提高產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸工程菌產(chǎn)量的發(fā)酵策略

王曉姣， 楊慧敏， 張震宇， 孫付保， 周 豪

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

反式-4-羥脯氨酸 （trans-4-hydroxyproline，P4H）簡(jiǎn)稱羥脯氨酸，分子式為C5H9NO3，可以與茚三酮反應(yīng)生成黃色溶液[1]。 它易溶于水，微溶于乙醇溶液，呈現(xiàn)出獨(dú)特的甜味。 同時(shí)，P4H 是構(gòu)成膠原蛋白的一種特征性氨基酸，很少存在于普通的蛋白質(zhì)中。P4H 可用于食品、美容、醫(yī)療、化工等多個(gè)領(lǐng)域[2-4]，P4H 的生產(chǎn)得到眾多研究者的關(guān)注。

羥脯氨酸是L-脯氨酸通過脯氨酸羥化酶羥化得到的。 研究者通過脯氨酸羥化酶，使得微生物法生產(chǎn)羥脯氨酸成為了一種可能[5]。 但在該生產(chǎn)過程中，L-脯氨酸作為合成羥脯氨酸的底物， 需要外源添加，這使得羥脯氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)成本增大。 同時(shí)，由于發(fā)酵液終會(huì)殘留L-脯氨酸，增加了羥脯氨酸的分離純化難度。 為了解決這些問題，研究者通過代謝途徑改造、菌株重組等方式實(shí)現(xiàn)了無(wú)外源添加L-脯氨酸生產(chǎn)羥脯氨酸[6-7]。研究前期成功構(gòu)建了一株重組大腸桿菌E.coliJM109ΔargB/pUC19-BH，該菌株含有表達(dá)谷氨酸激酶的突變基因proB2A，突變后的基因解除了L-脯氨酸的反饋抑制作用；同時(shí)，該菌株敲出了精氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶（N-乙酰谷氨酸激酶）基因argB，使得精氨酸合成途徑受阻，是一株精氨酸缺陷型菌株，見圖1。 搖瓶水平下，該菌株在無(wú)外源添加L-脯氨酸的情況下，羥脯氨酸的積累量約為920 mg/L。

圖1 大腸桿菌中羥脯氨酸生物合成途徑Fig. 1 Biosynthetic pathways of P4H in E. coli

利用微生物進(jìn)行生產(chǎn)發(fā)酵的過程中，影響微生物生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物合成的因素非常多，培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度等均需要考慮[8-10]。研究表明，碳源是微生物必需的能源物質(zhì)，常見的碳源種類很多，如葡萄糖、麥芽糖、甘油等，不同菌株對(duì)于碳源的需求不同。 同時(shí)，碳源質(zhì)量濃度過高或過低，均不利于菌體的生長(zhǎng)。 因此，選擇合適的碳源以及恰當(dāng)?shù)奶荚促|(zhì)量濃度是利用微生物進(jìn)行生產(chǎn)的前提。 微生物發(fā)酵過程中另一種必不可少的物質(zhì)是氮源。 氮源質(zhì)量濃度過高，菌體生長(zhǎng)旺盛；氮源質(zhì)量濃度過低，菌體生長(zhǎng)較慢，這均不利于代謝產(chǎn)物的積累與產(chǎn)出。 培養(yǎng)基中的金屬離子對(duì)于菌株的生長(zhǎng)也是極其重要的。脯氨酸羥化酶屬于α-酮戊二酸家族，該家族的酶在作用過程中需要亞鐵離子的參與[5]，亞鐵離子的濃度會(huì)影響該酶的羥化作用。 接種體積分?jǐn)?shù)、 培養(yǎng)基的pH 以及培養(yǎng)溫度等對(duì)于菌株的生長(zhǎng)以及目的蛋白質(zhì)的表達(dá)均是至關(guān)重要的。

