夏枯草抗阿爾茨海默病的成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

彭 壯，彭 莎，何超平，徐 佳，肖 嵐，廖端芳，2*，李亞梅，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2.湖湘中藥資源保護(hù)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208)

夏枯草，為唇形科夏枯草屬植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥成熟果穗[1]，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，其性寒，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫之功，已知其含有的主要化學(xué)成分有多糖類、有機酸類、黃酮類、三萜及其苷類、甾體類、揮發(fā)油類等，已報道的藥理作用主要有降糖、降壓、抗菌、抗炎、抗腫瘤、免疫抑制、抗氧化以及抑制病毒生長，臨床上主要用于目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳腺癌、高血壓、腮腺炎、浸潤性肺結(jié)核等，作為一種藥食同源的草本植物，至今已經(jīng)有幾千年的藥用歷史。

阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退，嚴(yán)重影響日?；顒訛橹饕卣鞯纳窠?jīng)退行性疾病[2]。目前全世界有近4 680萬AD患者，到2050年估計會達(dá)到1.3億人[3]。AD作為一種社會疾病，給社會和患者家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，從2000年消耗在AD患者的醫(yī)療費用180億美元增加到2010年的6 000多億美元。據(jù)估計，到2050年費用將增加到1.2萬億美元[4]，已經(jīng)成為影響全球的嚴(yán)重疾病并且受到全球所有相關(guān)研究人員的高度關(guān)注。AD的病理特征包括β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)的堆積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元的丟失[5]，有證據(jù)顯示Aβ的堆積與載脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)和炎癥有著密切的關(guān)系[6-7]，它們共同參與AD的病程發(fā)展，也有研究表明使用抗炎藥物可降低AD的發(fā)病率[8]，但目前并沒有確切有效的抗炎藥物在臨床中報道出來。

目前有關(guān)夏枯草化學(xué)成分、藥理機制及臨床應(yīng)用的研究不斷涌現(xiàn)[9-10]，但未見整體系統(tǒng)地分析夏枯草中成分、靶點、通路和阿爾茨海默病的相互關(guān)系的報道。隨著生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、計算機技術(shù)的不斷發(fā)展和聯(lián)合應(yīng)用，以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[11]、整合藥理學(xué)[12]等概念的逐步提出，這也為中醫(yī)藥科學(xué)的研究提供了新的思路與方法[13-14]，利用其整合生物信息學(xué)、分子生物學(xué)及各大數(shù)據(jù)庫信息，系統(tǒng)地研究“藥物-靶點-通路-疾病”之間的相互作用，探究中醫(yī)藥“多成分、多靶點、多途徑”的藥理機制，與中醫(yī)藥的整體觀、辨證論治、組方配伍、協(xié)同增效等原則不謀而合[15]。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索夏枯草的主要物質(zhì)基礎(chǔ)、核心靶點及與阿爾茨海默病之間可能存在的相互關(guān)系，為后續(xù)進(jìn)一步闡明夏枯草抗阿爾茨海默病的作用機制提供思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；

TCMID數(shù)據(jù)庫(http：∥119.3.41.228/tcmid/search/)；

STITCH數(shù)據(jù)庫(http：∥stitch.embl.de/)；

STRING數(shù)據(jù)庫(https：∥string-db.org/)；

Cytoscape3.7.1軟件；

Pubchem數(shù)據(jù)庫(https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；

TTD數(shù)據(jù)庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；

DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http：∥www.disgenet.org/)；

UniProt數(shù)據(jù)庫(https：∥www.uniprot.org/)；

Metascape數(shù)據(jù)庫(http：∥metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草活性成分檢索與篩選 通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺，http：∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)上檢索夏枯草的化學(xué)成分，再根據(jù)藥物的ADME(吸收、分布、代謝及排泄)相關(guān)特性，并且以多篇相關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)為參考，選擇將夏枯草化學(xué)成分的口服利用度(OBioavail，OB)以及類藥性(drug-likeness，DL)作為活性成分篩選的關(guān)鍵參數(shù)[16]，從而篩選出滿足口服利用度OB>30%且類藥性DL>0.18的化合物作為夏枯草潛在活性成分。同時，由于藥物在機體內(nèi)的吸收利用不只有口服一種途徑，加之口服利用度低的能做成其他不同劑型，因此，應(yīng)用TCMID數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索，補充夏枯草中的其他有效成分。最后將篩選出的夏枯草潛在活性成分在Pubchem數(shù)據(jù)庫中查詢其結(jié)構(gòu)式，并使用SMILES表達(dá)式。

1.孩子們大多已經(jīng)入門，基本上能寫出像模像樣的對聯(lián)來；共創(chuàng)作出對聯(lián)一兩百副，創(chuàng)作了不少好對子，得到親友好評。

