基于角質酶共表達策略的大腸桿菌胞外生產耐高溫α-淀粉酶及其發(fā)酵條件優(yōu)化

李 祝， 段緒果，2， 宿玲恰，2， 吳 敬*，2

（1． 食品科學與技術國家重點實驗室， 江南大學， 江蘇 無錫214122； 2． 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫214122）

耐高溫α-淀粉酶由于其優(yōu)良的熱穩(wěn)定性而被廣泛的應用于啤酒、酒精、氨基酸及淀粉等工業(yè)領域[1]。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）α-淀粉酶（BLA） 在pH 6~7 之間具有較好的熱穩(wěn)定性， 而當pH 在6 以下時，BLA 的熱穩(wěn)定性將明顯降低，并且催化效率也將受到抑制，不能滿足酸性條件下淀粉原料深加工工藝的要求。 在前期工作中，我們通過分子改造的手段提高了BLA 在95 ℃、pH 5.5 條件下的熱穩(wěn)定性， 同時突變體的催化效率也得到提升，該突變體具有潛在的應用價值[2]。

大腸桿菌由于遺傳背景清晰、 培養(yǎng)成本低廉、能進行高密度發(fā)酵等優(yōu)勢，已被廣泛應用于重組蛋白質的表達及生產[3]。 相較于胞內表達，胞外表達重組蛋白質具有很多優(yōu)勢，例如：胞外表達可以提高重組蛋白質的穩(wěn)定性和生物活性，并且胞外表達更加適合工業(yè)生產[4-5]。 作者所在實驗室的前期工作中發(fā)現，來源于嗜熱放線菌（Thermobifida fusca）角質酶具有一定的磷脂酶水解活力，可以適量水解大腸桿菌細胞膜上的磷脂成分，從而增強大腸桿菌細胞膜透性，進而提高重組蛋白質的胞外表達效率[5]。 在前期工作中，重組大腸桿菌表達BLA 的3 L 罐發(fā)酵研究表明，發(fā)酵上清液中重組BLA 的分泌比例僅為53%，大量的重組蛋白質仍然殘留在細胞內。為了實現BLA 的胞外高效表達，作者嘗試采用在大腸桿菌中同時表達角質酶與BLA 的方式來提高大腸桿菌細胞膜透性，從而提高BLA 胞外分泌效率。 隨后對影響大腸桿菌產酶的誘導條件進行優(yōu)化， 以提高BLA 的產量。

pETDuet-1 載體被設計用來在大腸桿菌中同時表達兩個外源基因， 該載體含有兩個多克隆位點，并且每個多克隆位點是通過T7 啟動子、Lac 操縱子和一個核糖體結合位點組成。 因此本研究將采用該載體在大腸桿菌中同時表達BLA 和角質酶基因。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

含有突變后Bacillus licheniformisα-淀粉酶基因的Escherichia coliBL21 （DE3）/pET20b-amy菌株： 由作者所在實驗室構建并保藏；E. coliJM109、E. coliBL21（DE3）菌株及含有角質酶基因的共表達載體pETDuet-cutinase：均由作者所在實驗室保藏。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

限制性內切酶NcoI 和HindIII、 堿性磷酸酶（CIAP）、瓊脂糖和標準核酸相對分子質量：均購自大連寶生物工程有限公司；質粒小提試劑盒和DNA回收試劑盒：購自田根生化科技有限公司；蛋白質標準相對分子質量和蛋白質電泳試劑盒：購自上海碧云天生物科技有限公司； 異丙基-β-D-硫代半乳糖 苷 （Isopropyl β -D -1 -Thiogalactopyranoside，IPTG）、 氨芐青霉素 （Ampicillin，Amp）、 卡那霉素（Kanamycin，Kan）： 購自上海生物工程股份有限公司；酵母粉和蛋白胨：均購自英國Oxiod 公司；其他試劑：均為國產分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

