng)拓撲分析確定了質(zhì)心最高的6個關鍵lnc RNAs(CECR3、ST7-OT3、DHRS4-AS1、C22orf34、RAMP2-AS1、PNCT-HSA157732)及其ceRNA子網(wǎng)絡。通過聚類分析、GO分類、KEGG通路和共表達模塊進行功能富集分析后，得出這些lnc RNA及其子網(wǎng)絡參與調(diào)控子宮內(nèi)膜細胞的免疫活性，介導生長因子結(jié)合，影響血管增殖、凋亡和類固醇生物合成過程，并為胚胎植入作好內(nèi)膜準備。此外，F(xiàn)eng等[32]在黃體中期采集16個子宮內(nèi)膜樣本，包括8個RIF女性和8個成功懷孕的對照組。定量實時PCR比較上述6種lnc RNAs的表達，發(fā)現(xiàn)這些lnc RNAs在RIF患者子宮內(nèi)膜中的表達均顯著升高，并且可用做預測子宮內(nèi)膜容受性的生物標記物。然而lnc RNA對其下游因子如何調(diào)控還處于探索階段，其具體分子通路機制仍需要進一步研究。

2.3 通過影響胎盤發(fā)育導致流產(chǎn)發(fā)生

胎盤發(fā)育是一個連續(xù)的過程，從胎盤早期滋養(yǎng)層細胞形成并分化，到其快速增殖、侵襲遷移，再到胎盤形態(tài)基本具備，乃至胎盤發(fā)育后期分泌、防御等功能的形成，都與妊娠的發(fā)生和維持密切相關，其中任意環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會影響妊娠結(jié)局[33]。而滋養(yǎng)層細胞作為胎盤的主要組成部分，參與了胚胎著床、啟動胎盤形成、調(diào)控血管分化、內(nèi)分泌等過程，對胎盤發(fā)育發(fā)揮重要作用[34]。有研究表明，印記lnc RNA可調(diào)控滋養(yǎng)細胞功能從而影響胎盤功能及妊娠結(jié)局[35]。迄今為止相關學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100 多個人類印跡基因，而且他們大多都與生長和分化密切相關[36-37]。而其中胎盤是印記基因調(diào)控的重要靶器官之一，當印記基因異常會使胎盤滋養(yǎng)層細胞的分化及凋亡發(fā)生異常，從而導致胎盤的異常發(fā)育[38]。Sheng等[39]證實小鼠印記lnc RNA Rian在胎盤發(fā)育過程中逐漸高表達。 lnc RNA MEG8(RIAN)是與小鼠lnc RNA Rian同源的印記基因，位于人14號染色體上的DLK1-DIO3印記區(qū)內(nèi)，而該印記區(qū)與人類生長、發(fā)育和疾病發(fā)生聯(lián)系緊密[40-42]。因此，推測lnc RNA MEG8在早期胎盤發(fā)育過程中可能起重要作用。盛菲等[43]發(fā)現(xiàn)與正常人工流產(chǎn)組相比，lnc RNA MEG8在人不明原因自然流產(chǎn)絨毛組織中異常高表達，進一步以人早期滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/Soven為研究對象進行體外細胞實驗，分別轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒和小干擾RNA，結(jié)果顯示在滋養(yǎng)層細胞系中上調(diào)表達MEG8，可導致細胞增殖和侵襲能力減弱，下調(diào)表達MEG8則結(jié)果相反?？梢妉nc RNA MEG8參與調(diào)控早期滋養(yǎng)層細胞功能，其水平上調(diào)可造成滋養(yǎng)層細胞的功能缺陷，可能是引起流產(chǎn)不良妊娠結(jié)局的因素之一。此外，Sheng等[39]揭示了DNA甲基化與印跡lnc RNA在胎盤發(fā)育中的關系，結(jié)果提示自然流產(chǎn)絨毛中MEG8啟動子區(qū)甲基化水平升高，這種異常的甲基化水平與滋養(yǎng)細胞功能缺陷關系密切。此外，其他印跡基因與胎盤功能的調(diào)控作用也被學者揭示。文獻表明，印跡基因lnc RNA H19的高表達可以通過某些途徑限制胎盤的生長[44-45]。有研究通過細胞實驗印證了這一事實。在人胎盤滋養(yǎng)層JEG-3細胞中敲除印記基因H19或限制其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物miR-675均可起到促進胎盤增殖的作用[38]。有學者發(fā)現(xiàn)，RSA人群中外周血及胎盤組織中Inc RNA H19水平均高于正常妊娠流產(chǎn)組[46]。由此可知，lnc RNA在調(diào)控胎盤發(fā)育從而影響妊娠結(jié)局的事件中扮演重要角色。

