黃曲霉毒素B1誘導大鼠肝細胞凋亡率劑量效應模型的構(gòu)建

黃奧迪，嚴佳惠，張昭寰,2，劉海泉,2,3，趙 勇,2,3，歐 杰,2,3,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306）

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉等菌株產(chǎn)生的高毒性次級代謝物的總稱[1]，廣泛存在于谷物、蔬菜、肉類等食物中，嚴重危害食品安全[2]。其中，黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是黃曲霉毒素中出現(xiàn)頻率最高且毒性和致癌性最強的[3]，AFB1主要毒性作用的靶器官是肝臟[4]。Mughal等[5]研究已經(jīng)證實AFB1通過引起肝細胞凋亡和干擾細胞酶活性引起肝功能障礙，作用機制涉及腫瘤抑制基因形成DNA加合物，從而導致基因突變，對人類造成致癌性，影響人體健康。

劑量效應模型（dose-response model，DRM）是食品風險評估框架中危害特征描述的重要組成部分，其本質(zhì)在于定量描述暴露于危害物的劑量與發(fā)生不良反應概率之間的關(guān)系[6]。目前國內(nèi)外已開展的DRM研究包括沙門氏菌[7]、副溶血性弧菌[8]、蠟樣芽孢桿菌[9]等，但是國內(nèi)關(guān)于真菌毒素構(gòu)建DRM的研究較少，且聚焦于AFB1構(gòu)建DRM也缺乏系統(tǒng)性的研究[10]。AFB1生物性危害主要通過產(chǎn)生相應的毒素或者宿主進食具有感染性的病原體從而影響人體健康，在我國肝癌的高發(fā)地區(qū)廣西由于人們經(jīng)常食用含有AFB1的食物，導致肝臟負擔增加，從而引發(fā)肝臟疾病。產(chǎn)生黃曲霉毒素的真菌大多存在于氣候炎熱潮濕的地區(qū)，由于收獲前和收獲后的真菌污染，在食物中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素，黃曲霉毒素對食物的污染速度和程度取決于溫度、濕度、土壤和儲存條件[11]。AFB1慢性毒性不僅會使體質(zhì)量減輕、肝臟相關(guān)指標上升，還會增加腎臟的壓力，造成尿酸濃度升高；而AFB1急性毒性會誘發(fā)肝臟損傷、腎衰竭、肝細胞壞死，甚至引起死亡[12]。歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）前期已經(jīng)按照國家和年齡分組開展了黃曲霉毒素的暴露評估，并進行了定性的風險評估分析[13]，在此基礎(chǔ)上進行AFB1的DRM研究可為其風險評估提供定量依據(jù)。

接觸0.36 mg/kgmb及以上的AFB1會導致動物和人類急性肝損傷和死亡。已有研究報道有關(guān)AFB1導致肝細胞凋亡的定性研究，但關(guān)于AFB1急性暴露于肝臟的定量數(shù)據(jù)和有關(guān)劑量效應模型的研究很少。因此，本研究以大鼠為研究對象，通過設(shè)計實驗研究不同劑量AFB1對大鼠肝細胞凋亡率的影響，并基于實驗數(shù)據(jù)應用指數(shù)模型、對數(shù)模型、Weibull模型、Hill模型等常用模型擬合可能的劑量效應關(guān)系，通過數(shù)學檢驗進行參數(shù)比較，選擇最優(yōu)的DRM為黃曲霉毒素風險評估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

48 只SPF級雄性Wister大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。飼養(yǎng)于環(huán)境控制的動物實驗室內(nèi)，自由飲水飲食，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，相對濕度50%～55%，光照條件：亮暗周期各12 h。本研究進行的動物實驗程序均按照上海中醫(yī)藥大學《實驗動物護理與使用指南》進行，并經(jīng)中國動物中心動物倫理委員會和上海中醫(yī)藥大學批準，審查批準編號：PZSHUTCM210115014。

