膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01 胞外多糖提取純化工藝

郁 莉， 付海田， 彭夢霞， 鄧 超， 陳敬華*

（1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122；3. 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

微生物胞外多糖是自然界中來源比較豐富的一類生物大分子，因其獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物活性而被廣泛的應(yīng)用于食品和非食品工業(yè)以及醫(yī)藥領(lǐng)域[1]。 近年來，隨著糖化學(xué)和糖生物學(xué)研究的深入，越來越多的新型微生物多糖相繼被發(fā)現(xiàn)。 盡管如此，真正接近工業(yè)化生產(chǎn)的卻僅有十幾種，其中提取純化工藝是微生物多糖工業(yè)化生產(chǎn)的制約因素之一[2]，微生物胞外多糖提取工藝直接影響多糖的質(zhì)量以及生產(chǎn)成本。 因此，經(jīng)濟(jì)可行的提取工藝對提高多糖的市場競爭力和拓展多糖的應(yīng)用領(lǐng)域具有現(xiàn)實(shí)意義。

膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖（BMPS）是膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）在微氮培養(yǎng)基中產(chǎn)生的一類類葡甘聚糖的酸性雜多糖[3]，因其具有良好的保水性、生物相容性、毒性低以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品和環(huán)保等領(lǐng)域[4-6]，具有極大的開發(fā)價值和廣闊的市場前景。 隨著膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖在更多新領(lǐng)域的應(yīng)用，其相關(guān)研究也越來越受到人們的關(guān)注。 目前，膠質(zhì)芽胞桿菌胞外多糖的生產(chǎn)基本采用液體發(fā)酵工藝，其發(fā)酵液含有少量蛋白質(zhì)且無色素產(chǎn)生， 但多糖含量較高，粘度較大，發(fā)酵液與菌體難以分離，給后續(xù)的分離純化帶來較大困難，從而導(dǎo)致產(chǎn)品收率低，生產(chǎn)成本高，對其推廣應(yīng)用極為不利。

作者所在實(shí)驗(yàn)室對B.mucilaginosusSM-01 發(fā)酵得到的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，利用稀釋和加入NaCl的方法降低粘度，同時加入適當(dāng)?shù)墓柙逋磷鳛轭A(yù)吸附劑；在布氏漏斗中加入載片，預(yù)涂一定量的硅藻土作為自制的抽濾裝置，采用抽濾的方法可以通過一步法去除菌體和雜蛋白質(zhì)。 對得到的濾液采用超濾濃縮提取胞外多糖，建立了一條高效可行且經(jīng)濟(jì)的胞外多糖提取純化工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01：保藏于中國菌種保藏中心，保藏號5766。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，尿素0.1，輕質(zhì)CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.2，NaCl 0.2，瓊脂20；pH 7.0~7.2。

2）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，尿素0.1，輕質(zhì)CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.2，NaCl 0.2；pH 7.0~7.2。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖60，尿素0.3，輕質(zhì)CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO40.2，NaCl 0.4；pH 7.0~7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550 型分光光度計： 日本島津公司；HeraeusMultifuge X3R 高速冷凍離心機(jī)： 美國Thermo 公司；THZ-C 型恒溫振蕩器：江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；硅藻土抽濾裝置：自制；真空冷凍干燥機(jī)：美國Labconco 公司；磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；SevenEasy 精 密pH 計： 上 海Mettler-ToLedo 公司；NDJ-1 型旋轉(zhuǎn)粘度計： 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；Labscale TFF System 小型切向超濾系統(tǒng)： 美國Millipore 公司；BiomaxPolythersulfone 小型超濾膜包 （膜面積50 cm2， 截留相對分子質(zhì)量10 000、200 000、500 000）：美國Millipore 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵將斜面保藏的菌種于平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h， 活化兩次，將活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h， 再將此種子液按4%的接種體積分?jǐn)?shù)接入到30 L 的罐中，30 ℃、600 r/min、2 vvm發(fā)酵培養(yǎng)72 h 獲得發(fā)酵液。

1.3.2 發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液于80 ℃下攪拌加熱20 min 進(jìn)行菌體滅活， 同時加入6 mol/L 鹽酸適量除去發(fā)酵液中殘留的CaCO3， 由于發(fā)酵液中多糖含量較高而導(dǎo)致粘度較大，給后續(xù)的分離純化帶來一定困難， 降低發(fā)酵液的粘度有利于實(shí)現(xiàn)菌液分離。 通常對于含有聚電解質(zhì)的發(fā)酵液可以通過添加鹽、稀釋體積、改變pH 值以及升高溫度的方式降低粘度。