2.4 通過影響胚胎-母源間免疫調(diào)控導致流產(chǎn)發(fā)生

由于胎兒攜帶一半的父系基因，因此妊娠被認為是半同種異體移植。而成功的妊娠則有賴于母體諸多免疫細胞和因子構(gòu)建出復雜而精細的免疫調(diào)控網(wǎng)絡，共同阻止母體對抗父本抗原的免疫激活而對胎兒產(chǎn)生免疫耐受，保障胎兒在宮腔內(nèi)正常地生長發(fā)育[47]。相反，如果免疫調(diào)控機制受到干擾和破壞，則會導致胚胎丟失等不良妊娠結(jié)局。近年來母胎界面的免疫激活及其炎癥反應成為復發(fā)性流產(chǎn)的一個研究熱點。新近研究發(fā)現(xiàn)，感染和炎癥通路受lnc RNAs調(diào)控[48]。Wang等[49]采用人lnc RNA芯片對正常妊娠女性和RSA女性全基因組lnc RNAs測序，并進行KEGG分析驗證，結(jié)果顯示差異表達的lnc RNAs參與免疫調(diào)節(jié)途徑；這些lnc RNA相關基因所表達的蛋白被認為是免疫細胞分化和活化的重要調(diào)控因子[50-51]。另外，研究人員招募了20名RIF患者和30名對照組女性，在RIF患者子宮內(nèi)膜組織中鑒定出742個差異表達的lnc RNA基因， 將差異顯著的lnc RNAs的順式調(diào)控靶基因進行聚類分析發(fā)現(xiàn)這些基因與腫瘤壞死因子信號通路、toll樣4受體信號通路、NF-kB信號通路關系密切[52]。其中TLR4是一種天然免疫系統(tǒng)中與免疫性及炎癥性疾病關系密切的重要模式識別受體，可以通過激活下游接頭蛋白-髓樣分化因子88(MyD88)，促使游通路活化，最后激活核因子κB(NF-κB)通路[53-54]。NF-κB作為炎癥反應的一個主要轉(zhuǎn)錄因子，參與了炎癥、免疫應答、細胞凋亡和增殖等過程的分子調(diào)控從而參與流產(chǎn)的發(fā)生[55]。由此可見lnc RNA通過調(diào)控胚胎-母源間免疫導致胚胎反復丟失，這可能是未來研究免疫與流產(chǎn)關系的一個新的方向。

3 展望

近年來，諸多文獻表明，表觀遺傳學參與胚胎形成、生長發(fā)育等重要生命現(xiàn)象，并且其在疾病的預防和治療中的作用逐漸被揭示。lnc RNA作為表觀遺傳學中的重要組成，憑借其作用的廣泛性成為當今學醫(yī)研究的“明星分子”。目前，多種分子生物學方法如轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)、微陣列(microarray)、RNA干擾(RNAi)和熒光原位雜交(FISH)等技術(shù)為認識lnc RNA與RSA及RIF的關系提供了強大的支持。但1nc RNA的探索還處于初級階段，專門以RSA或RIF為研究對象的動物及實驗仍屬少數(shù)，許多疑問還未明晰。并且lnc RNA在細胞中的實時動態(tài)過程難以準確分析，其分子結(jié)構(gòu)復雜多樣，缺少適宜的生物信息學工具，難以分析其高級結(jié)構(gòu)，因此無法從其分子結(jié)構(gòu)直接推測出其生物學功能及調(diào)控機制。未來隨著實驗技術(shù)的進步，將更有助于了解lnc RNA結(jié)構(gòu)與功能的關系，有望開啟一個全新的由lnc RNA調(diào)控的生物信息網(wǎng)絡，使人們可以通過不同于編碼基因的角度闡明基因組的結(jié)構(gòu)與功能，并為人類疾病治療提供新的研究思路。