亞鐵離子和吲哚丁酸促進(jìn)裂殖壺菌產(chǎn)DHA及發(fā)酵驗(yàn)證

李亞妃， 趙 犇， Martha Daniel Mbifile， 楊海麟， 王 武*

（1． 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

二十二碳六烯酸 （docosahexenoic acid， 簡(jiǎn)稱DHA），屬于ω- 3 型長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，對(duì)嬰兒視力發(fā)育和兒童智力發(fā)育起重要作用， 對(duì)高血壓、關(guān)節(jié)炎、成人糖尿病、抑郁、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成和某些癌癥有預(yù)防效果[1-5]。 作為DHA 生產(chǎn)菌株，裂殖壺菌（破囊壺菌科，Schizochytriumsp.）生長(zhǎng)快，產(chǎn)油高，DHA 含量高， 菌體是一種安全的食品添加劑，已成為工業(yè)化生產(chǎn)DHA 的優(yōu)秀菌種之一[6-10]。無(wú)機(jī)鹽中的金屬離子是微生物體內(nèi)一些酶的輔基，參與調(diào)節(jié)酶的結(jié)構(gòu)和活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性，對(duì)于屬于海洋真菌的裂殖壺菌有明顯影響[11]。 生長(zhǎng)素是一類能以極低的濃度來(lái)調(diào)節(jié)植物的生理過(guò)程的微量活性物質(zhì)，對(duì)破囊壺菌（T. roseumMF2 ）和裂殖壺菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)DHA 有很大影響[12-13]。作者首先分別研究了無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)素類植物激素對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)和產(chǎn)油的影響， 確定FeSO4對(duì)裂殖壺菌的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，吲哚乙酸（Indolebutyric acid，簡(jiǎn)稱IBA）則對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)和產(chǎn)DHA 有明顯提高。 在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了FeSO4和IBA 的兩因素、三水平的響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 旨在探究FeSO4和IBA的組合添加對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)、 產(chǎn)油和DHA 含量的影響，得到組合添加FeSO4和IBA 培養(yǎng)裂殖壺菌產(chǎn)DHA 的最佳培養(yǎng)方案。 最后在7.5 L 發(fā)酵罐中分別進(jìn)行了對(duì)照組和優(yōu)化后發(fā)酵策略的放大實(shí)驗(yàn)，探究FeSO4和IBA 對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵周期中各階段的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

裂殖壺菌Schizochytruimsp.AB-610，由作者所在實(shí)驗(yàn)室ARTP 誘變獲得， 于-40 ℃保存于20%甘油管中。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：30 g/L 葡萄糖，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，溶于50%人工海水中。 人工海水配方由作者所在實(shí)驗(yàn)室在基礎(chǔ)上優(yōu)化所得：11 g/L NaCl，0.8 g/L KCl，1.22 g/L MgCl2，0.71 g/L CaSO4，0.93 g/L MgSO4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：100 g/L 葡萄糖，4 g/L 胰蛋白胨，18 g/L MgSO4，20 g/L 谷氨酸鈉，2.5 g/L KH2PO4，0.4 g/L CaCl2，蒸餾水與人工海水按體積比1∶1 混合。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 搖瓶種子培養(yǎng)接種1 mL 甘油管菌種于種子培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃下培養(yǎng)48 h 為一級(jí)種子液。將一級(jí)種子液以10%接種體積分?jǐn)?shù)接入100 mL 種子培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃下培養(yǎng)24 h 為二級(jí)種子液。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵方法將一級(jí)種子液以10%接種體積分?jǐn)?shù)接入100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃下培養(yǎng)5 d。

1.3.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵方法將二級(jí)種子液以10%接種體積分?jǐn)?shù)接入載有3 L 發(fā)酵培養(yǎng)基的NBS110型7.5 L 發(fā)酵罐中， 中后期維持葡萄糖質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)，調(diào)控pH 為6.8，400 r/min、28 ℃下培養(yǎng)5 d，進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 菌體干質(zhì)量測(cè)定取10 mL 發(fā)酵液于已稱質(zhì)量的離心管中，于8 000 r/min 離心15 min，棄上清液，再以去離子水清洗菌體，置于60 ℃干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