AFB1上海吉至科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）生工生物工程（上海）股份有限公司；水合氯醛 阿達瑪斯試劑有限公司；多聚甲醛、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；TUNEL染色試劑盒 武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-88L338超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；HH-S11-2-S恒溫水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZH5102A電子天平 珠恒電子有限公司；JB-L5凍臺 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機 上海徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；GFL-230烤箱天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司；G6004防脫載玻片、TSY-B脫色搖床、WG1066-1組化筆 武漢塞維爾生物科技有限公司；Giotto染色機 意大利DIAPATH公司；Eclipse E100正置光學顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組

48 只大鼠經(jīng)過1 周的適應性飼養(yǎng)后，隨機分為4 組（每組12 只）。空白組（CK組）：腹腔注射與AFB1劑量組相同量的4% DMSO溶液；AFB1低劑量組（LD組）：腹腔注射劑量為1 mg/kgmb的AFB1工作液一次；中劑量組（MD組）：腹腔注射劑量為2 mg/kgmb的AFB1工作液一次；高劑量組（HD組）：腹腔注射劑量為3 mg/kgmb的AFB1工作液一次，AFB1溶于4% DMSO溶液。AFB1的劑量根據(jù)參考文獻[14]和預實驗結(jié)果初步確定。

1.3.2 實驗動物處理

造模后的48 h對大鼠使用10%水合氯醛（350 mg/kgmb）進行麻醉處理，待麻醉之后對大鼠進行解剖，分離大鼠的肝臟組織并使用4%多聚甲醛溶液浸泡固定。

1.3.3 肝細胞凋亡率的測定（TUNEL染色）

在4%多聚甲醛中固定24 h后，取出肝臟組織進行石蠟包埋和切片（4 μm），然后對石蠟切片脫蠟復水，將蛋白酶K工作液滴加到組織切片處理，PBS漂洗，之后進行破膜處理和室溫平衡，加入TUNEL反應混合液（TdT酶∶dUTP∶Buffer＝1∶5∶50（體積比））在37 ℃恒溫箱中孵育2 h，PBS洗滌后滴加3%牛血清白蛋白覆蓋組織，加入雙抗，之后滴加DAPI染液，室溫避光放置10 min，滴加抗熒光猝滅封片液后使用熒光顯微鏡觀察拍照并進行細胞數(shù)量計算。肝細胞凋亡率按式（1）計算：

1.3.4 劑量效應模型構(gòu)建

常見的DRM包括指數(shù)模型、對數(shù)模型、Weibull模型、Hill模型等。以下模型中d為大鼠的注射劑量（mg/kgmb），P為大鼠肝細胞凋亡率，A、B、C均表示常數(shù)（表1），應用Origin Pro for Windows 8.0軟件中的Levenberg-Marquardt法（非線性最小二乘法）進行擬合。

表1 常見劑量效應模型及其相關(guān)參數(shù)Table 1 Common dose-response models and related parameters

1.3.5 數(shù)學檢驗與評價

參照Kasuya等[15]建模數(shù)學檢驗參數(shù)決定系數(shù)R2和Lin等[16]赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC）、貝葉斯信息準則（Bayesian information criterion，BIC）進行模型擬合度評價和最佳模型選擇，相關(guān)表達式如下：

式中：SSE為方差分析的殘差平方和；SST為總離差平方和。

式中：k為模型中未知參數(shù)個數(shù)；n為樣本數(shù)量；L為模型中極大似然函數(shù)值。

其中AIC代表實際值與預測值之間的符合程度，理論上AIC越小越好，然而當模型的復雜度提高（參數(shù)個數(shù)k增大）時，似然函數(shù)值也會增大，從而導致AIC變小。當k過大時，似然函數(shù)值增速減緩，模型過于復雜造成過度擬合現(xiàn)象。針對該問題，BIC引入了與參數(shù)個數(shù)相關(guān)，與AIC相比更大的懲罰項，考慮了當參數(shù)個數(shù)變大時，模型精度提高所造成的模型復雜度過高的現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1對大鼠肝細胞凋亡的影響