重組大腸桿菌的生長(zhǎng)狀況直接關(guān)系到代謝產(chǎn)物生產(chǎn)情況，且工業(yè)化生產(chǎn)多采用高密度發(fā)酵的方法，溶氧是高密度發(fā)酵過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。 研究[11]表明，通過引入透明顫菌血紅蛋白VHB 基因，可以顯著改善重組菌體的生長(zhǎng)狀況和增強(qiáng)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)。 透明顫菌血紅蛋白以氧合態(tài)參與到有關(guān)氧的代謝，在細(xì)胞質(zhì)中，透明顫菌血紅蛋白可以把氧傳遞給呼吸鏈， 提高代謝中氧化磷酸化的效率，進(jìn)而改善低溶氧下的代謝途徑，促進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)[12]。 Khosravi 等[13]將透明顫菌血紅蛋白VHB 基因引入到表達(dá)α-淀粉酶的重組大腸桿菌中，與未引入VHB 基因的菌株相比，α-淀粉酶提高了2.3 倍。因此，可以把VHB 基因引入重組大腸桿菌中，以改善重組菌株的生長(zhǎng)狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)用到的菌株及質(zhì)粒見表1。 其中E. coliJM109 作為宿主，質(zhì)粒pUC19 作為基因表達(dá)載體。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this work

1.1.2 試劑及儀器主要儀器包括PCR 循環(huán)儀、立式高壓蒸汽滅菌鍋、電泳儀、凝膠成像儀、數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、恒溫?fù)u床、分光光度計(jì)、電轉(zhuǎn)儀、冷凍離心機(jī)、發(fā)酵罐等，主要試劑見表2。

表2 主要試劑Table 2 Main Reagents

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件LB 培養(yǎng)基：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L 氯化鈉，pH 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基另加2.0 g/dL 的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：10 g/L 葡萄糖，15 g/L 胰蛋白胨，3 g/L 磷酸氫二鉀，2 g/L 氯化鈉，1 g/L 硫酸鎂，0.015 g/L 氯化鈣，3 mmol/L 硫酸亞鐵。 初始pH 8.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速220 r/min。 氨芐青霉素50 μg/mL。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表3，由上海生工合成。

1.2 重組大腸桿菌的單因素及正交優(yōu)化

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化優(yōu)化過程中除了優(yōu)化的因素，培養(yǎng)基中其他成分與初始培養(yǎng)基保持一致不變。 每組做三個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

表3 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 3 Primers used in this work

1）碳源種類及質(zhì)量濃度的優(yōu)化：分別選擇葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉作為碳源，質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 g/L。

2）氮源種類及質(zhì)量濃度的優(yōu)化：分別選擇胰蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、玉米漿作為氮源，質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 g/L。

3） 離子濃度的優(yōu)化：Fe2+的優(yōu)化濃度分別為0、2、4、6、8 mmol/L，K+的優(yōu)化質(zhì)量濃度分別為0、1.5、3、4.5、6 g/L，Na+的優(yōu)化質(zhì)量濃度分別為0、1、2、3、4 g/L，Mg2+的優(yōu)化質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、1.5、2 g/L，Ca2+的優(yōu)化質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.01、0.015、0.02 g/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交優(yōu)化根據(jù)單因素的優(yōu)化結(jié)果，選擇7 個(gè)因素作為正交試驗(yàn)的考察因素，每個(gè)因素設(shè)3 個(gè)水平，使用L18（37）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

每組做三個(gè)平行，發(fā)酵結(jié)果取平均值。 未選中的因素，以其單因素優(yōu)化后的結(jié)果作為固定值保持不變。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化： 發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 分別調(diào)至5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化篩選；培養(yǎng)溫度的優(yōu)化：培養(yǎng)溫度分別選擇26、28、30、35、37 ℃， 進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化篩選；接種體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化：接種體積分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%和10%，進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化篩選。

1.3 含透明顫菌血紅蛋白基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建

1.3.1 大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)制備方法大腸桿菌化轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備方法參照文獻(xiàn)[14]。

1.3.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法重組大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法采用熱擊法[15]。

1.3.3 含VHB 基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建為了便于基因操作，以透明顫菌血紅蛋白基因?yàn)槟０澹靡颬1、P2 在基因VHB 前后插入酶切位點(diǎn)BamH I 和PstI，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 將擴(kuò)增得到的VHB 基因連接到重組質(zhì)粒pUC19-BH （pUC19-proB2Aptrp2-hyp）上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-proB2A-ptrp2-hyp-VHB（pUC19-BHV），構(gòu)建過程見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pUC19-BHV 的構(gòu)建過程Fig. 2 Construction of recombinant plasmid pUC19-BHV

