發(fā)酵醬油中生物胺的產(chǎn)生及其控制研究進展

何一龍，劉曉艷 *，錢 敏，白衛(wèi)東，黃漢聰

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點實驗室，廣東 廣州 510225；3.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225；4.廣州市如豐果子調(diào)味食品有限公司，廣東 廣州 510300）

醬油（soy sauce）又稱豉油，由“醬”演化而來，經(jīng)過三千多年的發(fā)展，醬油早已成為日常烹飪過程中必不可少的調(diào)味品，并遠傳日本、韓國和東南亞一帶[1]。醬油一般都要經(jīng)過選料、蒸煮、曲霉菌制曲、下缸發(fā)酵和成熟出缸等階段[2]，在發(fā)酵過程中曲霉釋放大量蛋白酶，能夠促進原料中蛋白質(zhì)水解，并產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸[3]，小分子肽中多為特征滋味肽，有學(xué)者認為這些游離滋味肽和氨基酸一起賦予醬油獨特的鮮味[4-6]。曲霉等微生物釋放蛋白酶的同時也會代謝出其他酶，其中氨基酸脫羧酶能將游離氨基酸脫去羧基形成具有一定安全風(fēng)險的生物胺（biogenic amines，BAs）。醬油在發(fā)酵過程中很容易產(chǎn)生BAs，導(dǎo)致醬油潛在的不安全性。BAs是一類具有生物活性的低分子生物堿，廣泛存在于自然界中[7]，主要有脂肪族（腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等）、芳香族（酪胺、苯乙胺等）和雜環(huán)族（組胺、色胺等）三大類[8]。食品中的BAs有內(nèi)源性和外源性兩條產(chǎn)生途徑，內(nèi)源性BAs主要由原料自身代謝產(chǎn)生，并承擔(dān)部分生命活動，該途徑多出現(xiàn)在非發(fā)酵食品及其原料中[9]。近年來人們更加關(guān)注外源性BAs，特別是微生物發(fā)酵食品。其含量往往與原料中蛋白含量有關(guān)，蛋白含量越高，發(fā)酵制品中檢測到的各BAs含量也會越高[10]。

發(fā)酵類食品中的BAs主要有酪胺、β-苯乙胺、亞精胺、精胺、腐胺、尸胺、組胺、色胺、五羥基色胺和胍基丁胺等，由前體物質(zhì)酪氨酸、β-苯乙氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸、五羥基色氨酸脫羧而來[11]。通常人類攝入微量BAs不會對人體產(chǎn)生毒副作用，但在體內(nèi)積累到一定程度時就會產(chǎn)生毒害作用（如外部血管膨脹導(dǎo)致高血壓和頭痛，以及腸道平滑肌的收縮造成腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等）。BAs引起的食品安全問題，也就是BAs的毒性作用[12]。LINARES D M等[13]經(jīng)過體外細胞毒性試驗（HT29腸道細胞），發(fā)現(xiàn)酪胺比組胺對細胞的毒害作用更強更快，組胺誘導(dǎo)細胞凋亡，酪胺使細胞壞死。近年來，發(fā)酵醬油中BAs的存在逐漸成為人們關(guān)注的焦點。

1 發(fā)酵醬油中生物胺的形成機制及含量測定

BAs在生物體內(nèi)的形成途徑主要是氨基酸的脫羧反應(yīng)，也有部分通過醛的胺化作用形成。食品中的BAs主要是由微生物在發(fā)酵或成熟過程中由微生物分泌的氨基酸脫羧酶作用于氨基酸而形成。微生物的氨基酸脫羧酶在5-磷酸吡哆醛為輔酶的條件下，脫去氨基酸中的羧基后形成相應(yīng)的胺。一種氨基酸脫羧酶可能對幾種氨基酸都能產(chǎn)生脫羧作用，如乳酸菌產(chǎn)生的組氨酸脫羧酶可以作用于多種氨基酸產(chǎn)生組胺、酪胺、腐胺等，產(chǎn)酪胺能力強的菌株同時也能產(chǎn)生苯乙胺?？偟膩碚f，食品中生物胺的形成有三個先決條件：①能分泌氨基酸脫羧酶的微生物的存在。②生物胺前體物質(zhì)—氨基酸的存在。③適宜于相關(guān)微生物生長和分泌氨基酸脫羧酶的環(huán)境條件[14-15]。

