SPE-UPLC法測(cè)定養(yǎng)血清腦水提浸膏中的毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素的含量

徐 波，牛 濤，陳 紅，張學(xué)敏

(天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津 300410)

養(yǎng)血清腦顆粒是天士力醫(yī)藥集團(tuán)研制、生產(chǎn)的復(fù)方中藥制劑，具有養(yǎng)血平肝、活血通絡(luò)等功效，可用于血虛肝亢所致的頭痛、眩暈眼花、心煩易怒、失眠多夢(mèng)等病癥。藥理研究表明養(yǎng)血清腦顆粒具有改善軟腦膜微循環(huán)、增加腦血流量、緩解血管痙攣和止痛等作用[1]。養(yǎng)血清腦水提浸膏是為養(yǎng)血清腦顆粒和養(yǎng)血清腦丸的制劑中間體，制備工藝為：熟地、夏枯草、細(xì)辛等六味藥材加水煎煮2次，提取液濾過，濃縮至一定濃度，加乙醇適量，靜置12～24 h，濾過，回收乙醇，濃縮至適量，即得[2]。

目前，養(yǎng)血清腦顆粒的質(zhì)量控制主要針對(duì)制劑中的芍藥苷和多種酚酸類成分進(jìn)行定量測(cè)定，還缺乏制劑中間體和其他藥味成分的質(zhì)量評(píng)估方法。本試驗(yàn)測(cè)定的毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素分別源于養(yǎng)血清腦水提浸膏處方中的熟地和細(xì)辛藥材[3，4]，毛蕊花糖苷具有抗炎、抗氧化作用[5，6]，細(xì)辛脂素具有體外免疫抑制作用[7，8]，這些作用與養(yǎng)血清腦顆粒養(yǎng)血平肝、活血通絡(luò)的功效相契合。本研究通過建立毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素的含量測(cè)定方法，有助于更全面地評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量水平，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和藥效研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器： Waters Acquity超高效液相色譜儀，TUV紫外檢測(cè)器，Empower3化學(xué)工作站(美國Waters公司)；XS105-UV電子天平(瑞士 METTLER公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國 MILLIPORE公司)。

試藥與耗材： 毛蕊花糖苷(中國食品藥品檢定研究院，111530-201603)；細(xì)辛脂素(中國食品藥品檢定研究院，111889-201502)；養(yǎng)血清腦水提浸膏(天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司)；ProElut C18-U(500mg，6mL)固相萃取柱(迪馬科技有限公司)。

2 溶液的制備

2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素對(duì)照品適量，加甲醇配制成每毫升含毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素分別為0.004 mg和0.01 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液

精密稱取養(yǎng)血清腦水提浸膏約0.25 g，加25%甲醇溶液約10 mL，超聲溶解，搖勻，置于已處理好的ProElut C18-U固相萃取柱。用25%甲醇溶液5 mL洗滌，棄去。用40%甲醇溶液4.5 mL洗脫，收集洗脫液至5 mL容量瓶中，加40%甲醇溶液至刻度，搖勻，得供試品溶液1。繼續(xù)用60%甲醇溶液5mL洗滌，棄去。用甲醇4.5 mL洗脫，收集洗脫液至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得供試品溶液2。

3 色譜條件

3.1 毛蕊花糖苷測(cè)定

使用UPLC色譜系統(tǒng)，采用Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，2.1 mm×100 mm)，以0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B。流速為0.4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm；取供試品溶液1進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2 μL。梯度洗脫條件，見表1。色譜見圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

圖1毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品圖譜(a)和樣品圖譜(b)

3.2 細(xì)辛脂素測(cè)定

使用UPLC色譜系統(tǒng)，采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，以水為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B。流速為0.4 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm；取供試品溶液2進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2 μL。梯度洗脫條件，見表2。色譜見圖2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫條件

4 方法與結(jié)果

4.1 線性關(guān)系考察

精密稱取毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素對(duì)照品適量，加甲醇分別配制成每毫升含毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素的混合對(duì)照品溶液，再分別量取0.1、0.2、0.4、0.8、1 mL混合對(duì)照溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，制成系列溶液，按前述標(biāo)題“3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，求得回歸方程。毛蕊花糖苷的回歸方程為：A=6 159.14C+877.64(r=0.999 9)，表明毛蕊花糖苷在1.58～15.8 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積和濃度線性關(guān)系良好。細(xì)辛脂素的回歸方程為：A=6 702.03C+1 794.94(r=0.999 8)，表明細(xì)辛脂素在2.12～21.2 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積和濃度線性關(guān)系良好。

圖2細(xì)辛脂素標(biāo)準(zhǔn)品圖譜(a)和樣品圖譜(b)

4.2 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

分別量取毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素供試品溶液，按前述標(biāo)題“3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素峰面積的RSD分別為0.8%和0.5%，結(jié)果表明進(jìn)樣精密度良好。

4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取養(yǎng)血清腦水提浸膏6份，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素的平均含量分別為0.074 0 mg/g和0.065 5 mg/g，RSD分別為1.9%和1.8%，結(jié)果表明所用方法的重復(fù)性良好。

4.4 加樣回收率

精密稱取養(yǎng)血清腦水提浸膏6份樣品，每份約0.125 g，各分別精密加入對(duì)照品溶液2 mL(每毫升含毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素分別為0.003 55 mg和0.004 23 mg)，自“加25%甲醇溶液適量，超聲溶解”起，照含量測(cè)定項(xiàng)下依法處理，作為供試品溶液，取2 μL注入色譜儀，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (%，n=6)

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

量取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18 h進(jìn)樣，記錄毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素的峰面積，峰面積的RSD分別為1.0%和0.9%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.6 樣品測(cè)定

稱取不同批次的養(yǎng)血清腦水提浸膏，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

4 討論

4.1 SPE純化方法的優(yōu)化

養(yǎng)血清腦水提浸膏處方由6味中藥組成，成分非常復(fù)雜，且待測(cè)成分含量均較低，必須對(duì)樣品進(jìn)行純化富集，提高信噪比，滿足分析要求。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取方法，通過對(duì)待測(cè)成分保留特性的考察，對(duì)除雜溶媒強(qiáng)度和用量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了采用最簡(jiǎn)單的固相萃取梯度洗脫條件，通過一支固相萃取柱實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)成分的分離純化和富集。

我們首先考查固相萃取柱對(duì)待測(cè)成分的保留特性，分別以不同洗脫強(qiáng)度的溶媒對(duì)待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行上樣和洗脫，確定ProElut C18-U固相萃取柱對(duì)毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素的泄漏溶媒強(qiáng)度分別為30%和70%甲醇溶液。通過對(duì)除雜溶媒強(qiáng)度的考察，分別確定了以25%甲醇溶液5 mL對(duì)毛蕊花糖苷待測(cè)樣品進(jìn)行除雜，以60%甲醇溶液對(duì)細(xì)辛脂素待測(cè)樣品進(jìn)行除雜，收到了最好的除雜效果。同時(shí)，以25%甲醇溶液最為上樣液也降低了樣品中高極性雜質(zhì)的溶解度，降低了固相萃取柱負(fù)擔(dān)。

4.2 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)流動(dòng)相和梯度洗脫條件進(jìn)行了簡(jiǎn)單優(yōu)化，最終提高了檢測(cè)效率，獲得了最佳分離效果，從而使毛蕊花糖苷和細(xì)辛脂素的含量測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確。