1.3.4 重組菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)本研究重組菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)條件為：采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，選擇4 L 的裝液量， 控制發(fā)酵過程的pH 為6.5， 設(shè)定轉(zhuǎn)速為400 r/min，設(shè)定通氣量為2 vvm，接種體積分?jǐn)?shù)及發(fā)酵溫度均以優(yōu)化結(jié)果為準(zhǔn)。發(fā)酵12 h 后開始補(bǔ)充碳源，補(bǔ)碳方式為勻速補(bǔ)料，速度為24 g/h，碳源依據(jù)優(yōu)化結(jié)果而定[14-15]。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測(cè)定取適量的發(fā)酵液， 用去離子水稀釋相應(yīng)倍數(shù)，并以去離子水為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（OD600）。

1.4.2 L-脯氨酸的含量測(cè)定L-脯氨酸的檢測(cè)采用酸性茚三酮顯色法[14]：取適量發(fā)酵液進(jìn)行離心，取1 mL 上清液或上清稀釋液于10 mL 試管中； 向每管樣品中加入1 mL 冰醋酸，混勻；再加入1 mL 酸性茚三酮試劑，搖勻，沸水浴1 h；取出試管，加入2 mL 冰醋酸；使用分光光度計(jì)測(cè)定515 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（OD515）。

1.4.3 反式-4-羥脯氨酸積累量的測(cè)定反式-4-羥脯氨酸的檢測(cè)采用氯胺T 法[16]：將發(fā)酵液離心后，取2.5 mL 上清液或上清稀釋液于10 mL 試管中；向每管樣品中加入1 mL 氯胺T，搖勻，室溫靜置20 min；再加入1 mL 顯色劑，搖勻；置于60 ℃水浴鍋中，20 min 后取出冰水冷卻； 使用分光光度計(jì)測(cè)定560 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（OD560）。

1.4.4 脯氨酸羥化酶酶活的測(cè)定反式-4-羥化酶全細(xì)胞酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[14]。1 個(gè)單位酶活被定義為1 min 將1 nmol L-脯氨酸完全轉(zhuǎn)化為羥脯氨酸的酶量，單位為U，全細(xì)胞酶活指的是每毫克干菌體的酶活，單位為U/mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源種類及濃度的優(yōu)化結(jié)果發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源是菌種生命活動(dòng)所需能量的來源，且可以作為菌體構(gòu)成及其代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)。 根據(jù)材料與方法1.2.1， 對(duì)碳源的種類及質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖3。

從圖3 可以看出， 當(dāng)擇麥芽糖作為碳源時(shí)，麥芽糖質(zhì)量濃度為15 g/L 時(shí)，羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值1 019.427 mg/L，高于其他質(zhì)量濃度的碳源。 當(dāng)麥芽糖質(zhì)量濃度低于15 g/L 時(shí)，與同質(zhì)量濃度的葡萄糖相比，羥脯氨酸的產(chǎn)量偏低；但當(dāng)麥芽糖質(zhì)量濃度高于15 g/L 時(shí)， 羥脯氨酸的產(chǎn)量明顯提高，且逐步趨于穩(wěn)定。

圖3 碳源的優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization of different carbon source

研究表明， 培養(yǎng)基中使用甘油作為碳源時(shí)，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸的量明顯低于以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基[17]。根據(jù)1.2.1 對(duì)麥芽糖及甘油的比例進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖4。

圖4 麥芽糖及甘油的比例的優(yōu)化結(jié)果Fig. 4 Optimization of different ratio of carbon sources

從圖4 可以看出，當(dāng)麥芽糖質(zhì)量濃度與甘油質(zhì)量濃度比例為2∶1， 即碳源為10 g/L 麥芽糖、5 g/L甘油時(shí)，羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到1 156.177 mg/L，高于僅以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基。 這說明適量添加甘油作為碳源有利于提高羥脯氨酸的積累量。

2.1.2 氮源種類及濃度的優(yōu)化結(jié)果發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源主要被用于構(gòu)成菌體的細(xì)胞物質(zhì)以及代謝產(chǎn)物。 根據(jù)1.2.1 對(duì)氮源的種類及質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖5。

圖5 氮源的優(yōu)化結(jié)果Fig. 5 Optimization of different nitrogen sources

從圖5 可以看出， 當(dāng)使用胰蛋白胨作為氮源時(shí)，羥脯氨酸的積累量明顯高于其他幾種氮源。 這是由于胰蛋白胨與其他氮源相比， 成分較為復(fù)雜。本研究中的生產(chǎn)菌株為精氨酸缺陷型菌株，胰蛋白胨中含有精氨酸等多種氨基酸，更有益于缺陷型菌株的生長(zhǎng)。 當(dāng)胰蛋白胨的質(zhì)量濃度達(dá)到20 g/L 時(shí)，羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值1 009.633 g/L。 但是，當(dāng)繼續(xù)增大胰蛋白胨的質(zhì)量濃度時(shí)，羥脯氨酸的產(chǎn)量卻有所下降。 可能是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度的胰蛋白胨中存在較多的色氨酸，這會(huì)阻礙色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子的啟動(dòng)，從而抑制羥化酶基因的表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)一步影響羥脯氨酸的產(chǎn)量。