1）無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇：鑒于BMPS 為陰離子聚電解質(zhì)，無機(jī)鹽的加入對其分子鏈上的電荷具有屏蔽效應(yīng)而使得分子鏈?zhǔn)湛s，粘度降低。 考慮到培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量較低，加入適當(dāng)?shù)臒o機(jī)鹽將有效降低發(fā)酵液的粘度。 取等體積發(fā)酵液，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%~5%的NaCl，攪拌均勻后在25 ℃下測定其粘度。

2）稀釋體積的選擇：將發(fā)酵液加入不同體積去離子水稀釋， 依次稀釋到原體積的1、2、3、4、5 倍，分別測量稀釋后發(fā)酵液粘度，將稀釋后的發(fā)酵液進(jìn)行離心和抽濾，比較離心和抽濾兩種方法對去除菌體和蛋白質(zhì)的影響。

3）pH 的選擇：發(fā)酵液的pH 對其粘度也有一定的影響， 但是pH 過高或過低都會破壞多糖的分子結(jié)構(gòu)， 因此將發(fā)酵液的pH 調(diào)節(jié)為1、3、5、7、9、11，分別測試不同pH 條件下發(fā)酵液的粘度。

4）硅藻土添加量的確定：在等體積發(fā)酵液中分別加入10、20、30 g/L 硅藻土，充分?jǐn)嚢?，在相同條件下抽濾，比較硅藻土添加量對去除菌體和蛋白質(zhì)的影響以及對多糖回收率的影響。

1.3.3 超濾條件的確定通常對濾液中多糖的提取可以采用醇沉法，但對于較大體積濾液的醇沉易造成醇類的損耗，增加成本，且在醇沉過程中很多小分子物質(zhì)如鹽類也會隨之沉淀出來。 膜超濾分離技術(shù)作為一種提純和濃縮的技術(shù)， 具有設(shè)備簡單、對樣品無破壞、安全等優(yōu)點(diǎn)，易于工業(yè)放大，該技術(shù)應(yīng)用在多糖的制備中已有不少報道[7-9]。

1）超濾膜的選擇：在25 ℃、0.1 MPa 條件下，采用三種超濾膜（10 000、200 000、500 000）對1 000 mL 濾液進(jìn)行超濾濃縮， 考察膜通量隨超濾時間的變化，比較不同超濾膜的多糖截留率。

2）操作壓力的選擇：在25 ℃下，采用200 000超濾膜對濾液在不同操作壓力下（0.05、0.1、0.15 MPa）對1 000 mL 濾液進(jìn)行超濾濃縮，考察不同操作壓力下膜通量隨時間的變化。

1.3.4 方法測定

1）發(fā)酵液粘度的測定：由于BMPS 發(fā)酵液粘度較高，因此選用4#轉(zhuǎn)子進(jìn)行粘度檢測。 量取固定體積樣品倒入100 mL 燒杯中，置于數(shù)顯粘度計下，放入4#轉(zhuǎn)子，旋轉(zhuǎn)檢測粘度。

2）菌體量測定：發(fā)酵液經(jīng)去離子水稀釋一定倍數(shù)后，660 nm 下測定吸光度。

3）多糖質(zhì)量濃度測定：總糖質(zhì)量濃度測定采用苯酚硫酸法[10]；還原糖質(zhì)量濃度測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[11]。

多糖質(zhì)量濃度=總糖質(zhì)量濃度-還原糖質(zhì)量濃度

4）蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定：按照Bradford 方法[12]，牛血清白蛋白作為對照品。

5）多糖截留率計算：

式中，Vu指超濾濃縮體積；cu指超濾濃縮液中多糖濃度；Vi指料液體積；ci指料液中多糖濃度。

6）除菌率計算：

式中，F(xiàn)a指初始發(fā)酵液中菌體量；Fb指處理后發(fā)酵液中菌體量。

7）除蛋白質(zhì)率：

式中，Pa指初始發(fā)酵液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；Pb指處理后發(fā)酵液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

8）多糖回收率：

式中，Ma指濾液中多糖質(zhì)量濃度；Mb指初始發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度。

9）熱原含量：熱原的測定采用鱟試劑法[13]，脂多糖作為陽性對照。

10）紫外光譜：配制適宜濃度的多糖水溶液，進(jìn)行紫外全波長掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵液預(yù)處理