1.4.2 裂殖壺菌油脂提取取20 mL 發(fā)酵液于旋塞離心管中，于8 000 r/min 離心15 min，棄上清液，再以去離子水清洗菌體。 以去離子水定容至5 mL，加入8 mL 鹽酸，加入玻璃珠混勻，70 ℃水浴2 h。加入20 mL 正己烷，混勻，取上層有機(jī)層于已稱質(zhì)量的蒸餾瓶中，于55 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

1.4.3 油脂中脂肪酸組成測(cè)定脂肪酸甲酯化及脂肪酸組成測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]。

縱觀張岱家族，從張?zhí)鞆?fù)、張?jiān)斫?jīng)過(guò)張汝霖到張岱，都十分欣賞徐渭的才學(xué)。從送馬金囊、短袖皮襖和菽酒，鼎力幫其出獄，到編寫(xiě)《會(huì)稽縣志》，天復(fù)、元忭父子主要通過(guò)生活上、行動(dòng)上體現(xiàn)了對(duì)徐渭的關(guān)愛(ài)，而張汝霖、張岱祖孫倆，則通過(guò)寫(xiě)文輯書(shū)的方式表達(dá)了他們對(duì)徐渭的敬意。

1.4.4 發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定取發(fā)酵液1 mL，于8 000 r/min 離心15 min

，取上清液用去離子水稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度， 利用SBA-40B 型生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 無(wú)機(jī)鹽分別對(duì)Schizochytruim sp.AB-610 生長(zhǎng)和產(chǎn)DHA 的促進(jìn)作用

分別選擇了ZnSO4、MnCl2、FeSO4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，三組實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中以生物量為標(biāo)準(zhǔn)所確定的最優(yōu)添加量及其對(duì)應(yīng)的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 ZnSO4、MnCl2、FeSO4 對(duì)Schizochytruim sp.AB-610 生長(zhǎng)和產(chǎn)油的影響Table 1 Effects of ZnSO4、MnCl2、FeSO4 on DCW/lipids/DHA in Schizochytruim sp.AB-610

ZnSO4抑制了Schizochytruimsp.AB-610 生長(zhǎng)，在添加了ZnSO4的實(shí)驗(yàn)中， 菌體生物量下降了10.7%，油脂產(chǎn)量和DHA 產(chǎn)量亦有所下降。Zn2+對(duì)包括糖酵解途徑中的一些重要酶促反應(yīng)有抑制[14]，推測(cè)可能是Zn2+影響了Schizochytruimsp.AB-610 中的能量代謝，從而影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)油。

MnCl2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和DHA 產(chǎn)量無(wú)明顯影響，而對(duì)胞內(nèi)油脂產(chǎn)量有所抑制， 使得油脂內(nèi)DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了10.6%。 根據(jù)MnCl2組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)添加量在24~48 mg/L 時(shí)， 胞內(nèi)油脂含率逐漸降低，而油脂內(nèi)DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸提高。 裂殖壺菌利用NADPH 和乙酰輔酶A 通過(guò)不同的代謝途徑合成飽和脂肪酸和與多不飽和脂肪酸（DHA、DPA、EPA）[15]?；诖耍髡咄茰y(cè)Mn2+對(duì)Schizochytruimsp.AB-610中飽和脂肪酸的合成有明顯抑制作用，而對(duì)其多不飽和脂肪酸的合成無(wú)明顯影響。

FeSO4對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用， 添加量為1 mmol/L 時(shí)菌體生物量較對(duì)照組提高了35.7%，F(xiàn)eSO4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。 通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eSO4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)油的促進(jìn)作用不同步，1 mmol/L 時(shí)對(duì)細(xì)胞的促進(jìn)最大， 而在1.5 mmol/L 油脂內(nèi)DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)促進(jìn)最大，為46.13%，此時(shí)生物量為41.03 g/L。