LB 種子培養(yǎng)基（g/L）： 蛋白胨10， 酵母粉5，NaCl 10；搖瓶TB 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24， 甘油5， 磷酸氫二鉀2.34， 磷酸二氫鉀16.43；3 L 罐 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 （g/L）：（NH4）2HPO44，KH2PO413.5，MgSO4·7H2O 1.38，一水合檸檬酸1.7，蛋白胨1，酵母粉2，甘油8，微量元素液10 mL/L；3 L罐補料培養(yǎng)基（g/L）：甘油600，MgSO4·7H2O 15，蛋白胨2，酵母粉4；3 L 罐誘導培養(yǎng)基（g/L）：乳糖60；微 量 元 素 液 （g/L）：（NH4）6Mo7O240.1，CaCl22.0，MnSO4·4H2O 0.5，FeSO4·7H2O 10.0，CuSO4·5H2O 3.0，ZnSO4·7H2O 5.3，Na2B4O7·10H2O 0.2。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 搖瓶培養(yǎng)將重組菌接種至含有相應抗性的種子培養(yǎng)基中， 在37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)8 h，以5%的接種體積分數接種至含有相應抗性的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)至菌體濃度OD600達1.0 時， 加入終濃度為0.02 mmol/L IPTG，隨后將搖瓶至于25 ℃、200 r/min 條件下繼續(xù)培養(yǎng)40 h 至發(fā)酵結束。

1.3.2 3 L 罐培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基以10%的接種體積分數接種至3 L 發(fā)酵罐中 （Labfors 5，Infors-HT Co.，Ltd）。 在3 L 罐上的發(fā)酵周期可分為3 個階段。在第一階段中，控制發(fā)酵溫度為37 °C，隨著發(fā)酵時間的進行， 發(fā)酵液中的甘油質量濃度和pH 會逐步降低， 當發(fā)酵液中的pH 和溶解氧（DO）突然升高時，此時培養(yǎng)基中的甘油耗盡，發(fā)酵進入第二階段。 在此階段中，需將補料培養(yǎng)基逐步加入至3 L 罐中，以滿足菌體的生長需求。 當OD600達到15 時， 一次性加入終質量濃度為10 g/L 的甘氨酸。當OD600為50 時，降低發(fā)酵溫度至32 ℃，同時加入誘導培養(yǎng)基以誘導重組蛋白質的表達，此時發(fā)酵進入第三階段，即誘導階段。 在此階段中，隨著誘導劑的添加，發(fā)酵液中重組蛋白質逐漸積累。 整個發(fā)酵過程中， 通過轉速和通氣量控制發(fā)酵液中的DO 為30%，通過氨水的添加控制發(fā)酵液中的pH 為7.0。

1.4 方法

1.4.1 共表達BLA 和角質酶載體和菌株的構建分別用限制性內切酶NcoI 和HindIII 同時對質粒pET20b-amy 和pETDuet-cutinase 進行雙酶切，用DNA 膠回收試劑盒回收相應的基因片段，然后將淀粉酶基因amy 和含有角質酶基因的共表達載體pETDuet-cutinase 用T4 連接酶在16 ℃連接過夜。將連接產物轉化E. coliJM109 并涂布至含有Kan抗性的LB 平板上， 挑取陽性克隆至含有Kan 抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，抽提質粒，經NcoI 和HindIII雙酶切驗證正確的重組質粒送至測序公司進行基因測序。 將測序正確的質粒轉化表達宿主E. coliBL21（DE3），構建能共表達BLA 和角質酶的重組菌株E. coliBL21（DE3）/ pETDuet-cutinase-amy。

1.4.2 菌體濃度的測定吸取一定量的發(fā)酵液，將發(fā)酵液用去離子水稀釋至適當的倍數，使得稀釋液在600 nm 下的吸光值在0.2~0.8 之間， 菌體濃度OD600則為吸光值乘以稀釋倍數。