2.1.1 無機(jī)鹽、溫度、pH 和稀釋倍數(shù)對發(fā)酵液粘度的影響經(jīng)過72 h 發(fā)酵得到白色粘稠初始發(fā)酵液，pH 約為6.5，多糖質(zhì)量濃度較高（32.51 g/L），為提高菌體和發(fā)酵液的分離效果， 需要降低發(fā)酵液粘度。由圖1 可以看出，NaCl 的添加量、 溫度、pH 以及稀釋倍數(shù)均對發(fā)酵液粘度有影響，其中稀釋倍數(shù)對發(fā)酵液粘度的影響最為顯著（圖1（d）），隨著稀釋倍數(shù)的增大，粘度急劇下降，當(dāng)稀釋倍數(shù)為5 倍時，粘度由6.95 Pa·s 降低為0.16 Pa·s。 這是由于在初始發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度較高，分子鏈較長，多糖分子互相纏結(jié)導(dǎo)致粘度增大， 隨著稀釋倍數(shù)的增大，多糖鏈間距變大，分子纏結(jié)減小，粘度下降。 其次對發(fā)酵液粘度有較大影響的是NaCl 的添加量 （圖1（a）），當(dāng)發(fā)酵液中加入1%NaCl 時，發(fā)酵液粘度出現(xiàn)一定程度的降低；繼續(xù)添加時，粘度變化逐漸減??；當(dāng)添加量大于3%時，粘度基本不再變化，發(fā)酵液顯示一定的抗鹽性。 由圖1（b）可以發(fā)現(xiàn)，溫度對粘度的影響并不顯著，當(dāng)溫度升至50 ℃時，發(fā)酵液粘度僅降低到4.9 Pa·s，雖然升溫可以降低粘度，但是高溫易造成分子鏈的斷裂和構(gòu)象的改變，通常提取純化時應(yīng)盡量避免高溫條件。 圖1（c）顯示，酸性環(huán)境和堿性環(huán)境下發(fā)酵液粘度都有一定程度的降低，相比較酸性環(huán)境，堿性環(huán)境的粘度降幅更大，當(dāng)pH 為11 時，粘度降為4.4 Pa·s。 考慮到過酸或過堿的環(huán)境都將造成多糖鏈上官能團(tuán)的丟失以及多糖的降解，在純化過程中應(yīng)選擇相對溫和的pH 條件。

圖1 不同因素對發(fā)酵液粘度的影響Fig. 1 Influence of different factors on the viscosity of the fermentation broth for B. mucilaginosus SM-01

可以發(fā)現(xiàn)， 通過升溫和改變pH 的方式對發(fā)酵液的粘度影響均不大，且發(fā)酵液具有一定的耐鹽性和耐酸堿性， 與黃原膠的耐酸堿和耐鹽性比較相似，在黃原膠發(fā)酵液的預(yù)處理過程中，稀釋法是常采用的降低粘度的方法。 考慮到向發(fā)酵液中添加NaCl 和稀釋發(fā)酵液均能降低發(fā)酵液粘度且不會影響多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)， 且過量NaCl 的添加對粘度影響不大，因此采用3 g/dLNaCl 添加量，稀釋不同體積，考察不同稀釋倍數(shù)下，離心和硅藻土過濾這兩種方法對發(fā)酵液中除菌和除蛋白質(zhì)的影響。

2.1.2 離心和抽濾對除菌率和蛋白質(zhì)的影響在去除CaCO3的發(fā)酵液中加入3 g/dLNaCl，在不同的稀釋倍數(shù)下分別考察離心和抽濾兩種方式對發(fā)酵液除菌和除蛋白質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)采用抽濾的方法時， 稀釋倍數(shù)對除菌率的影響并不顯著，除菌率在80%左右，這是由于硅藻土涂層能夠有效截留以及吸附發(fā)酵液中的菌體， 即使稀釋倍數(shù)較小時，通過抽濾可以除去發(fā)酵液中大部分菌體；與之相反，稀釋對離心除菌效果影響比較明顯，當(dāng)發(fā)酵液不稀釋或稀釋倍數(shù)比較小時， 盡管有鹽的存在，發(fā)酵液粘度依舊較大，菌體被多糖緊密包裹，除菌效果不理想，隨著稀釋倍數(shù)的增大，除菌率逐漸增大，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到5 倍時，離心和抽濾的除菌效果比較接近。 稀釋倍數(shù)對離心和抽濾的除蛋白質(zhì)率影響皆不明顯，隨著稀釋倍數(shù)的增大，除蛋白質(zhì)率略微增大，但離心并不能有效除去發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，除蛋白質(zhì)率基本維持在6%左右；而對于預(yù)涂了硅藻土的抽濾裝置來說，硅藻土涂層能較好的吸附蛋白質(zhì)，達(dá)到除蛋白質(zhì)的目的，除蛋白質(zhì)率基本達(dá)到70%以上。 且離心的方法對設(shè)備的要求較高，較難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因此利用吸附性過濾介質(zhì)對發(fā)酵液進(jìn)行除菌和除蛋白質(zhì)是一個經(jīng)濟(jì)簡便的方法。