圖1 FeSO4 對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)和產(chǎn)油的影響Fig. 1 Effect of FeSO4 on biomass，lipids，DHA in Schizochytruim sp.AB-610

基于此，可在后期利用裂殖壺菌發(fā)酵周期中發(fā)酵特性的變化開(kāi)展分階段補(bǔ)加Fe2+的研究。Fe2+作為輔基參與多種酶促反應(yīng)， 而其對(duì)Schizochytruimsp.AB-610 生長(zhǎng)的高效促進(jìn)作用可能是由于其參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)油中的某些代謝途徑，促進(jìn)了能量代謝。 后續(xù)可通過(guò)分子生物學(xué)手段如轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法進(jìn)行Fe2+高效促進(jìn)Schizochytruimsp.AB-610 細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)理研究。

2.2 生長(zhǎng)素對(duì)Schizochytruim sp.AB-610 生長(zhǎng)和產(chǎn)油的影響

分別選擇了吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，三組實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中以生物量為標(biāo)準(zhǔn)所確定的最優(yōu)添加量及其對(duì)應(yīng)的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表2。

萘乙酸為類生長(zhǎng)素，可促進(jìn)植物細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它對(duì)Schizochytruimsp.AB-610的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，在添加量為1 mg/L 時(shí)生物量達(dá)到最大，為37.35 g/L，較對(duì)照組提高了13.6%。實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，NAA 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)油和產(chǎn)DHA 產(chǎn)量并無(wú)明顯影響。

吲哚丁酸對(duì)Schizochytruimsp.AB-610 的生長(zhǎng)和產(chǎn)油均有明顯促進(jìn)作用，添加量為7 mg/L 時(shí)生物量、油脂產(chǎn)量和DHA 產(chǎn)量均達(dá)到最大值，結(jié)果見(jiàn)圖2。推測(cè)IBA 不僅促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，同時(shí)與胞內(nèi)多不飽和脂肪酸合成途徑中的相關(guān)酶系有影響，促進(jìn)了多不飽和脂肪酸的合成，從而提高了胞內(nèi)油脂中的DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后續(xù)將選擇IBA 進(jìn)一步研究。

表3 中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experiment design and results of center composite design

2.3 促進(jìn)因子應(yīng)用于發(fā)酵的響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)中裂殖壺菌的生物量、油脂產(chǎn)量和油脂中DHA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所提高。 為了進(jìn)一步提高DHA 生產(chǎn)水平， 在單因素研究的基礎(chǔ)上，以FeSO4、IBA 的最佳點(diǎn)作為中心點(diǎn)，在500 mL 搖瓶中進(jìn)行兩因素、 三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)， 利用Design -Expert.V8.0.6.1 軟件中Center Composite Design 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 設(shè)計(jì)因素包括A：FeSO4添加濃度、B：IBA 添加質(zhì)量濃度，因變量包括DCW、油脂產(chǎn)量、DHA 產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表3。

利用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件分別對(duì)油脂產(chǎn)量和DHA 產(chǎn)量進(jìn)行回歸分析與擬合。 油脂產(chǎn)量的回歸模型及方差結(jié)果見(jiàn)表4。 模型的F=19.9，P=0.000 5。 一般認(rèn)為當(dāng)P值小于0.05 時(shí)， 模型顯著，因此該模型顯著。模型失擬項(xiàng)F=1.28，P=0.408 9。一般認(rèn)為P值大于0.05 時(shí)，不顯著，因此模型失擬項(xiàng) 不 顯 著。 模 型 中B、AB、AC和A2的P值 小 于0.05，說(shuō)明這些因素顯著，A的P值大于0.1，說(shuō)明不顯著。 多元二次回歸模型為：