圖1為TUNEL染色結(jié)果部分切片，藍色部分代表正常肝細胞，其核膜結(jié)構(gòu)完整；綠色部分代表凋亡肝細胞，其核膜結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)簇狀或碎片狀。由圖1A～D可知，與CK組相比，LD組、MD組和HD組的凋亡率顯著上升，且隨著劑量的提高細胞凋亡率也有所上升（P＜0.05）。

圖1 AFB1對大鼠肝細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of AFB1 on apoptosis in rat hepatocytes

2.2 大鼠肝細胞凋亡率劑量效應關(guān)系的擬合

根據(jù)大鼠腹腔注射AFB1誘導肝細胞凋亡的定量數(shù)據(jù)（圖1），應用不同DRM擬合非線性關(guān)系如圖2所示。由圖2可知，除了在迭代次數(shù)范圍內(nèi)未收斂的Weibull模型1以外，其余DRM都達到了收斂的統(tǒng)計要求，并且相同的模型出現(xiàn)了幾乎重合的現(xiàn)象。其中DRM所預測的半數(shù)有效量（median effective dose，ED50），即能引發(fā)50%細胞凋亡的劑量均為1.91 mg/kgmb左右，與實際實驗所用劑量大致相當，也與EFSA[17]所預測的隨著AFB1濃度提高，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)生概率顯著升高的趨勢相同。對于AFB1造成肝細胞凋亡率的ED50可通過動物模型毒理學實驗進行進一步確認，本實驗結(jié)果僅作為預測劑量效應關(guān)系使用。

圖2 AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率不同劑量效應模型的擬合曲線Fig.2 Fitting curves of different dose-response models for AFB1-induced apoptosis rate in rat hepatocytes

從擬合結(jié)果來看，Weibull模型、Gamma模型和劑量效應曲線分別對應圖2中的曲線G、H、K、L，其決定系數(shù)R2＞0.9960（表2），在擬合效果上優(yōu)于其他模型。相同的模型在外延至高劑量和最小有效量時幾乎重合，預測細胞凋亡率結(jié)果與Ruggeberg等[18]實驗測得大鼠靜脈注射AFB1肝細胞凋亡率結(jié)果相似，證明本實驗DRM的可信性，但食品等殘留AFB1導致肝細胞凋亡的相關(guān)數(shù)據(jù)需要深入實驗。

表2 AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率劑量效應模型的參數(shù)估計及數(shù)學檢驗Table 2 Parameter estimation and mathematical testing of doseresponse models for AFB1-induced apoptosis rate in rat hepatocytes

2.3 劑量效應模型的數(shù)學檢驗

對構(gòu)建的DRM進行數(shù)學檢驗（表2），對比參數(shù)決定系數(shù)R2和AIC可知，劑量效應曲線（R2＝0.9970）和指數(shù)模型2、3（AIC＝33.91）優(yōu)于其他模型。

將BIC納入考慮的范疇內(nèi)，Gamma模型的BIC值（BIC＝17.19）僅比劑量效應曲線的BIC值（BIC＝15.88）大，且AIC值優(yōu)于大多數(shù)模型，參數(shù)決定系數(shù)也處于上述考慮范圍內(nèi)。Gamma模型（R2＝0.9964，AIC＝37.40，BIC＝17.19）優(yōu)于其他模型綜上所述，Gamma模型可作為AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率最優(yōu)的DRM用于劑量效應模型擬合的理論參考。