1.1 發(fā)酵醬油中生物胺的種類及含量

不同類型的發(fā)酵醬油中BAs的種類和含量有所差異。LU Y M等[16]利用高效液相色譜法測定了華中、華南地區(qū)不同類型的40種市售醬油的BAs，發(fā)現(xiàn)總胺范圍在41.7～1 357 mg/L之間，其中酪胺、組胺和尸胺含量最高，范圍分別在0～673 mg/L、0～592 mg/L和0～550 mg/L之間，并且發(fā)現(xiàn)在高鹽稀態(tài)醬油中尸胺、組胺、亞精胺含量均遠高于低鹽固態(tài)醬油，不同工藝生產(chǎn)的醬油BAs含量差異較大，這和發(fā)酵類型、環(huán)境（pH、溫度、鹽含量）和微生物種類相關(guān)。鄒陽等[17]也利用相同方法對國內(nèi)市售的10種醬油8種BAs含量進行檢測，除部分高鹽稀態(tài)醬油中未檢出色胺外，其他生物胺均有檢出?？偘贩秶?0.82～1 898.17 mg/L之間，被測在樣品中酪胺、腐胺和β-苯乙胺含量最高，結(jié)果與李志軍等[18-19]報道相同，表明β-苯乙胺、腐胺和酪胺是市售醬油中主要存在的BAs。SCHWAB M[20]指出食物中總胺含量的安全范圍應(yīng)該在0～1 000 mg/L之間，根據(jù)檢測結(jié)果顯示，有少量市售醬油樣品中總胺含量超過最低安全范圍，但絕大部分＜1 000 mg/L。不同地區(qū)的醬油發(fā)酵工藝存在較大差異，根據(jù)KIM J H等[21-22]在對韓日市售醬油中8種BAs進行檢測后發(fā)現(xiàn)，被測樣品中各BAs含量均低于安全限值20 mg/L。國內(nèi)外不同區(qū)域醬油的發(fā)酵環(huán)境、工藝、優(yōu)勢菌株等因素差異較大，這導(dǎo)致了BAs含量差異也較明顯。

1.2 發(fā)酵醬油中生物胺的測定

目前用于食品中BAs檢測的方法主要有以下幾種：高效液相色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法、薄層色譜法、離子色譜法等。高效液相色譜法在BAs檢測中運用最為廣泛，具有分離效率和準確性高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等特點。毛細管電泳法是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，根據(jù)待分離組分在毛細管中的分配系數(shù)不同進行分離的一種液相微分離技術(shù)，具有高效、快速等特點，通常結(jié)合紫外、熒光、電化學(xué)或者質(zhì)譜檢測器使用，但該方法對被測樣品的要求較高，不能有雜質(zhì)影響。BACALONI A等[23-24]利用毛細管電泳法檢測醬油、啤酒、人體乳腺癌細胞和尿液中的BAs含量。氣相色譜法是通過氣液或氣固兩項相互運動過程中物質(zhì)在兩相之間分配系數(shù)差異來達到分離物質(zhì)的目的，具有離能力好，靈敏度高等優(yōu)點，由于分析時，被檢測物需要氣化，不同物質(zhì)的沸點和熱穩(wěn)定性存在差異，因此與其他方法相比局限性更大。王芳等[25]利用氣相色譜法測定了腌肉中5種BAs的含量，該法在運用于醬油中BAs的報道較少。薄層色譜法是一種快速、簡單的低成本檢測方法，可用于生物胺的快速定性或者半定量檢測，但確定含量還需要萃取衍生后，通過熒光檢測器測定BAs衍生物的含量[26]。離子色譜法可以運用于液體食品中BAs檢測，具有分析過程簡單、快速、重現(xiàn)性高的特點[23]。