油脂產(chǎn)量=-1.473 63+20.504 67*FeSO4+2.919 09* IBA-10.037 47 *FeSO42-0.244 63*IBA2

表4 油脂產(chǎn)量二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of Variance for quadratic response surface regression model of the lipids yield

DHA 產(chǎn)量的回歸模型及方差結(jié)果見(jiàn)表5。 模型的F=25.82，P=0.000 1。該模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著。模型中B、AB、AC和A2的P值小于0.05，說(shuō)明這些因素顯著，A的P值大于0.1，說(shuō)明不顯著。 多元二次回歸模型為：

DHA 產(chǎn)量=-2.917 66+10.660 87* FeSO4+1.887 51*IBA-5.280 94* FeSO42-0.148 83*IBA2

通過(guò)所獲模型方程對(duì)油脂產(chǎn)量和DHA 產(chǎn)量進(jìn)行整理，得到A：0.95 mmol/L，B：6.5 mg/L，細(xì)胞生物量為模型預(yù)測(cè)值為48.38 g/L， 油脂產(chǎn)量17.59 g/L，DHA 產(chǎn) 量8.43 g/L， 油 脂 中DHA 質(zhì) 量 分 數(shù) 為47.9%。 在該條件下進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為生物量（49.23±0.25） g/L，油脂產(chǎn)量（17.73±0.13） g/L，DHA 產(chǎn)量（8.11±0.23） g/L，油脂中DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)（47.6±0.2）%。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值相吻合，見(jiàn)圖3。

2.4 添加促進(jìn)因子后裂殖壺菌發(fā)酵的特性

2.4.1 對(duì)照組中裂殖壺菌細(xì)胞形態(tài)變化走勢(shì)裂殖壺菌生殖方式包括二分裂生殖、孢子生殖和異形體增殖， 作者所在實(shí)驗(yàn)室菌株Schizochytruimsp.AB-610 以連續(xù)二分裂為主要生殖方式[14]。 在NBS 7.5 L 發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵下培養(yǎng)Schizochytruimsp.AB-610 5 d，初始裝液量3 L，接入體積分?jǐn)?shù)10%預(yù)培養(yǎng)的種子液，28 ℃、通氣量3 vvm，pH 6.8 條件下對(duì)裂殖壺菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，48 h 開(kāi)始補(bǔ)加一定葡萄糖， 維持葡萄糖質(zhì)量濃度在40～50 g/L， 觀察Schizochytruimsp.AB-610 發(fā)酵周期中各分裂形態(tài)細(xì)胞（單細(xì)胞、二分體、四分體、八分體、多分體和成團(tuán)細(xì)胞）的比例，確定裂殖壺菌發(fā)酵周期中細(xì)胞所處的時(shí)期。

表5 DHA 產(chǎn)量二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 5 Analysis of Variance for quadratic response surface regression model of the DHA yield

發(fā)酵前期，分裂形態(tài)細(xì)胞占據(jù)主體。 二分體比例在6 h 時(shí)達(dá)到峰值47.4%， 之后八分體細(xì)胞則占據(jù)主體地位，12～24 h 時(shí)， 八分裂細(xì)胞比例維持在57%～64%。 單細(xì)胞比例在前期（6～18 h）有所下降，在18 h 達(dá)到最低值11.1%，中后期則持續(xù)上升。 中期分裂形態(tài)細(xì)胞比例開(kāi)始下降，單細(xì)胞比例持續(xù)增高，至66 h 時(shí)，單細(xì)胞比例超過(guò)50%。后期各形態(tài)細(xì)胞趨于穩(wěn)定，細(xì)胞基本停止分裂活動(dòng)。 作者在觀測(cè)時(shí)未計(jì)入異形體、孢子囊等其他增殖方式的細(xì)胞形態(tài)，見(jiàn)圖4。

圖3 Center Composite Design 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下Schizochytruim sp.AB-610 發(fā)酵響應(yīng)面Fig. 3 Results of fermentation of Schizochytruim sp.AB-610 with Center Composite Design

