滇結(jié)香花提取物組分1（Fr.1）對(duì)C2C12肌細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用

孟照敏， 耿 燕*， 李 恒， 許泓瑜， 許正宏，2， 趙 輝， 劉 敏， 史勁松

（1. 江南大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 無錫2141222；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 江蘇 無錫214122；3. 青藏高原微生物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 西藏 拉薩850000）

胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是Ⅱ型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)性因素，也是引起一系列代謝疾病如冠心病、高脂血癥、高血壓等共同的病理生理基礎(chǔ)[1]。 其主要表現(xiàn)為靶細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性和 （或） 反應(yīng)性降低， 即正常劑量的胰島素（Insulin，Ins） 產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，主要發(fā)生在肝臟、骨骼肌和脂肪組織，在肝臟中通過抑制糖原分解和糖異生來降低肝臟葡萄糖輸出的能力，在脂肪、骨骼肌組織中表現(xiàn)為攝取葡萄糖并將其利用或存儲(chǔ)的能力下降[2-3]。 其中人體80%~90%的葡萄糖消耗和攝取是通過骨骼肌，是葡萄糖代謝過程中最為重要的組織，目前認(rèn)為游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）的蓄積是引起骨骼肌IR 的重要原因[4]，因此選用棕櫚酸（Palmitic acid，PA）誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞建立胰島素抵抗細(xì)胞模型作為體外評(píng)價(jià)手段。

滇 結(jié) 香 花（Edgeworthia gardneri（Wall.） Meisn）屬于瑞香科、結(jié)香屬植物，俗稱綠蘿花，多分布在西藏、云南等地區(qū)，是西藏地區(qū)的民族特色習(xí)用藥材，泡水飲用可治療糖尿病、冠心病、高血壓、高血脂等疾病[5]。 據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，從滇結(jié)香花中分離出的化合物主要有香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類及甾類等，具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、降血糖及降血脂等功效[6-7]。 目前有研究表明，滇結(jié)香花水提物、有機(jī)溶劑提取物在體內(nèi)、 外均具有較好的降血糖活性，因此，利用滇結(jié)香花治療糖尿病具有良好的研究?jī)r(jià)值及應(yīng)用前景。

作者所在課題組前期發(fā)現(xiàn)滇結(jié)香花正己烷提取物在體內(nèi)、外均能有效改善IR，隨后對(duì)其正己烷提取物經(jīng)硅膠柱層析分離得到Fr.1。 以Fr.1 為研究對(duì)象，通過PA 誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞建立胰島素抵抗細(xì)胞模型評(píng)價(jià)其體外降血糖活性， 檢測(cè)IR 相關(guān)信號(hào)通路中基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，探究其作用機(jī)制， 為滇結(jié)香花改善IR 從而治療Ⅱ型糖尿病的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料滇結(jié)香花 （Edgeworthia gardneri（Wall.）Meisn）由西藏月王生物科技有限公司提供，經(jīng)鑒定為瑞香科、結(jié)香屬植物，標(biāo)本保藏于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所[8]；C2C12 成肌細(xì)胞由江南大學(xué)金堅(jiān)教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑高糖DMEM 培養(yǎng)基、 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、馬血清（Horse serum，HS）：購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胰酶-EDTA 消化液、 青霉素-鏈霉素 （100×）、10%SDS、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）：購(gòu)自碧云天公司；牛胰島素：購(gòu)自阿拉丁；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、棕櫚酸（PA）、噻唑藍(lán)（MTT）：購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；2-（N-7-硝基-2，1，3-苯并惡二唑-4-氨基）-2-脫氧-D-葡萄糖（2-NBDG）：購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒：購(gòu)自北京普利萊技術(shù)有限公 司；Trizol、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）、 細(xì) 胞 裂 解 液： 購(gòu) 自 美 國(guó)Roche 公 司；AMPKα、p-AMPKα、ACC、p-ACC、AKT、p-AKT 抗體： 購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司；p-IRs、IRs（Insulin receptors）、p-IRS、IRS-1 （Insulin receptor substrate-1）、Glut4、β-actin 抗 體： 均 購(gòu) 自 英 國(guó)Abcam 公司；其余試劑為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

