PCR儀與測(cè)序儀應(yīng)用于丙型肝炎病毒基因型檢測(cè)的臨床效果觀察

宋樹(shù)森 李強(qiáng) 谷海峰 王巖 沈陽(yáng)市第六人民醫(yī)院 （遼寧 沈陽(yáng) 110006）

內(nèi)容提要：目的：觀察PCR儀與測(cè)序儀在丙型肝炎病毒（HCV）基因型檢測(cè)中的應(yīng)用。方法：選擇2018年1月～2018年12月收治的134例HCV感染患者為研究對(duì)象，給予患者PCR儀檢測(cè)、測(cè)序儀檢測(cè)。結(jié)果：測(cè)序儀檢測(cè)134例均可分型，PCR儀檢測(cè)130例患者可分型，4例未能分型。PCR檢測(cè)結(jié)果：134例HCV感染患者中，1b型59例，2a型47例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，4例為分出型別。基因測(cè)序結(jié)果：134例均可分型：1型59例，2a型40例，2i型7例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，6n型4例。PCR儀檢測(cè)法檢測(cè)符合率97.0%。結(jié)論：PCR儀測(cè)序儀檢測(cè)用于丙型肝炎病毒基因型檢測(cè)，操作便捷，但其只能檢測(cè)探針覆蓋的型別，個(gè)別罕見(jiàn)型別不能分型。

作為慢性肝病的主要病因之一，HCV感染的危害已經(jīng)引起了人們的廣泛重視[1]。HCV基因型檢測(cè)是臨床控制HCV感染的基礎(chǔ)[2]。由于不同基因亞型病毒感染引發(fā)的臨床表現(xiàn)各異，治療方案亦有所差別。因此，需要通過(guò)對(duì)HCV感染患者的精確基因型檢測(cè)，為其臨床治療提供良好的支持。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

納入2018年1月～2018年12月本院收治的134例HCV感染患者為研究對(duì)象。其中，男86例，女58例；年齡（36.9±12.5）歲。

儀器與試劑：實(shí)時(shí)熒光PCR儀（ABi 7500），測(cè)序儀（ABi 3130基因測(cè)序儀），丙型肝炎病毒（HCV）基因分型檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ┯商┢丈锟茖W(xué)（中國(guó)）有限公司提供，丙型肝炎病毒（HCV）基因分型檢測(cè)試劑盒（DNA測(cè)序法）北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司提供，HCVRNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，德國(guó)Qiagen公司）。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測(cè)

①取樣。取118例HCV感染患者2mL空腹靜脈血，以3000r/min速度，持續(xù)離心處理10min，獲得血清標(biāo)本，置于-80°C溫度冰箱內(nèi)保存。②核酸提取。血清樣本按照QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取純化。③PCR檢測(cè)。分別取各亞型HCV RT-PCR反應(yīng)液38×（n+2）μL和酶系2×（n+2）μL，（n等于首檢樣本數(shù)），混勻，各管分別按40μL/管分裝到PCR反反管中。再在各亞型HCV RT-CR反應(yīng)液中分別加入25μL礦物油。HCV RNA或質(zhì)控品的提取產(chǎn)物各10μL?；靹?，放入PCR儀，按下列程序條件擴(kuò)增：42°C 30min；95°C 3min；再按94°C 20S→55°C 20S→72°C 30S，循環(huán)10次；再按94°C 15S→60°C 45S，循環(huán)30次。④結(jié)果判讀。如果檢測(cè)樣本無(wú)典型S擴(kuò)增曲線或Ct值＞26.5，則判樣本為HCV 1b、2a、3a、3b和6a陰性；如果檢測(cè)樣本呈典型S曲線且Ct值≤25.1，則根據(jù)說(shuō)明書(shū)提供的表格判斷樣本的亞型。

1.2.2 測(cè)序檢測(cè)

①HCV-RNA標(biāo)本制備。選擇德國(guó)Qiagen QIAamp病毒RNA抽提試劑盒從HCV感染患者的200μL血清標(biāo)本中提取HCV病毒RNA，將病毒RNA置于-80°C環(huán)境下保存待檢。②基因擴(kuò)增。選擇HCV 感染患者的HCV NS5B 基因區(qū)域作為測(cè)序重點(diǎn)，擴(kuò)增方法選擇反轉(zhuǎn)錄方法。擴(kuò)增完畢通過(guò)擴(kuò)增曲線判斷是否擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增成功的片段純化，然后進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，產(chǎn)物再次純化后準(zhǔn)備上級(jí)。③測(cè)序。將純化產(chǎn)物加入96孔板，過(guò)夜檢測(cè)。④分析。將測(cè)序片段提交到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行基因分型分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)兩種檢測(cè)方法的基因型檢測(cè)結(jié)果；對(duì)比兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)符合率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS23.0軟件統(tǒng)計(jì)。P＜0.05，差異顯著。

2.結(jié)果

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果

測(cè)序儀檢測(cè)134例患者均可分型，而PCR檢測(cè)130例可分型，另外4例患者未能分型。

測(cè)序檢測(cè)結(jié)果：134例HCV感染患者中：1型共77例，1型59 例，2a型40 例，2i型7 例，3a型6 例，3b 型15 例，6a型3例，6n型4例。HCV基因型主要為1b型和2a型，二者占比之和達(dá)73.9%。其中2i型和6n型為PCR法檢測(cè)不到的。

PCR檢測(cè)結(jié)果：134例HCV感染患者中，1b型59例，2a型47例，3a型6例，3b型15例，6a型3例，4例為分出型別。同樣以1b型和2a型為主。

2.2 檢測(cè)符合率

以本組134例HCV感染患者的基因型一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估PCR儀檢測(cè)的符合率，結(jié)果提示：PCR儀檢測(cè)法對(duì)HCV感染患者基因型的檢測(cè)符合率為97.0%（130/134）。

3.討論

隨著臨床關(guān)于HCV感染研究的不斷深入，HCV基因型檢測(cè)已經(jīng)成為這一領(lǐng)域研究的主要方向之一[3]。不同的基因型，所應(yīng)用的治療手段與治療周期都是不同的。目前可用于HCV基因型檢測(cè)的方法較多，如異源分子遷移率分析法、測(cè)序法、PCR分析法，斑點(diǎn)雜交法等[4]。其中，測(cè)序法是臨床開(kāi)展HCV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)。這種檢測(cè)方法可保障HCV感染患者的基因型檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但其存在耗時(shí)較長(zhǎng)、檢測(cè)過(guò)程繁瑣等不足[5]。

相對(duì)于其他檢測(cè)技術(shù)而言，PCR技術(shù)是一種具有典型高效性、便捷性特征的檢測(cè)方法。將其用于HCV感染患者的基因型檢測(cè)，可于檢測(cè)2～3h內(nèi)獲取檢測(cè)結(jié)果。雖然這種檢測(cè)方法的靈敏度水平較高，但由于引物的限制，其在區(qū)分部分罕見(jiàn)HCV的基因時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)失敗。同時(shí)，對(duì)于2a型和2i型不能分辨，但由于這兩種基因型生物學(xué)特性較一致，所以可以忽略。此外，本研究證實(shí)：PCR檢測(cè)HCV感染基因型的符合率為97.0%。這一結(jié)果提示：這種檢測(cè)方法在基因分型準(zhǔn)確性方面良好。

綜上所述，相對(duì)于測(cè)序儀檢測(cè)而言，PCR儀在HCV基因型檢測(cè)便捷性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，且這種檢測(cè)方法的符合率良好。因此，在HCV感染患者的基因型檢測(cè)中，可將PCR儀檢測(cè)結(jié)果作為參考。