1.3 發(fā)酵醬油中產(chǎn)生物胺的微生物

傳統(tǒng)發(fā)酵醬油是以大豆和麩皮為主要原料經(jīng)微生物發(fā)酵而來的浸出液，其中的微生物主要有三類：細菌、霉菌和酵母，這些微生物都可能與BAs的產(chǎn)生有關(guān)。從BAs的產(chǎn)生途徑可知，除了部分來自于原料，其余都是在醬油發(fā)酵過程中產(chǎn)生。體系中微生物降解氨基酸有脫氨和脫羧兩種方式，當(dāng)環(huán)境的pH值偏低時，主要進行脫羧作用。對于各BAs來說，必然是某一種氨基酸脫羧作用的結(jié)果，但對于各氨基酸脫羧酶來說，可能分別對幾種氨基酸都能產(chǎn)生脫羧作用。醬油的制曲以米曲霉或黑曲霉為主，下缸發(fā)酵以細菌和酵母為主[27]。發(fā)酵體系中微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶、肽酶和其他酶類將大豆蛋白質(zhì)剪切成小分子肽和氨基酸，使得醬油汁液中含有較為豐富的游離氨基酸。有研究發(fā)現(xiàn)，市售醬油中游離氨基酸含量約為4.971～12.823 g/100 mL（除谷氨酸）[28]，醬油中游離氨基酸的存在為BAs的形成提供了條件。醬油發(fā)酵過程是不同微生物種群之間協(xié)同作用，在眾多微生物中有部分菌株具有控制合成脫羧酶的基因，當(dāng)條件滿足時能夠分泌氨基酸脫羧酶，成為產(chǎn)胺菌。醬油發(fā)酵過程中起主要作用的微生物包括曲霉菌、酵母菌和乳酸桿菌，曲霉菌主要促進醬醪中蛋白質(zhì)等大分子生物活性物質(zhì)分解，酵母菌和乳酸桿菌主要賦予醬油特定的香味和口感，發(fā)酵后期增脂增香[29]。隨著對BAs研究的深入，有學(xué)者分離得到具有分泌氨基酸脫羧酶能力的菌株，主要為芽孢桿菌屬和腸球菌屬。朱天傲[30]分離得到的產(chǎn)胺芽孢桿菌菌株在培養(yǎng)基中產(chǎn)胺范圍在1.09～70.14 mg/L；JEON A R等[31]對大豆制品研究分離得到芽孢桿菌菌株和腸球菌菌株，在檢測培養(yǎng)基中產(chǎn)生的總胺分別為37.43 mg/L和141.74 mg/L，并且發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌菌株產(chǎn)生組胺水平略低，但β-苯乙胺和酪胺水平明顯高于腸球菌菌株；同時研究人員發(fā)現(xiàn)參與豆制品發(fā)酵的優(yōu)勢菌株，如曲霉菌、酵母菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌和腸桿菌等在一定條件下具有產(chǎn)胺能力[32]。

2 醬油發(fā)酵過程中生物胺產(chǎn)生的影響因素

2.1 pH對BAs形成的影響

pH值是影響發(fā)酵食品的重要因素，也是影響發(fā)酵食品中BAs產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一。早在上世紀就有學(xué)者指出，BAs的形成是微生物為了能夠在酸性環(huán)境中生存進化來的特殊反應(yīng)機制。pH值是影響氨基酸脫羧酶活力的重要因素，微生物代謝產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶在低pH環(huán)境中具有更強的活力，因此在酸性環(huán)境中生存的微生物具有更強大的產(chǎn)胺能力[21]。SILVA V L M等[33]研究發(fā)現(xiàn)，pH值的降低是導(dǎo)致發(fā)酵液中組胺和酪胺含量增加的主要原因。另外，TEODOROVI V等[34]報道了pH值為4.0～5.5時脫羧酶活力最高。醬油原料經(jīng)拌鹽下缸發(fā)酵，發(fā)酵液的pH值在6.5左右，偏中性，隨著發(fā)酵的時間延長，溫度的升高，pH值下降，酸性微生物代謝能力增強，氨基酸脫羧酶活性變強，同時水解產(chǎn)生的游離氨基酸增加，這樣就可能為BAs的形成提供條件[35]。

2.2 溫度對BAs形成的影響

溫度主要是通過改變微生物的群落、數(shù)量以及酶的活性來影響B(tài)As的富集。FRANK H A等[36]報道了具有組胺產(chǎn)生能力的微生物可以在較寬的溫度范圍內(nèi)生長，并且在高溫環(huán)境下具有更快的繁殖速度，但在相同高溫下，乳酸菌比產(chǎn)胺微生物生存能力更強，更加具有競爭優(yōu)勢，抑制產(chǎn)胺菌生長，同時發(fā)酵液中各類型水解酶和脫羧酶在高溫下活性增強，這又加快了BAs的生成速度。因此，醬油中各種BAs的含量與發(fā)酵溫度之間關(guān)系較為復(fù)雜，并非成簡單線性關(guān)系。BARGOSSI E等[37]通過對溫度和酪氨酸脫羧酶活性的關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)在30～37 ℃的溫度范圍內(nèi)酪氨酸脫羧酶脫羧能力最佳，效率最高。有學(xué)者研究了以米曲霉為發(fā)酵劑的魚露中的BAs，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度為40 ℃時，更有利于魚露中BAs的產(chǎn)生[38]。發(fā)酵食品在加工過程中，醪液的溫度與微生物繁殖代謝的最適溫度越相近，對BAs的形成越有利，原因在于BAs的代謝途徑與發(fā)酵過程中微生物的種群和數(shù)量相關(guān)[39]。醬油的發(fā)酵為各類耐鹽微生物的生長代謝提供了合適溫度，這有利于加快發(fā)酵速度，縮短生產(chǎn)時間，與此同時也為醬醪中BAs的積累創(chuàng)造了條件。