1.1.3 儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器： 德國(guó)Heidolph 公司；Reveleris iES 中低壓柱層析： 美國(guó)Grace 公司；Multiskan MK3 型熒光酶標(biāo)儀： 德國(guó)Eppendorf 公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱： 美國(guó)Thermo 公司； 倒置顯微鏡：日本Nikon 公司；RT-PCR 儀、化學(xué)發(fā)光成像儀：美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Fr.1 的制備干燥滇結(jié)香花（500 g）粉碎后，按質(zhì)量體積比為1∶10 以正己烷提取， 于60 ℃浸提6 h 后過濾得澄清濾液，濾渣再重復(fù)浸提兩次，合并濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷后得到滇結(jié)香花正己烷提取物15.15 g。利用中低壓柱層析儀分離上述提取物，填料為硅膠，采用正己烷、乙酸乙酯為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速30 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm 和320 nm， 在乙酸乙酯洗脫比例為14%時(shí)收集洗脫峰，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到Fr.1 5.99 g。

1.2.2 C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)、 傳代與分化生長(zhǎng)培養(yǎng)基： 高糖DMEM 培養(yǎng)基+含10%胎牛血清 （FBS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素）。

分化培養(yǎng)基： 高糖DMEM 培養(yǎng)基+含2%馬血清（HS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素）。

培養(yǎng)條件：置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，至80%~90%時(shí)進(jìn)行胰酶消化， 終止消化后加生長(zhǎng)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種傳代。

細(xì)胞分化：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，至80%左右，換為分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5~7 d，隔天換液，C2C12 成肌細(xì)胞90%分化為肌細(xì)胞即多核肌管后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[8]。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)PA 作用C2C12 肌細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活力的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度鋪于96 孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d，隔天換液，待細(xì)胞分化為肌細(xì)胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同濃度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L） 及含1 nmol/L Ins 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，每組6 個(gè)平行，棄去培養(yǎng)液， 每孔加入含0.5 mg/mL MTT 的培養(yǎng)基100 μL孵育4 h， 吸去培養(yǎng)基， 加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩使紫色結(jié)晶溶解，在570 nm 處測(cè)OD值[10]，按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 葡萄糖氧化酶法檢測(cè)PA 誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞產(chǎn)生IR 對(duì)葡萄糖消耗量的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度鋪于96 孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d， 隔天換液，待細(xì)胞分化為肌細(xì)胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同濃度PA （0.25、0.5、0.75、1 mmol/L） 及含1 nmol/L Ins 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h[11]，每組6 個(gè)平行， 取上清培養(yǎng)液按照葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒檢測(cè)葡萄糖含量，分為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管， 分別對(duì)應(yīng)加入5 μL 蒸餾水、5 μL 標(biāo)準(zhǔn)品（10 mmol/L）、5 μL 培養(yǎng)基上清液， 與195 μL 混合試劑（將R1 和R2 按照體積比4∶1 混合）于37 ℃反應(yīng)20 min，在570 nm 處測(cè)OD 值，計(jì)算各組葡萄糖消耗量[12]，確定最佳造模濃度。選用最佳造模濃度分別作用細(xì)胞8、16、24、32 h，每組6 個(gè)平行，取上清培養(yǎng)液檢測(cè)不同作用時(shí)間各組葡萄糖消耗量，與陽性對(duì)照組比較，確定最佳作用時(shí)間，按照公式（2）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 2-NBDG 法檢測(cè)PA 誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞產(chǎn)生IR 對(duì)葡萄糖攝取量的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度鋪于96 孔黑色熒光板，細(xì)胞長(zhǎng)至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d，隔天換液，待細(xì)胞分化為肌細(xì)胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，換含有不同濃度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）的2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，每組6 個(gè)平行，100 nmol/L Ins 作用30 min 后， 每孔加入終濃度為50 μmol/L 的2-NBDG 孵育1 h，DPBS 漂洗細(xì)胞三遍后，換2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm 處測(cè)定熒光值[11]，與陽性對(duì)照組比較，確定最佳作用濃度。 選用最佳造模濃度作用細(xì)胞8、16、24、32 h， 每組6 個(gè)平行，測(cè)定不同時(shí)間的葡萄糖攝取量， 確定最佳作用時(shí)間，按照公式（3）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 MTT 法檢測(cè)Fr.1 作用C2C12 肌細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活力的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度鋪于96 孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，隔天換液，待細(xì)胞分化為肌細(xì)胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同質(zhì)量濃度Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 及含1 nmol/L Ins、0.75 mmol/L PA 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h， 每組6 個(gè)平行，檢測(cè)方法同1.2.3。

1.2.7 葡萄糖氧化酶法檢測(cè)Fr.1 改善C2C12/IR 對(duì)葡萄糖消耗的影響培養(yǎng)方法同1.2.6，檢測(cè)方法同1.2.4。