2.1.3 Fe2+濃度的優(yōu)化結(jié)果在脯氨酸羥基化的過程中，只有與亞鐵離子結(jié)合，該酶的活性中心才能發(fā)揮其羥基化作用。 Fe2+在配制過程中容易被氧化，添加一定比例的VC 可能有助于Fe2+發(fā)揮作用。 根據(jù)1.2.1 對(duì)Fe2+的濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖6。

從圖6 可以看出，隨著濃度的增加，無(wú)論是只添加Fe2+還是添加Fe2+：VC 的培養(yǎng)基， 羥脯氨酸產(chǎn)量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)， 這說明Fe2+對(duì)羥化酶發(fā)揮其羥化活性起到了一定作用。 添加Fe2+：VC 的培養(yǎng)基與未添加VC 的培養(yǎng)基相比， 羥脯氨酸產(chǎn)量總是偏高。 VC 有較強(qiáng)的抗氧化作用，VC 的添加可以有效抑制Fe2+的氧化，增強(qiáng)Fe2+的作用。 當(dāng)Fe2+：VC 濃度為6 mmol/L 時(shí)， 羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值1 154.603 mg/L。

2.1.4 其他離子的優(yōu)化結(jié)果微量離子的調(diào)價(jià)對(duì)于菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的代謝至關(guān)重要。如K+可以促進(jìn)L-脯氨酸的攝入量；Na+可用于促進(jìn)L-脯氨酸代謝過程中proP 蛋白的表達(dá)， 利于羥脯氨酸的生產(chǎn)；Mg2+及Ca2+可以有效地促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)， 從而影響產(chǎn)物的合成。 根據(jù)1.2.1 分別對(duì)K+、Na+、Mg2+及Ca2+的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖7。

從圖7 可以看出，K+、Na+、Mg2+及Ca2+的最優(yōu)質(zhì)量濃度分別為3.0、3.0、1.5、0.005 g/L 時(shí)， 羥脯氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值，且優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)生物量與羥脯氨酸產(chǎn)量呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。

圖6 Fe2+的優(yōu)化結(jié)果Fig. 6 Optimization of Fe2+

圖7 K+、Na+、Mg2+及Ca2+的優(yōu)化結(jié)果Fig. 7 Optimization of K+，Na+，Mg2+and Ca2+

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素的優(yōu)化結(jié)果，選擇麥芽糖、甘油、胰蛋 白 胨、K2HPO4、亞 鐵 離 子（Fe2+∶VC=1∶1）、鎂 離 子（Mg2+）、鈉離子（Na+）這七個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。 采用L18（37）正交表試驗(yàn)，正交因素的水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 4 Orthogonal factors of medium optimization

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分對(duì)羥脯氨酸產(chǎn)量的影響主次順序?yàn)镹a+＞胰蛋白胨＞麥芽糖＞K+＞Mg2+＞亞鐵離子＞甘油；各因素的最優(yōu)組合為：G2C3A2D3F3E1B2。正交試驗(yàn)過程中，Ca2+的質(zhì)量濃度保持0.005 g/L。 因此，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：10 g/L 麥 芽 糖、5 g/L 甘 油、22 g/L 胰 蛋 白 胨、4 g/L K2HPO4、5 mmol/L 亞鐵離子 （Fe2+∶VC=1∶1）、1.7 g/L鎂離子（Mg2+）、3 g/L 鈉離子（Na+）、0.005 g/L 鈣離子（Ca2+）， 進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證， 羥脯氨酸產(chǎn)量為1 435.002 mg/L，與優(yōu)化前相比提高了35.978%。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)1.2.3 依次對(duì)培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度以及接種體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化，每?jī)?yōu)化一個(gè)因素，均以優(yōu)化后的結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行下一個(gè)因素的優(yōu)化，結(jié)果見圖8。