圖4 裂殖壺菌發(fā)酵周期中各形態(tài)細(xì)胞比例的變化Fig. 4 Ratio of different morphologic cells during fermentation of Schizochytruim sp.AB-610

由此說(shuō)明裂殖壺菌發(fā)酵過(guò)程中，前期菌體以分裂細(xì)胞形態(tài)為主，細(xì)胞快速分裂；中期細(xì)胞開(kāi)始分離，細(xì)胞開(kāi)始變大，逐漸轉(zhuǎn)入產(chǎn)油期，多細(xì)胞形態(tài)比例減少，細(xì)胞分裂速度減慢，至后期細(xì)胞基本穩(wěn)定，無(wú)明顯形態(tài)變化。

2.4.2 裂殖壺菌發(fā)酵特性在NBS 7.5 L 發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵條件下培養(yǎng)Schizochytruimsp.AB-610 5 d，發(fā)酵策略同上，每隔12 小時(shí)取樣，測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖、生物量、油脂產(chǎn)量、油脂中脂肪酸組成。 對(duì)照組及添加促進(jìn)因子后的發(fā)酵特性曲線見(jiàn)圖5。

分析對(duì)照組發(fā)酵特性曲線，Schizochytruimsp.AB-610 的補(bǔ)料分批發(fā)酵周期中，1） 生物量變化規(guī)律：0~24 h 內(nèi)，菌體量增長(zhǎng)緩慢，碳源消耗速率小，24~72 h 菌體量快速增長(zhǎng)， 特別在24~48 h 內(nèi)對(duì)碳源的細(xì)胞得率（YX/S）最大，細(xì)胞平均生長(zhǎng)速率為1.19 g/（L·h），80 h 時(shí)生物量達(dá)到64.6 g/L， 之后生物量緩慢下降。2）油脂含率變化規(guī)律：12~48 h 內(nèi)菌體內(nèi)油脂含率緩慢下降，而在48~96 h 內(nèi)迅速上升，96 h時(shí)達(dá)到最高值40.5%， 之后至發(fā)酵結(jié)束期間內(nèi)緩慢下降。 發(fā)酵伊始生物量和油脂產(chǎn)量均較低，所得油脂含率誤差較大，此處并未分析。 3）油脂內(nèi)DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)：油脂中DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12~60 h 內(nèi)持續(xù)降低，在60~120 h 內(nèi)持續(xù)緩慢上升，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到41.13%。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌體生物量為64.06 g/L，菌體內(nèi)油脂含率38.9%， 油脂中DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.13%。

結(jié)合發(fā)酵周期中細(xì)胞形態(tài)變化趨勢(shì)，0~24 h內(nèi)，菌體快速分裂，但代謝速率低，細(xì)胞個(gè)體仍較小，生物量上升緩慢。 24~48 h 內(nèi)，細(xì)胞仍處于旺盛分裂時(shí)期，碳源消耗速率高，細(xì)胞得率高，生物量快速增長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量和個(gè)體均處于增長(zhǎng)時(shí)期。 48~96 h內(nèi)，細(xì)胞二分裂活動(dòng)逐漸減緩，開(kāi)始快速積累油脂，且在前期（48~72 h）以合成飽和脂肪酸為主。96~120 h菌體量和細(xì)胞活動(dòng)都趨于穩(wěn)定，葡萄糖消耗速率和比消耗速率下降， 菌體消耗了自身的一部分油脂，且偏好于消耗飽和脂肪酸。 依據(jù)上述特點(diǎn)確定：Schizochytruimsp.AB-610 的補(bǔ)料分批發(fā)酵周期中，0~24 h 為菌體適應(yīng)期，24~48 h 為菌體快速生長(zhǎng)期，48~96 h 為油脂快速積累期，96~120 h 則為油脂返耗期。