2.3 鹽含量對BAs形成的影響

食鹽主要通過改變發(fā)酵液中的滲透壓來抑制產(chǎn)胺微生物的生長繁殖，同時高濃度的食鹽可以破壞氨基酸脫羧酶的結(jié)構(gòu)，致使其脫羧能力下降，從而降低發(fā)酵制品中BAs的積累。ROSEIRO L C等[40]報道稱，BAs含量與NaCl濃度呈負相關(guān)。HENRY K D等[41]研究發(fā)現(xiàn)，日本豆面醬發(fā)酵過程中的食鹽濃度在3.5%～5.5%范圍內(nèi)時對組胺的抑制效果最佳。KIM J H等[42]報道了微生物在高鹽環(huán)境下比低鹽環(huán)境下的產(chǎn)胺能力小，這是由于醬醪高鹽環(huán)境下具有更高的滲透壓，微生物的生長繁殖受到了抑制。HERNANDEZHERRERO M M等[43]從豆豉中分離得到了具有組胺產(chǎn)生能力的頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis），可在NaCl濃度為0.5%～10%的條件下正常生長，在添加了胰酪蛋白胨的大豆肉湯（含1%的L-組氨酸）中培養(yǎng)該菌，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的組胺含量超過500 mg/kg；豆豉發(fā)酵過程中NaCl含量在0.5%～10%時對S.capitis產(chǎn)生組胺脫羧酶具有促進作用，當(dāng)NaCl含量超過10%時S.capitis的生長繁殖變緩，超過20%時能夠完全抑制該菌的生長以及組胺脫羧酶的代謝。曹忠娜[44]研究發(fā)現(xiàn)，高鹽稀態(tài)醬油中將鹽含量提高至20%，可有效降低BAs的產(chǎn)生。同時發(fā)現(xiàn)不同鹽度（16%、18%和20%）條件下的BAs主要為精胺、亞精胺，其次為組胺和酪胺，鹽含量20%組的總胺含量明顯低于18%組和16%組，并且維持在100 mg/L以下，這說明適當(dāng)提高鹽含量對BAs的生成有一定抑制作用。

2.4 其他影響因素

除pH、溫度和含鹽量外，原料的品質(zhì)也會對發(fā)酵醬油中BAs含量有一定影響。RIGHETTI L等[45]在研究植物源性食品中的BAs含量時發(fā)現(xiàn)，豆科植物的莖桿、花蕾和胚芽中都有BAs檢出，大豆本身帶有一定量的BAs，并且試驗田的大豆中BAs含量更高。有學(xué)者研究證實了原料中大豆的種類和比例是影響發(fā)酵豆制品中BAs含量的因素之一[46]。此外，大豆原料受到微生物污染后，可能導(dǎo)致在發(fā)酵之前就存在一定量的BAs。因此，對原料質(zhì)量的把控，是降低醬油中BAs含量重要手段之一。

3 醬油發(fā)酵過程中BAs的控制技術(shù)研究

3.1 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

醬油發(fā)酵過程中的溫度和食鹽濃度是影響成品醬油品質(zhì)的兩個關(guān)鍵因素，適當(dāng)降低發(fā)酵溫度至20～25 ℃有利于抑制產(chǎn)胺菌株的生長，并影響脫羧酶活性。含高濃度食鹽的醬醪中滲透壓會大大增加，產(chǎn)胺菌不能進行正常的代謝繁殖，這能夠有效的減少BAs的富集。但高鹽食品不滿足于人們對健康飲食的要求，能夠抑制BAs產(chǎn)生的同時找到安全的食鹽添加量至關(guān)重要。有文章報道[47]，意大利奶酪發(fā)酵過程中施以一定高壓，能夠改變包括具有產(chǎn)胺能力在內(nèi)的有害微生物細胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)，并抑制其正常代謝，達到減少BAs富集的目地。