初始pH 在5.5~8.5 時(shí)， 菌體的濃度OD600值以及羥脯氨酸積累量均隨著pH 的增大逐漸升高。 當(dāng)pH 高于8.5 時(shí)，OD600及羥脯氨酸的積累量開始下降；培養(yǎng)溫度在30 ℃以下時(shí)，隨溫度升高羥脯氨酸產(chǎn)量逐步提高， 并且30 ℃時(shí)羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大值。 但是，當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，羥脯氨酸產(chǎn)量急劇下降。 可能由于較高較低溫度均不利于脯氨酸羥化酶的表達(dá)；當(dāng)接種體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，羥脯氨酸產(chǎn)量高于其它接種體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵結(jié)果。 然而，當(dāng)接種體積分?jǐn)?shù)大于4%時(shí)， 雖然OD600的值得到提高，但是羥脯氨酸產(chǎn)量卻有所下降。 這可能是由于大量的菌體使得培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更多地用于菌體的生長(zhǎng)，而產(chǎn)物的代謝受到抑制。

最終當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH 為8.5， 培養(yǎng)溫度為30 ℃，接種體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，羥脯氨酸的積累量達(dá)到1 602.787 mg/L， 與優(yōu)化前的918.714 mg/L 相比提高了42.68%。

2.4 含VHB 基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.4.1 透明顫菌血紅蛋白VHB 基因的引入根據(jù)1.3.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-BHV。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證，凝膠電泳的驗(yàn)證結(jié)果見圖9。

泳道1 和泳道2 分別為質(zhì)粒pUC19-BH 及pUC19-BHV 使用BamH I 進(jìn)行單酶切的結(jié)果，獲得單一條帶；泳道3（a）和3（b）分別為質(zhì)粒pUC19-BHV 和pUC19-BH 使用EcoR I 與PstI 進(jìn)行雙酶切的結(jié)果， 顯示有差別的條帶分別是片段ptrp2-hyp-VHB（1 644 bp）和ptrp2-hyp（1 069 bp），在1 700 bp 和1 000 bp 處看到這兩條條帶，這些條帶的大小均與預(yù)期目標(biāo)片段的大小相符。 單酶切和雙酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)DNA 測(cè)序正確，表明重組質(zhì)粒pUC19-BHV 構(gòu)建成功。

表5 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of orthogonal test

2.4.2 重組大腸桿菌JM109ΔargB/pUC19-BHV 的初步發(fā)酵將構(gòu)建好的質(zhì)粒pUC19-BHV 轉(zhuǎn)入缺陷型 菌 株E.coliJM109ΔargB， 獲 得 重 組 菌 株JM109ΔargB/pUC19 -BHV。 以 菌 株JM109ΔargB/pUC19-BH 為對(duì)照組， 在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下進(jìn)行初步發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果見表6。

從表6 可以看出，無(wú)論是OD600、羥脯氨酸產(chǎn)量還是全細(xì)胞酶活， 含有基因VHB 的重組菌株JM109ΔargB/pUC19-BHV 均有提高。 雖然不是很明顯，這可能是由于搖瓶發(fā)酵過程的缺氧情況并不明顯，透明顫菌血紅蛋白基因在缺氧的情況下才開始作用。 同時(shí)， 也可能由于培養(yǎng)基是針對(duì)菌株JM109ΔargB/pUC19 -BH 進(jìn) 行 優(yōu) 化 的， 菌 株JM109ΔargB/pUC19-BHV 并不能表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

2.4.3 重組大腸桿菌JM109ΔargB/pUC19-BH 及JM109ΔargB/pUC19-BHV 的擴(kuò)大培養(yǎng)為了進(jìn)一步說明基因VHB 的作用， 參照1.3.2 對(duì)菌株JM109ΔargB/pUC19 -BH 及 JM109ΔargB/pUC19 -BHV 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，探究7 L 罐中兩株重組菌的生長(zhǎng)及代謝情況，結(jié)果見圖10。

圖8 初始pH、培養(yǎng)溫度以及接種體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化Fig. 8 Optimization of different pH，different temperature and different inoculation

圖9 重組質(zhì)粒pUC19-BHV 的酶切驗(yàn)證Fig. 9 Digestion verification of recombinant plasmid pUC19-BHV