3 討論

急性暴露于AFB1不僅會影響肝臟和腎臟等器官[19]，還會抑制人類的免疫系統(tǒng)，使其受到傳染病的危害[20]。據(jù)報告，嚙齒動物口服AFB1的半數(shù)致死量在1～18 mg/kgmb之間[21]，而其他物種的研究表明AFB1的劑量小于1 mg/kgmb也可能導致死亡[22]，證明AFB1不僅會對器官造成不可逆的影響，還會威脅生命健康。EFSA食品鏈污染物小組根據(jù)各項動物研究數(shù)據(jù)推斷認為AFB1每日攝入量不得超過0.4 μg/kgmb，由于使用人類志愿者代替動物模型研究獲得劑量效應數(shù)據(jù)的方法存在許多困難，關(guān)于AFB1的人類數(shù)據(jù)遠不如動物數(shù)據(jù)那樣豐富，因此一般采用換算系數(shù)的方法外推有關(guān)人類的數(shù)據(jù)[23]。

本研究選用大鼠Wister腹腔注射肝細胞凋亡率的實驗數(shù)據(jù)建立DRM，由于AFB1檢測報告大多屬于定性檢測，關(guān)于大鼠的定量數(shù)據(jù)較少，缺少一定的參考，因此可能存在些許誤差。Williams[24]對虹鱒魚進行的劑量效應研究為AFB1風險評估模型提供了支持，未來定量風險評估必然是風險評估的新趨勢所在[25]。

指數(shù)模型是食品中有害物建立DRM的首要選擇，如沙門氏菌[26]、諾如病毒[27]等微生物均對指數(shù)模型表現(xiàn)出了良好的擬合性。然而有關(guān)霉菌毒素的DRM很少有研究，Gilbert-Sandoval等[28]基于生理動力學建模的反向劑量法預測AFB1在大鼠和人中的急性肝毒性劑量反應數(shù)據(jù)，通過定量體外劑量評估AFB1急性肝毒性并預測體內(nèi)毒性評估，為本實驗預測AFB1對于肝細胞凋亡率趨勢變化提供了參考。通過擬合模型推導低劑量效應存在不準確的可能性，會出現(xiàn)低劑量外推數(shù)據(jù)溢出問題[29]，因此在將本研究結(jié)果外推至人體或?qū)嶋H應用時應謹慎。

建立劑量效應模型后有必要采用志愿者實驗進行驗證，但是文獻中關(guān)于人類吸收AFB1的數(shù)據(jù)僅有Jubert等[30]召集3 位男性志愿者口服低劑量（30 ng）數(shù)據(jù)，在暴露1 h后觀測到血漿中的最大放射性尚未達到肝細胞凋亡的最低有效劑量，對于本研究不具備參考性。同時AFB1的感染劑量也會因為受體、環(huán)境因素、毒素作用等因素導致數(shù)據(jù)不同[31]，因此本研究采用常用的數(shù)學檢驗系數(shù)R2和AIC以及BIC評價和選擇。通過比較，建議選用Gamma模型作為黃曲霉毒素導致肝細胞凋亡率最優(yōu)劑量效應模型。

隨著風險評估模型的發(fā)展，在建立劑量效應模型的時候可以引入其他信息，例如引入新的參數(shù)TPI（time post inoculation），用于預測時間和劑量同時作為自變量引起的反應變化，從而建立時間劑量效應模型評估反映隨時間和劑量的發(fā)展趨勢，同時也能結(jié)合宿主因素(如年齡、性別）或病原體因素(如微生物氣溶膠直徑、感染性）等[32]。本研究結(jié)論僅針對于模型方法論時證明其可行性較好，在外推應用時應謹慎使用[33]。

4 結(jié)論

本研究基于AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡的定量分析結(jié)果，分別應用指數(shù)模型、對數(shù)模型、Weibull模型、Hill模型、Gamma模型、劑量效應曲線6 種模型擬合了AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率的劑量效應模型，其中指數(shù)模型、Gamma模型、劑量效應曲線表現(xiàn)出良好的擬合性，根據(jù)數(shù)學檢驗結(jié)果，建議選用Gamma模型作為AFB1誘導大鼠肝細胞凋亡率最優(yōu)的劑量效應模型用于AFB1定量風險評估框架中的危害特征描述。