1.4.3 酶活力的測定吸取一定量的發(fā)酵液， 在12 000 r/min、4 ℃下離心5 min， 吸取離心后的上清液， 測量上清液中的重組α-淀粉酶活力即為胞外α-淀粉酶活力。 吸取一定量的發(fā)酵液， 將發(fā)酵液用20 mmol/L、 pH 6.0 的磷酸緩沖液稀釋菌體濃度OD600至5.0， 將稀釋后的發(fā)酵液采用超聲破壁的方法破碎細胞， 隨后將經過超聲破壁的發(fā)酵液在12 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，吸取離心后的上清液， 此上清液中所含的α-淀粉酶活力即為總α-淀粉酶活力。

α-淀粉酶酶活力測定的條件為：底物為1 mL 1%的可溶性淀粉，加入0.9 mL 的磷酸緩沖液（pH 6.0、20 mmol/L） 混勻， 置于70 ℃恒溫水浴鍋中預熱3 min，加入100 μL 稀釋好的酶液，在70 ℃下反應5 min，之后向反應體系中加入3 mL DNS 溶液終止反應。將反應體系置于100 ℃下處理7 min 后，立刻將反應體系放入冰水中降溫。 隨后將體系定容至15 mL，在540 nm 下測定吸光值，計算酶活力。 用DNS法[6]制作標準曲線時所用的還原糖為葡萄糖。 在分析條件下，α-淀粉酶每分鐘降解淀粉生成1 μmol的還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位。 角質酶活力的測定參照文獻[5]。

1.4.4 蛋白質濃度的測定和SDS-PAGE 分析以牛血清蛋白質為標準蛋白樣品制作標準曲線，采用Bradford 方法測定樣品中蛋白質質量濃度[7]。聚丙烯酰胺凝膠電泳膠的制備采用碧云天蛋白電泳試劑盒進行操作，分離膠質量濃度12 g/dL，濃縮膠質量濃度5 g/dL。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建

將含有α-淀粉酶基因的重組質粒pET20bamy和含有角質酶基因的重組質粒pETDuetcutinase用NcoI 和HindIII 進行雙酶切，膠回收相應的目的基因并將其進行連接， 連接產物轉化E. coliJM109，挑取單克隆提取質粒用Nco I 和Hind III 雙酶切驗證，結果見圖1。 瓊脂糖凝膠電泳顯示約為6 084 bp 和1 443 bp 的兩條片段， 說明同時含有α-淀粉酶基因和角質酶基因的重組質粒構建成功，命名為pETDuet-cutinase-amy。

2.2 共表達菌株和單表達菌株的發(fā)酵對比

將構建好的重組質粒pETDuet-cutinase-amy轉化E. coliBL21 （DE3） 構建共表達菌株E. coliBL21（DE3）/pETDuet-cutinase-amy。 首先在搖瓶水平上對共表達菌株和單表達菌株的發(fā)酵產酶情況進行對比，結果見圖2。 從圖2（a）可以看出，在相同的培養(yǎng)條件下，兩種菌株的菌體生長趨勢相似。 隨著發(fā)酵的進行，兩種菌株的胞外α-淀粉酶活力逐漸升高。當發(fā)酵至28 h 時，共表達菌株的胞外α-淀粉酶活力達到最高，為2.21×103U/mL。 而單表達菌株的胞外α-淀粉酶活力在40 h 達到最大， 為2.14×103U/mL。盡管兩種菌株所產胞外α-淀粉酶活力相差不大， 但共表達菌株在單位時間內產酶量更大，生產強度更高，具有一定的優(yōu)勢。

進一步在3 L 發(fā)酵罐水平上對比兩種菌株的生長和產酶情況，采用37 ℃生長、32 ℃誘導，乳糖的誘導強度為0.2 g/（L·h），結果見圖3。共表達菌株和單表達菌株在3 L 罐中的生長趨勢相似， 可能由于同時表達兩種外源蛋白質對菌體代謝有細微影響，共表達菌株的最高菌濃比單表達菌株的稍低（圖3（a））。 盡管如此，共表達菌株和單表達菌株的胞外酶活力有著較大的區(qū)別。 從圖3（b）可以看出，共表達菌株的胞外α-淀粉酶活力在44 h 達到最高，為2.87×104U/mL。 而單表達菌株的最高胞外α-淀粉酶活力為1.69×104U/mL（47 h）。 共表達菌株胞外最高α-淀粉酶活力為單表達菌株的1.7 倍。 從發(fā)酵總酶活的數據可知，共表達菌株的總酶活也比單表達菌株的高（圖3（c））。 因此，共表達菌株在產酶方面比單表達菌更加具有工業(yè)應用前景。 為了更大限度的提高胞外α-淀粉酶的產量，作者對影響大腸桿菌產酶的因素進行優(yōu)化。