1.2.8 2-NBDG 法檢測(cè)Fr.1 改善C2C12/IR 對(duì)葡萄糖攝取的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度鋪于96 孔黑色熒光板， 細(xì)胞長(zhǎng)至80%后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，隔天換液，待細(xì)胞分化為肌細(xì)胞后，換含2%BSA 的無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h， 換以含不同質(zhì)量濃度Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 及含0.75 mmol/L PA 的2%BSA 無酚紅高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h， 每組6 個(gè)平行，100 nmol/L Ins 作用30 min 后，檢測(cè)方法同1.2.5。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)IR 相關(guān)基因的表達(dá)采用苯酚抽提法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 采用熒光染料FastStart Universal SYBR Green Master （ROX） 進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，用2-△△t法[12]對(duì)IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量，采用的引物見表1。

1.2.10 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)IR相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)細(xì)胞加藥作用后， 預(yù)冷的DPBS 漂洗細(xì)胞， 每皿加入100 μL 蛋白質(zhì)裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑）， 在冰上裂解30 min，將細(xì)胞刮下收集于1.5 mL 離心管中，12 000g、4 ℃離心10 min， 取蛋白質(zhì)上清液，BCA 試劑盒測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)10%的SDS-PAGE 電泳濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉后，4 ℃過夜孵育一抗，常溫孵育二抗1 h，顯色拍照，通過Image J 軟件分析蛋白質(zhì)條帶， 定量檢測(cè)p-IRs、p-IRS-1[10]、Glut4[13]以及AKT[14]、AMPK[13]信號(hào)通路蛋白質(zhì)的表達(dá)。

表1 IR 相關(guān)基因序列Table 1 Sequences of IR primers

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過One-Way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，p＜0.05，與陽性對(duì)照組相比，極顯著水平表示為***p＜0.001，與模型組相比，極顯著水平表示為###p＜0.001[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞建立胰島素抵抗細(xì)胞模型

組織或細(xì)胞產(chǎn)生IR 會(huì)降低其對(duì)胰島素的敏感性，造成血糖代謝紊亂，所以作者采用檢測(cè)葡萄糖消耗量和攝取量來反應(yīng)IR 的程度。 2-NBDG 是2-脫氧葡萄糖的熒光類似物，通過識(shí)別細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞中，因其無放射性危害，易于檢測(cè)且分辨率高，已廣泛用于糖攝取及糖代謝的研究[11]。

如圖1（a）所示，在無細(xì)胞毒性（0.25～1 mmol/L）的PA 作用濃度范圍內(nèi)， 通過檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗量、葡萄糖攝取量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)選擇建立胰島素抵抗細(xì)胞模型的最佳作用劑量及作用時(shí)間。 如圖1 （B）所示， 與陽性對(duì)照組相比， 不同濃度PA（0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）作用于C2C12 肌細(xì)胞后，0.75 mmol/L PA 組葡萄糖消耗量有極顯著的下調(diào)（***p＜0.001）；采用2-NBDG 法檢測(cè)不同濃度作用下各組葡萄糖攝取量，如圖1（d）所示，0.75 mmol/L PA 誘導(dǎo)肌細(xì)胞后葡萄糖攝取量有顯著的降低（***p＜0.001）。 如圖1（c、e）所示，選擇最佳作用濃度0.75 mmol/L PA與C2C12 肌細(xì)胞共同孵育8、16、24、32 h，與陽性對(duì)照組相比，0.75 mmol/L PA 作用細(xì)胞16 h 后， 其葡萄糖消耗能力及攝取能力大大減弱 （***p＜0.001）；因此，選擇0.75 mmol/L PA 作用C2C12 肌細(xì)胞16 h作為最佳建模條件。