盡管稀釋倍數(shù)對離心和抽濾的除菌率和除蛋白質(zhì)率影響皆不顯著，但是其對抽濾通量和多糖回收率卻有較大影響。 由表1 可知，當(dāng)稀釋倍數(shù)較小時，發(fā)酵液較為粘稠，在濾餅上容易形成凝膠層，因此，過濾通量較小，多糖回收率較低。 隨著稀釋倍數(shù)的增大，過濾通量和回收率逐漸增大，當(dāng)稀釋倍數(shù)高于3 倍時， 多糖回收率基本維持在恒定水平，約達(dá)90%。 然而過高的稀釋倍數(shù)將會給后續(xù)濃縮帶來麻煩，因此抽濾時采用3 倍體積稀釋。

表1 稀釋倍數(shù)對濾液的菌體量、抽濾通量及多糖回收率的影響Table 1 Influence ofdilution ratio on filtration of fermentation broth

2.1.3 發(fā)酵液中硅藻土的添加量對發(fā)酵液的影響硅藻土除了作為過濾介質(zhì)， 還是一種理想的吸附劑，能夠有效吸附菌體和雜蛋白質(zhì)，且在發(fā)酵液中預(yù)先添加硅藻土還可以起到助濾劑的作用，抽濾效果更為理想，但過高的添加量通常會造成抽濾效率的下降和多糖的損失，因此應(yīng)對硅藻土的添加量進(jìn)行考察。 初始發(fā)酵液去除多余CaCO3， 加入3%NaCl，稀釋3 倍后，再加入一定量的硅藻土，充分?jǐn)嚢韬笤龠M(jìn)行抽濾。 由表2 可知，無硅藻土添加時濾液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度已經(jīng)比較低（0.025 g/L），通過硅藻土抽濾基本可以去除發(fā)酵液中的少量蛋白質(zhì)。當(dāng)加入10 g/L 硅藻土后，濾液中菌體和蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度都有一定程度的降低，繼續(xù)加入硅藻土對去除菌體和蛋白質(zhì)并沒有顯著的影響，但是過量硅藻土則會同時吸附多糖，使濾液中多糖的質(zhì)量濃度下降，多糖損失增加。 因此采用10 g/L 的硅藻土預(yù)吸附， 再進(jìn)行抽濾可以有效除去大部分菌體和蛋白質(zhì)，經(jīng)過反復(fù)抽濾三次后，通過對濾液進(jìn)行鏡檢可以發(fā)現(xiàn)無菌體存在， 說明菌體已經(jīng)被完全去除，經(jīng)檢測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度接近零， 多糖回收率可達(dá)76.4%。

2.2 超濾條件的確定

經(jīng)過抽濾所得發(fā)酵液仍含有無機(jī)鹽，殘?zhí)且约耙恍┛扇苄缘男》肿樱?且稀釋造成發(fā)酵液體積過大，采用醇沉法易造成乙醇的損失，增加成本，因此采用超濾的方法代替醇沉法對濾液進(jìn)行濃縮提取。

表2 硅藻土的用量對發(fā)酵液抽濾的影響Table 2 Influence of different concentrations of diatomite onfiltration

2.2.1 不同截留相對分子質(zhì)量膜的膜通量比較在0.1 MPa、25 ℃下用不同截留相對分子質(zhì)量的超濾膜對抽濾得到的濾液進(jìn)行超濾濃縮，比較膜通量的差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。 由圖3（a）可知，相同條件下，不同截留相對分子質(zhì)量的膜對膜通量有較大的影響。 隨著截留相對分子質(zhì)量的增大，膜通量增大，膜通量達(dá)到穩(wěn)定值的時間則越短，截留相對分子質(zhì)量為500 000 的超濾膜在超濾20 min 后，膜通量迅速降低且趨于穩(wěn)定， 這可能是由于500 000 截留相對分子質(zhì)量的濾膜膜孔較大，發(fā)酵液中的多糖分子進(jìn)入膜孔的幾率較高，導(dǎo)致膜孔堵塞從而造成膜通量快速下降； 而對于截留相對分子質(zhì)量為200 000和10 000 的超濾膜，由于膜孔小，大部分大分子被截留在外，膜堵塞的幾率小，故膜通量下降緩慢。