2.3 誘導溫度對共表達菌株產酶的影響

誘導溫度對大腸桿菌表達外源蛋白質有著重要的影響[8-9]。 一般來說，較低的誘導溫度有利于抑制包涵體的生成，從而提高具有生物活性外源蛋白質的產量[10]。 為了優(yōu)化誘導溫度，作者在25、32、37℃三種誘導溫度條件下檢測共表達菌株生長和產酶的情況。從圖4 可以看出，誘導溫度為37 ℃時，菌株的生長情況最好， 在此條件下菌體濃度OD600最高為116.1。然而，在此條件下的最高胞外α-淀粉酶和總α-淀粉酶活力均為三個溫度條件下的最低值（1.50×104、2.86×104U/mL）。 當誘導溫度為32 ℃時，此時的胞外和總α-淀粉酶活力均為最高 （2.87×104、5.47×104U/mL）， 分別為在25 ℃誘導時的1.43和1.44 倍。在25 ℃條件下誘導時，較低的誘導溫度可能導致外源蛋白合成速率降低，從而導致重組α-淀粉酶活力減少。 因此，選取32 ℃為共表達菌株的最適誘導溫度。

圖3 共表達菌株和單表達菌株在3 L 罐上的發(fā)酵趨勢對比圖Fig. 3 Comparison of time profiles for fermentation in 3 L fermentor between co -expression system and individual expression system

圖4 不同誘導溫度條件下共表達菌株的發(fā)酵過程曲線圖Fig. 4 Comparison of time profiles for fermentation of co-expression system under different temperatures

2.4 乳糖誘導強度對共表達菌株產酶的影響

充足的誘導強度是大腸桿菌表達過量重組的必要條件[10]。然而，誘導劑的添加必須兼顧菌體的生長和重組蛋白質的合成，防止生成大量的包涵體[11]。作者將對乳糖的誘導強度進行優(yōu)化，乳糖添加速率分別在1.0、0.5、0.2 g/（L·h）的條件下檢測共表達菌株的生長及產酶的情況，結果見圖5。當乳糖的誘導強度為1.0 g/（L·h）時，此時菌體的最終濃度OD600為94.6，隨著誘導強度的降低，菌體的最終濃度逐漸升高，這可能是由于高誘導強度對菌體的生長代謝有壓力，從而抑制了菌體的生長。 在乳糖誘導強度為1.0 g/（L·h）時，菌體產酶受到明顯的抑制，α-淀粉酶總酶活及胞外酶活均為最低。 當乳糖的誘導強度為0.5 g/（L·h）時，此時的α-淀粉酶活力有著明顯的提升，在此條件下，最高α-淀粉酶總活力和胞外α-淀粉酶活力分別達到9.70×104、5.17×104U/mL，胞外酶活占總酶活的比例為53.3%。 隨著誘導強度的進一步降低，共表達菌株所產α-淀粉酶活力有所下降。 因此，選取乳糖誘導強度為0.5 g/（L·h）。

圖5 不同乳糖誘導強度下共表達菌株的發(fā)酵過程曲線圖Fig. 5 Comparison of time profiles for fermentation of co-expression system under different lactose concentrations