2.2 Fr.1 體外降糖活性評(píng)價(jià)

2.2.1 Fr.1 對(duì)C2C12 肌細(xì)胞活力的影響將不同質(zhì)量濃度的Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL）與C2C12肌細(xì)胞共孵育16 h，利用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。如圖2 所示，F(xiàn)r.1 在低于100 μg/mL 作用質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)C2C12 肌細(xì)胞無明顯毒性， 細(xì)胞存活率均在90%以上。 Fr.1 與Ins（1 nmol/L）、PA（0.75 mmol/L）共同作用細(xì)胞16 h 后， 在100 μg/mL 的Fr.1 作用下，F(xiàn)r.1 對(duì)C2C12 肌細(xì)胞的生長(zhǎng)有12%的抑制率。因此，選擇Fr.1 作用質(zhì)量濃度在12.5～100 μg/mL 時(shí)與C2C12 肌細(xì)胞共孵育16 h 進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.2 Fr.1 對(duì)C2C12/IR 葡萄糖消耗量及攝取量的影響通過檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量及攝取量，考察Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL）的降糖活性。 如圖3 （a） 和3 （b） 所示， 與陽性對(duì)照組相比，0.75 mmol/L PA 誘導(dǎo)后， 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量及攝取量顯著降低（***p＜0.001），而在Fr.1 作用C2C12/IR后顯著提高（###p＜0.001），且具有明顯的劑量依賴關(guān)系，100 μg/mL Fr.1 與模型組相比，葡萄糖消耗量提高64.9%，葡萄糖攝取量提高60.4%。

圖1 C2C12 胰島素抵抗細(xì)胞模型的構(gòu)建Fig. 1 Establishment of insulin resistance cell model in C2C12 cells

圖2 不同質(zhì)量濃度的Fr.1 對(duì)C2C12 肌細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of Fr.1 on cell viability in C2C12 cells

2.3 Fr.1 改善C2C12 肌細(xì)胞IR 作用機(jī)制初步探討

骨骼肌是利用葡萄糖的主要外周組織，葡萄糖進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞需要細(xì)胞膜上的Glut4 直接參與，促進(jìn)Glut4 轉(zhuǎn)運(yùn)從而提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取主要是通過PI3K/AKT 和蛋白激酶AMPK 兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)。 PI3K/AKT 信號(hào)傳導(dǎo)通路的阻滯是外周組織IR 發(fā)生最基本的機(jī)制之一。胰島素在IRs 的介導(dǎo)下，使IRS-1 的酪氨酸磷酸化，通過酪氨酸位點(diǎn)與PI3K 結(jié)合使其下游Akt 磷酸化蛋白增加，促進(jìn)Glut4 轉(zhuǎn)運(yùn)增加其葡萄糖攝取率[15]。AMPK 信號(hào)通路在增加骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取、增強(qiáng)胰島素敏感性、 增加脂肪酸氧化等方面發(fā)揮重要作用。 激活A(yù)MPK 是通過非胰島素途徑促進(jìn)Glut4 的表達(dá)和轉(zhuǎn)位，從而提高骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，進(jìn)一步改善IR[17]。乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）被認(rèn)為是AMPK活化的標(biāo)志，AMPK 可以直接磷酸化ACC 的Ser79位點(diǎn)，從而激活A(yù)MPK 信號(hào)通路[16]。 作者通過對(duì)IR相關(guān)基因及蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)，初步探討Fr.1 改善C2C12 肌細(xì)胞IR 的作用機(jī)制。

2.3.1 Fr.1 對(duì)C2C12 肌細(xì)胞IR 相關(guān)基因表達(dá)的影響采用qRT-PCR 技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)Fr.1 對(duì)PA 誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞產(chǎn)生IR 相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果見圖4。0.75 mmol/L PA 誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞產(chǎn)生IR 后，IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα 轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（***p＜0.001）。 Fr.1（12.5、25、50、100 μg/mL） 作用C2C12/IR 后顯著上調(diào)基因的表達(dá) （###p＜0.001），且具有劑量相關(guān)性。

2.3.2 Fr.1 對(duì)C2C12 肌細(xì)胞IR 相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響通過Western blot 法檢測(cè)在0.75 mmol/L PA的誘導(dǎo)下， 不同質(zhì)量濃度Fr.1 作用于C2C12/IR 后細(xì) 胞 中p-IRs、p-IRS-1、Glut4 及p-AMPKα、p-ACC、p-AKT 的表達(dá)。 如圖5 （a） 所示，PA 作用于C2C12 肌細(xì)胞后相對(duì)于陽性對(duì)照組可顯著降低p-IRs、p-IRS-1 蛋白質(zhì)的表達(dá) （***p＜0.001）， 而50、100 μg/mL 的Fr.1 作用于細(xì)胞后，IRs、IRS 磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著升高（###p＜0.001）；Glut4 是骨骼肌細(xì)胞協(xié)助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白質(zhì)，如圖5（b）所示，C2C12/IR 細(xì)胞Glut4 的表達(dá)顯著下降 （***p＜0.001），與陽性對(duì)照組相比下調(diào)了49.5%，50 μg/mL Fr.1 作用后使Glut4 的表達(dá)上調(diào)54.4%， 從而達(dá)到改善IR 的效果。