3.2 安全的發(fā)酵菌株

BAs在發(fā)酵食品中大量存在，近年來有研究人員提出利用生物技術(shù)來控制BAs在發(fā)酵食品中的積累，即使用安全的發(fā)酵制劑。FABRIZIA T等[48]成功從羊奶酪中分離出不會產(chǎn)生酪胺和組胺的干酪乳桿菌（L.casei）A422和酪黃腸球菌（E.casseliflavus）A143，并通過實驗發(fā)現(xiàn)菌株A422和A143對酪胺和組胺具有出色的降解能力。VENDULA P等[49]探究了梭狀芽孢桿菌（Lb.curvatus）和類干酪乳桿菌（Lb.paracasei）對發(fā)酵制品中BAs含量的影響，通過與傳統(tǒng)產(chǎn)胺乳酸亞弧菌對比發(fā)現(xiàn)Lb.curvatus和Lb.paracase不產(chǎn)BAs，并且對乳酸亞弧菌的生長具有抑制作用。另外，KIM S Y等[50]以4株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CB-1、CB-5、CB-16和CS-1217作為發(fā)酵劑可有效降低韓國醬油（Cheonggukjang）中8種BAs的含量，并且對醬醪中產(chǎn)胺菌株蠟樣芽孢桿菌的繁殖代謝抑制效果明顯。同時SUN Q等[51]研究發(fā)現(xiàn)，添加植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）的混合發(fā)酵劑能夠顯著降低發(fā)酵制品中組胺、色胺、尸胺、腐胺、β-苯乙胺和酪胺的含量，同時能夠抑制產(chǎn)胺腸桿菌的生長。因此，將作用于醬油發(fā)酵的上述菌株優(yōu)化后作為新型發(fā)酵劑，能夠增加抑制成品中BAs富集的可能性。

3.3 添加BAs抑制劑

在醬油的發(fā)酵過程中適當(dāng)加入具有抑菌功能的天然活性物質(zhì)，可以對醬醪中產(chǎn)胺微生物生長起到一定抑制作用。玫瑰多酚是一種具有抗菌活性的天然物質(zhì)，ZHANG Q Q等[52]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的玫瑰多酚能夠有效降低發(fā)酵制品中BAs的生成和腐敗菌的生長，同時提高乳酸菌的生長速度和豐富度，降低產(chǎn)胺菌脫羧酶的代謝能力，提高發(fā)酵食品的食用安全性。SHUKLA S等[53]研究了大蒜、蓮藕、銀杏葉復(fù)合提取物對傳統(tǒng)韓國大醬（Doenjang）的中間原料豆粕（Meju）的食品安全性影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加了復(fù)合提取物的樣品中的BAs含量遠低于美國食品與藥物管理局、韓國食品藥品管理局和歐洲食品安全局規(guī)定的安全限值，研究發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合提取物抑制了豆粕中產(chǎn)胺微生物的生長，降低了氨基酸脫羧酶活性。也有學(xué)者通過添加紅花和苦瓜提取物、豌豆二胺氧化酶等[54]天然物質(zhì)來抑制發(fā)酵制品中BAs的產(chǎn)生，香料中的姜黃素、辣椒素、麝香草酚和胡椒堿同樣是能夠抑制BAs產(chǎn)生的天然提取物。

4 總結(jié)

通過對有關(guān)市售醬油中BAs含量檢測報道的研究發(fā)現(xiàn)，部分醬油中BAs含量超過國際建議安全限量，對健康造成威脅。醬油中的BAs主要與發(fā)酵過程中多種產(chǎn)胺微生物對游離氨基酸的利用有關(guān)，微生物分泌的氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸，形成相應(yīng)的BAs。醬油中BAs的含量同時受發(fā)酵環(huán)境中pH值、溫度和含鹽量的影響。其發(fā)酵過程在生物代謝作用下，pH下降，并伴隨溫度變化，氨基酸脫羧酶活力也會發(fā)生變化。添加BAs抑制劑可看作優(yōu)化傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的一部分，兩者都是通過改善發(fā)酵環(huán)境來達到抑制BAs產(chǎn)生的目的。適合的BAs抑制劑，適當(dāng)?shù)慕档桶l(fā)酵溫度，科學(xué)的增加含鹽量，改變體系滲透壓，抑制產(chǎn)胺微生物生長代謝，從而降低BAs產(chǎn)生的風(fēng)險；同時，在醬油發(fā)酵菌株中，對低產(chǎn)胺菌株進行篩、優(yōu)化和改良，培育出安全高效的發(fā)酵菌株。醬油的發(fā)酵過程是由多系統(tǒng)共同作用（及發(fā)酵條件、環(huán)境影響、發(fā)酵液營養(yǎng)和微生物多樣性等），其工藝復(fù)雜。因此，將三種控制技術(shù)共同作用，并且找到三者的平衡點，并合理的利用，能夠極大限度的減少醬油中BAs的產(chǎn)生，對增加醬油的食用安全性具有重要意義。