2.5 IPTG 和乳糖同時誘導提高共表達菌株胞外α-淀粉酶產量

由于穩(wěn)定期的大腸桿菌細胞膜將變得更加的剛性[12]，并不適合大腸桿菌將重組蛋白質分泌至胞外。 因此，在穩(wěn)定期前過量表達角質酶，盡可能多的水解細胞膜上的磷脂，從而提高膜透性，可能對提高胞外α-淀粉酶活力有促進作用。 誘導劑IPTG 相對于乳糖能更快的進入大腸桿菌細胞內誘導重組蛋白質的表達[13]。因此，作者在誘導前期添加不同濃度的IPTG 來加強角質酶的表達，同時持續(xù)添加0.5 g/（L·h）乳糖來保證誘導強度。

圖6 顯示，在0.1、0.15、0.2 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖誘導時，共表達菌株的最高菌濃分別為112.5、107.1、96.4 g/L。在兩種誘導劑共同的作用下，共表達菌株的胞外α-淀粉酶活力比單獨誘導時有著明顯的增加。 在0.1 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖的誘導條件下，發(fā)酵進行31 h 時，胞外α-淀粉酶活力最高可達3.97×104U/mL。 當IPTG 的濃度增加至0.15 μmol/L 時，胞外α-淀粉酶活力在發(fā)酵32 h 時達到6.05×104U/mL，此時目的蛋白質質量濃度為8.92 g/L。隨后繼續(xù)提高IPTG 的濃度并不能促進胞外α-淀粉酶活力的提升。 蛋白質電泳顯示，隨著發(fā)酵的進行，胞外BLA 逐漸積累，見圖7。 與總酶活的數據對比可知，IPTG 和乳糖共同誘導時，胞外α-淀粉酶活力占總酶活的比例有著較大的提升。 在0.1、0.15、0.2 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h） 乳糖誘導時的胞外分泌比例分別為88.6%、93.2%和88.4%，見表1。

圖6 不同濃度IPTG 結合0.5 g/（L·h） 乳糖誘導條件下的共表達菌株發(fā)酵過程曲線圖Fig. 6 Comparison of time profiles for fermentation of co -expression system under different IPTG concentrations and 0.5 g/（L·h） lactose

圖7 共表達菌株3 L 發(fā)酵罐發(fā)酵過程中胞外上清液SDSPAGE 蛋白質電泳圖Fig. 7 SDS-PAGE analysis of extracellular α-amylase and cutinase in E. coli C induced with 0.15 μmol/L IPTG and 0.5 g/(L·h) lactose

表1 共表達菌株在不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵數據對比表Table 1 Comparison of parameters for recombinant α-amylase production in E. coli C in fermenter

為了驗證IPTG 的添加有助于提高角質酶的表達， 作者在0.5 g/（L·h） 乳糖誘導和0.15 μmol/L IPTG 與0.5 g/（L·h）乳糖共同誘導時的角質酶總酶活進行測定， 結果見圖8。 從圖8 可以看出， 當在0.15 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖共同誘導條件下，角質酶的最高酶活力為300 U/mL（34 h）。 而在0.5 g/（L·h）乳糖誘導時，角質酶在相同發(fā)酵時間下的酶活力為53 U/mL（34 h），僅為IPTG 和乳糖共同誘導時的17.6%， 并且在此條件下的最高角質酶活力為170 U/mL。而角質酶酶活的提高可能更多的水解大腸桿菌細胞膜上磷脂， 從而增加細胞膜透性，進而提高BLA 的分泌效率。