圖3 Fr.1對(duì)C2C12/IR葡萄糖消耗及攝取的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of Fr.1 on consumption and uptake of glucose in C2C12/IR

圖4 Fr.1 組分對(duì)IRs、IRS-1、Glut4、PI3K、AMPKα 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of Fr.1 on the expression of IRs、IRS-1、Glut4、PI3K and AMPKα mRNA induced by PA

PA 可以通過抑制AMPK、AKT 的信號(hào)通路從而產(chǎn)生IR 導(dǎo)致糖尿病。 如圖5（c）所示，產(chǎn)生IR 后AMPKα 磷酸化水平明顯下降（***p＜0.001），50、100 μg/mL 的Fr.1 作用于細(xì)胞后，AMPKα、ACC 磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)水平升高（###p＜0.001），表明Fr.1 可以激活A(yù)MPK 信號(hào)通路。 如圖5（d）所示，模型組AKT（Ser473）磷酸化水平下降，給予Fr.1 處理后，明顯提高了AKT （Ser473） 磷酸化蛋白質(zhì)的表達(dá)水平（###p＜0.001）， 說明Fr.1 組分可以激活PI3K/AKT胰島素信號(hào)通路。 綜上所述，F(xiàn)r.1 通過調(diào)控多個(gè)PA誘導(dǎo)的信號(hào)通路中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平改善IR。

3 結(jié) 語

張琨[18]、張曉英[19]等發(fā)現(xiàn)滇結(jié)香花石油醚、乙酸乙酯提取物具有良好的治療糖尿病腎病的療效。 鐘國(guó)躍[20]、Die Gao 等[21]人發(fā)現(xiàn)滇結(jié)香花有機(jī)溶劑提取物通過激活PPAR 靶點(diǎn)作為治療糖尿病的受體激動(dòng)劑。耿燕[22]等研究表明，滇結(jié)香花提取物對(duì)酵母和大鼠來源的α-葡萄糖苷酶均具有較好的體外抑制活性。 Gao 等[23]發(fā)現(xiàn)滇結(jié)香花乙酸乙酯提取物通過調(diào)節(jié)AMPK 信號(hào)通路抑制脂肪細(xì)胞的分化， 從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。王賽[24]等通過建立高脂、高糖大鼠動(dòng)物模型證明滇結(jié)香花具有降血糖、降血脂的功效。 綜合以上研究發(fā)現(xiàn)，滇結(jié)香花有機(jī)溶劑提取物具有良好的降血糖活性，并且這一發(fā)現(xiàn)多數(shù)是利用體外抑制活性篩選模型，目前對(duì)滇結(jié)香花利用細(xì)胞模型評(píng)價(jià)藥效及機(jī)制來改善IR 的研究甚少， 因此對(duì)滇結(jié)香花通過改善IR 達(dá)到治療Ⅱ型糖尿病的研究是非常必要的。

圖5 Fr.1 對(duì)C2C12/IR 細(xì)胞p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、p-ACC、p-AKT 蛋白質(zhì)表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of Fr.1 on expression of p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、p-ACC、p-AKT in C2C12/IR

作者通過PA 誘導(dǎo)C2C12 肌細(xì)胞建立胰島素抵抗細(xì)胞模型，運(yùn)用此模型研究了滇結(jié)香花正己烷提取物Fr.1 的體外降糖活性。 結(jié)果表明，F(xiàn)r.1 可促進(jìn)C2C12/IR 對(duì)葡萄糖的消耗和提高對(duì)葡萄糖的攝取。 通過對(duì)IR 相關(guān)基因及蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Fr.1 可顯著增加胰島素與IRs 結(jié)合來磷酸化IRS-1的酪氨酸位點(diǎn)，從而激活PI3K，PI3K 又激活蛋白激酶AKT，最終激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Glut4。 Fr.1 亦可上調(diào)p-AMPKα 及p-ACC 蛋白質(zhì)的表達(dá)， 從而促進(jìn)Glut4 的轉(zhuǎn)位。Fr.1 通過激活PI3K/AKT 和AMPK 兩條信號(hào)通路增強(qiáng)了細(xì)胞周圍的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)水平，起到改善IR 的效果。

后期需要對(duì)滇結(jié)香花提取物Fr.1 進(jìn)一步分離純化，分析鑒定Fr.1 中主要活性物質(zhì)，同時(shí)結(jié)合體內(nèi)、體外模型， 進(jìn)一步研究其治療Ⅱ型糖尿病的作用機(jī)制，為民族特色習(xí)用藥材治療糖尿病提供理論依據(jù)。