表6 重組大腸桿菌株羥脯氨酸的產(chǎn)量Table 6 Production of P4H of recombinant E. coli

由圖10 可知， 與不含VHB 基因的菌株相比，含有VHB 基因的重組菌株菌體生長(zhǎng)更為旺盛，且羥脯氨酸產(chǎn)量也相對(duì)較高。 發(fā)酵0~12 h 的過程中，兩株重組菌的菌體生長(zhǎng)速度幾乎相同，且羥脯氨酸的積累量非常相近。發(fā)酵12~24 h 的過程中，菌體生長(zhǎng)速度略有下降，可能是此時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中原有的碳源已被耗盡，而用于補(bǔ)料的碳源還不能滿足菌體生長(zhǎng)及代謝的需求， 此時(shí)含有VHB 基因的重組菌株的羥脯氨酸積累量略高。 發(fā)酵24 h 后，兩株重組菌開始表現(xiàn)出差異， 含有VHB 基因的重組菌株的羥脯氨酸合成速率明顯高于另一株重組菌。 發(fā)酵44 h 后， 含有VHB 基因的重組菌株進(jìn)一步展現(xiàn)出它在生長(zhǎng)方面的優(yōu)勢(shì)。 高密度發(fā)酵的過程中，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，溶氧開始降低，基因VHB 在低溶氧下顯示出優(yōu)勢(shì)。 發(fā)酵60 h， 重組菌株JM109ΔargB/pUC19-BH 的羥脯氨酸積累量達(dá)到15.894 g/L，而菌株JM109ΔargB/pUC19-BHV 在發(fā)酵56 h 時(shí)羥脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到18.312 g/L，相比提高了13.2%。

圖10 JM109ΔargB/pUC19-BH 與JM109ΔargB/pUC19-BHV 的發(fā)酵曲線Fig. 10 Fermentation process curve of recombinant E.coli JM109ΔargB/pUC19 -BH and E. coli JM109ΔargB/pUC19-BHV

3 結(jié) 語(yǔ)

在無(wú)外源添加L-脯氨酸的條件下，作者通過單因素優(yōu)化及正交優(yōu)化，獲得了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件。 當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基組分為10 g/L 麥芽糖、5 g/L 甘油、22 g/L 胰蛋白胨、5 mmol/L 亞鐵離子（Fe2+∶Vc=1∶1）、4 g/L K2HPO4、3 g/L 鈉離子（Na+）、1.7 g/L 鎂離子（Mg2+）、0.005 g/L 鈣離子（Ca2+），初始pH 為8.5，培養(yǎng)溫度為30 ℃，接種體積分?jǐn)?shù)為4%，轉(zhuǎn)速為220 r/min 時(shí)， 發(fā)酵24 h， 重組大腸桿菌JM109ΔargB/pUC19-BH 反式-4-羥脯氨酸的積累量達(dá)到1 602.787 mg/L， 與優(yōu)化前相比提高了約42.68%。 結(jié)果表明，合適的培養(yǎng)基組成以及培養(yǎng)條件更有利于菌株的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的生成，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)來說非常有必要。

在進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件優(yōu)化的過程中， 我們發(fā)現(xiàn)重組菌的羥脯氨酸產(chǎn)量與菌濃OD600的值呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，因此，可以通過增加菌濃OD600的值進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)羥脯氨酸產(chǎn)量的提高。透明顫菌血紅蛋白可以以氧合態(tài)參與到與氧有關(guān)的代謝，在細(xì)胞質(zhì)中，該蛋白質(zhì)可以把氧傳遞給呼吸鏈，提高氧化磷酸化的效率，改善低溶氧下的代謝活動(dòng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)。 本研究將透明顫菌血紅蛋白VHB 基因連接到重組質(zhì)粒上進(jìn)行表達(dá)，在7 L罐擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)， 含有VHB 基因的重組菌株JM109ΔargB/pUC19 -BHV 羥 脯 氨 酸 產(chǎn) 量 約 為18.312 g/L， 與不含基因VHB 的菌株相比提高了13.2%。 結(jié)果表明，基因VHB 的引入可以改善菌體的生長(zhǎng)狀況和增強(qiáng)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)。

本研究構(gòu)建的重組菌株可以實(shí)現(xiàn)無(wú)外源L-脯氨酸添加生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸， 且會(huì)在菌株高密度發(fā)酵過程中表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。 利用該菌株進(jìn)行羥脯氨酸的生產(chǎn)，羥脯氨酸的得率較高，且后期分離純化更為簡(jiǎn)單，這使得微生物法生產(chǎn)羥脯氨酸展現(xiàn)出更多的優(yōu)勢(shì)。