3 討 論

地衣芽孢桿菌來源的耐高溫α-淀粉酶在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母等表達宿主中的重組表達均有研究，然而國內的大部分研究主要集中在重組蛋白質的性質研究和重組菌的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化[14-16]。本研究將經過分子改造的來源于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因與嗜熱放線菌角質酶基因在E.coliBL21（DE3） 中進行共表達， 構建了共表達菌株E. coliBL21（DE3）/pETDuet-cutinase-amy，并將共表達菌株與單獨表達α-淀粉酶菌株Escherichia coliBL21（DE3）/pET20b-amy進行搖瓶和3 L 罐的初步發(fā)酵對比。 結果顯示，共表達菌株在胞外表達重組α-淀粉酶具有明顯的優(yōu)勢。 盡管同時表達兩種外源蛋白質對大腸桿菌宿主的代謝產生更高的壓力，但是角質酶的表達可以增加大腸桿菌細胞膜透性，從而使得重組蛋白質更加高效的分泌至胞外，減少細胞內重組蛋白質的過量積累。 這種情況下可能進而減少包涵體的形成，從而提高具有活性外源蛋白質的產量[4]。因此，大腸桿菌內BLA 與角質酶的共表達可以提高BLA 的產量。 隨后，作者對影響大腸桿菌表達重組蛋白質的因素進行優(yōu)化。 在優(yōu)化誘導溫度的研究中發(fā)現，37 ℃條件下對共表達菌株的生長有益，然而在此條件下有活性的重組α-淀粉酶卻很少，這可能是由于在較高溫度時， 重組蛋白質快速表達，大部分重組蛋白質來不及折疊而生成大量的包涵體[17]。 在25 ℃低溫條件下，雖然低溫有利于重組蛋白質的折疊，然而低溫不利于重組蛋白質的快速表達[18]。 32 ℃下可以兼顧重組蛋白質的合成速率和折疊效率，從而提高有活性重組α-淀粉酶的表達量。

合適的誘導強度是過量表達重組蛋白質的必要條件[19]。在乳糖誘導強度的優(yōu)化中發(fā)現，在持續(xù)添加0.5 g/(L·h)乳糖時，共表達菌株發(fā)酵產生的總α-淀粉酶活力和胞外α-淀粉酶活力均最高。盡管在此條件下的胞外α-淀粉酶活力比未優(yōu)化前有著較大程度的提高，然而胞外α-淀粉酶活力僅占總活力的53.3%，細胞內仍有大量的重組α-淀粉酶未分泌至胞外。IPTG 和乳糖均可以通過乳糖啟動子誘導重組蛋白質的表達[20]。IPTG 可以直接進入大腸桿菌細胞內，并直接結合到lac 阻遏蛋白，使得外源蛋白質表達[21]。 而乳糖首先需要在lac 透性酶的幫助下進入大腸桿菌細胞內，隨后在β-半乳糖苷酶的作用下轉變成異乳糖， 進而結合lac 阻遏蛋白以誘導外源蛋白質的表達[12]。 因此，相較于乳糖，IPTG 可以迅速誘導大腸桿菌外源蛋白質表達。 當在開始誘導階段添加一定濃度的IPTG 并持續(xù)添加乳糖， 共表達菌株中的重組α-淀粉酶和重組角質酶都得到迅速表達。由于角質酶具有一定的磷脂酶活性，角質酶的快速表達可以更好的破壞大腸桿菌細胞膜，從而增強大腸桿菌細胞膜透性，提高胞外α-淀粉酶活力。

圖8 在不同誘導條件下角質酶總活力的對比圖Fig. 8 Comparison of the time profiles for total cutinase activity induced with 0.5 g/（L·h） lactose，0.15 μmol/L IPTG and 0.5 g/（L·h） lactose in E. coli C

4 結 語

構建了能同時表達α-淀粉酶和角質酶的重組菌E. coliBL21（DE3）/pETDuet-cutinase-amy，在與單獨表達α-淀粉酶的重組菌E. coliBL21（DE3）/pET20b-amy的搖瓶和3 L 罐的初步發(fā)酵對比可知，共表達菌株在胞外表達重組α-淀粉酶有著明顯的優(yōu)勢。 對共表達菌株的誘導條件進行優(yōu)化，結果顯示， 在誘導溫度為32 ℃， 誘導劑為0.15 μmol/L IPTG 和0.5 g/（L·h）乳糖共同誘導時，胞外α-淀粉酶活力可達6.05×104U/mL， 胞外α-淀粉酶蛋白質質量濃度為8.92 g/L，胞外分泌比例為93.2%，實現了重組α-淀粉酶的胞外過量表達，在工業(yè)生產上具有較好的應用前景。