圖3 不同截留相對分子質(zhì)量的膜對超濾的影響Fig. 3 Effect of membranes with different relative molecular weights cut-off on ultrafiltration

測定最終截留液中多糖質(zhì)量濃度可以發(fā)現(xiàn)，截留相對分子質(zhì)量為10 000 和200 000 超濾膜的多糖截留率接近，分別為96.4%和95.8%（圖3（b）），而500 000 的則略有降低（82.2%），對前兩者超濾后的濾液進(jìn)行多糖質(zhì)量濃度檢測，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度基本接近于0， 即10 000 和200 000 的超濾膜能將發(fā)酵液中多糖組分基本截留。 而500 000 超濾膜由于截留相對分子質(zhì)量較大，損失部分多糖。 因此，選取200 000的超濾膜進(jìn)行超濾。

2.2.2 超濾壓力對膜通量的影響超濾壓力增大可以提高膜通量，加快超濾速度，同時也會加速某些組分在膜孔的沉積， 造成膜孔較小甚至堵塞，使膜通量下降，能耗增大，故選擇合適的超濾壓力對超濾過程至關(guān)重要。 由圖4 可以看出，壓力越大，初始膜通量越大，隨著超濾時間的延長，膜通量衰減的越快，當(dāng)超過30 min 時，0.15 MPa 的膜通量接近0.1 MPa 的膜通量，相同的超濾時間內(nèi)，0.05 MPa 膜通量衰減的最慢。 為了使超濾系統(tǒng)在較高的通量下運(yùn)行且考慮到能耗和成本， 選取0.1 MPa 作為超濾壓力較合適。 在此條件下對濾液進(jìn)行超濾，直至濾液中糖質(zhì)量濃度為零且電導(dǎo)率不再變化，最終多糖回收率可達(dá)73.2%。

圖4 超濾壓力對超濾通量的影響Fig. 4 Effect of pressure on ultrafiltration flux

2.3 胞外多糖理化性質(zhì)

將濃縮液透析凍干得到胞外多糖，其性狀為白色絮狀固體，無臭無味，易溶于水，難溶于大部分有機(jī)溶劑。 其將多糖溶于純水，經(jīng)紫外掃描見圖5。 僅在200 和230 nm 有吸收峰，在260 和280 nm 及附近沒有吸收峰，表明多糖中幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。 同時對多糖進(jìn)行熱源檢查，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)毒素含量低于標(biāo)準(zhǔn)限度0.25 EU/mL。

圖5 多糖水溶液的紫外掃描Fig. 5 UV spectrum of exopolysaccharide in pure water

3 結(jié) 語

膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵液粘度較大，菌液分離困難，通過考察NaCl 的添加量、pH、溫度、稀釋倍數(shù)對發(fā)酵液粘度的影響， 發(fā)現(xiàn)將發(fā)酵液加入3%的NaCl 后稀釋3 倍可以有效降低發(fā)酵液粘度，通過在發(fā)酵液中加入10 g/L 的硅藻土作為預(yù)吸附劑，采用硅藻土吸附-抽濾的預(yù)處理方式代替離心能夠有效去除菌體和雜蛋白質(zhì)， 經(jīng)過反復(fù)抽濾3 次后，經(jīng)鏡檢無菌體存在， 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度接近于零，多糖回收率達(dá)76.4%。選用截留相對分子質(zhì)量為200 000的中空纖維膜在0.1 MPa 的操作壓力下進(jìn)行超濾濃縮，基本能夠截留所有多糖組分，通過不斷濃縮除鹽得到最終產(chǎn)品，胞外多糖總回收率達(dá)73.2%，樣品中內(nèi)毒素含量低于0.25 EU/mL。 因此通過硅藻土預(yù)吸附-抽濾方式可以一步除去發(fā)酵液中的菌體和蛋白質(zhì)，同時通過超濾濃縮的方法代替醇沉提取胞外多糖，極大地節(jié)約了成本，此方法簡便經(jīng)濟(jì)，且適合工業(yè)化生產(chǎn)。