圖5 Schizochytruim sp.AB-610 發(fā)酵特性曲線對(duì)照組、添加了促進(jìn)因子組Fig. 5 Fermentation characteristic curve of Schizochytruim sp.AB-610 with control supply FeSO4&IBA

添加促進(jìn)因子的補(bǔ)料分批發(fā)酵中，菌體適應(yīng)期（0~24 h）， 添加雙促進(jìn)因子的試驗(yàn)組與對(duì)照組并無(wú)明顯區(qū)別。 快速生長(zhǎng)期（24~48 h），雙促進(jìn)因子的添加有效促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)，試驗(yàn)組的生長(zhǎng)速率達(dá)到1.51 g/（L·h），較對(duì)照組提高了26.7%，至快速生長(zhǎng)期結(jié)束，試驗(yàn)組的生物量達(dá)到49.23 g/L。 油脂積累期（48~96 h）， 試驗(yàn)組細(xì)胞的油脂含率略低于對(duì)照組，分析原因可能是生物量的提高更多地消耗了培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素和溶氧等，一定程度上限制了胞內(nèi)油脂積累。48~84 h 為產(chǎn)油旺盛期，試驗(yàn)組的油脂積累速率為0.604 g/（L·h），高于對(duì)照組的0.454 g/（L·h），這依賴于試驗(yàn)組更高濃度的菌體。 產(chǎn)油期結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組油脂中DHA 為41.5%，高于對(duì)照組，說(shuō)明雙促的添加有利于細(xì)胞中DHA 的合成。 油脂返耗期（96~120 h），生物量至108 h 時(shí)仍有微弱增長(zhǎng)，達(dá)到最高值93.03 g/L，說(shuō)明雙促的添加延長(zhǎng)了菌體的生長(zhǎng)期，后期試驗(yàn)組生物量消耗較對(duì)照組大，這可能是試驗(yàn)組生物量基數(shù)較大引起的。 至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，添加雙促進(jìn)因子的補(bǔ)料分批發(fā)酵生物量、 油脂產(chǎn)量、DHA 產(chǎn)量分別為90.56、35.42、15.52 g/L。 DHA生產(chǎn)強(qiáng)度為3.10 g/（L·d），得到了有效提高。

雙促進(jìn)因子的添加可有效地提高Schizochytruimsp. AB-610 快速生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率，促進(jìn)產(chǎn)油期DHA 的合成，對(duì)DHA 的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度有大幅提高，證明雙促進(jìn)因子的添加對(duì)高密度發(fā)酵產(chǎn)DHA 同樣有顯著促進(jìn)。 同時(shí)，本研究并未將發(fā)酵技術(shù)復(fù)雜化，有利于放大生產(chǎn)，同時(shí)與其他技術(shù)手段相結(jié)合， 進(jìn)一步提高高密度發(fā)酵的生產(chǎn)水平，有望提高大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)DHA 的生產(chǎn)強(qiáng)度。

3 結(jié) 語(yǔ)

作者確定了FeSO4可高效促進(jìn)Schizochytruimsp.AB-610 的 生 長(zhǎng)，IBA 對(duì)Schizochytruimsp.AB-610 生長(zhǎng)和產(chǎn)DHA 均有促進(jìn)，并利用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了兩種促進(jìn)因子組合添加的最適添加量為FeSO40.95 mmol/L，IBA 6.5 mg/L，搖瓶驗(yàn)證試驗(yàn)中較對(duì)照組生物量提高了50.01%，DHA 產(chǎn)量提高了65.17%。 通過(guò)初步放大發(fā)酵試驗(yàn)證明，添加兩種促進(jìn)因子高效促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)，提高了快速生長(zhǎng)期細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，延長(zhǎng)了菌體增長(zhǎng)的時(shí)期，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)生物量為90.56 g/L， 油脂產(chǎn)量為35.42 g/L，DHA 產(chǎn)量為15.52 g/L， 較對(duì)照組均有明顯提高，且DHA 的生產(chǎn)強(qiáng)度提高了51.22%。