1.2.2 夏枯草活性成分靶點挖掘 使用TCMSP靶點查找夏枯草潛在活性成分的作用靶點，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將查找到的所有靶點蛋白名轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名。使用Cytoscape3.7.1軟件對夏枯草的活性成分以及作用靶點進(jìn)行相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.2.3 疾病相關(guān)基因檢索 使用TTD數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索阿爾茨海默病(Alzheimer′s Diseases)的靶基因，將重復(fù)項去除，并查閱阿爾茨海默病靶基因的相關(guān)文獻(xiàn)[17-20]，匯總阿爾茨海默病基因，并在UniProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因和蛋白的轉(zhuǎn)換。

1.2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.2.2”和“1.2.3”得到的蛋白一并導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”進(jìn)行計算，最低相互作用閥值設(shè)為中等“medium confidence=0.4”，構(gòu)建靶點群蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)[21]，即“夏枯草-靶點-阿爾茨海默病”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 關(guān)鍵靶點的篩選 使用Cytoscape對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，計算網(wǎng)絡(luò)整體的“介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)和節(jié)點度值分布(Node Degree Distribution)”，并將Degree、Closeness和Betweenness的均數(shù)作為“閾值”，選取3個參數(shù)同時都在閾值之上的靶點為“關(guān)鍵靶點”，研究篩選出關(guān)鍵靶點可能存在的藥理作用。

Degree指網(wǎng)絡(luò)節(jié)點和其他節(jié)點的連接數(shù)目；Betweenness為網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑數(shù)目和最短路徑總數(shù)的比值；Closeness為通過節(jié)點之間的傳遞距離對節(jié)點的重要度進(jìn)行衡量。三者是衡量一個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的主要拓?fù)鋮?shù)，也是判斷一個靶蛋白是否為“關(guān)鍵靶點”的重要依據(jù)[22]。

1.2.6 關(guān)鍵靶點的代謝通路與生物過程分析 為了進(jìn)一步研究夏枯草可以抗阿爾茨海默病的相關(guān)作用情況，擬使用Gather平臺對夏枯草的抗阿爾茨海默病靶點群，進(jìn)行GO生物過程富集分析，詮釋夏枯草靶點的抗阿爾茨海默病生物過程，再進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，研究夏枯草抗阿爾茨海默病的主要代謝通路。Gather數(shù)據(jù)庫中的列表與背景均設(shè)置“Homo Sapiens”(人類)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 夏枯草活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢得到夏枯草活性成分11個，在TCMID數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索得到另8個活性成分，共19個活性成分(見表1)。

表1 夏枯草活性成分

2.2 夏枯草活性成分靶點

通過Cytoscape3.7.1軟件得到夏枯草活性成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，19個橢圓形表示夏枯草的活性成分(M1～M19代表的化合物見表1)，253個不規(guī)則四邊形為活性成分作用靶點，共有540條邊代表靶點和化學(xué)成分之間的相互作用(見圖1)，體現(xiàn)了夏枯草多成分、多靶點的特點。

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 阿爾茨海默病相關(guān)基因

在TTD數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease)的靶基因，共得到2 021個基因(其中TTD中檢索到86個基因，DisGeNET中檢索到1 981個，有46個重復(fù))。

2.4 蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在TTD數(shù)據(jù)庫和DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索到阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease)的靶基因與夏枯草作用的靶基因有136個重復(fù)，這136個靶基因可能為夏枯草抗阿爾茨海默病的靶點。為研究各靶點在體內(nèi)的相互作用關(guān)系，尋找核靶點，將潛在靶點蛋白群進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(見圖2)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)136個靶蛋白發(fā)生相互作用，產(chǎn)生2 440條代表蛋白之間相互作用的邊。

圖2 靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 核心靶點的分析結(jié)果

通過Cytoscape計算得到，PPI網(wǎng)絡(luò)平均度值為21，平均介數(shù)為1.44×10-2，平均緊密度為0.47，度值、介數(shù)和緊密度均超過平均值的靶蛋白共有39個，說明這39個靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置，很可能是夏枯草抗阿爾茨海默病的關(guān)鍵靶點(見圖3)。

此外，發(fā)現(xiàn)夏枯草的19種活性成分中的16種活性成分可能有抗阿爾茨海默病的作用，且其中M3(Quercetin)、M8(Kaempferol)、M12(Luteolin)、M13(wogonin)、M15(ursolic acid)、M19(Rosmarinic Acid)共6種活性成分可能為抗阿爾茨海默病的關(guān)鍵化合物。

注：最中間矩形為夏枯草，橢圓形為夏枯草活性化合物，菱形為夏枯草關(guān)鍵活性化合物，近菱形不規(guī)則四邊形為關(guān)鍵靶點，最外側(cè)不規(guī)則四邊形為靶點。

圖3 夏枯草(PV)有效成分靶標(biāo)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

2.6 Metascape分析KEGG和GO的結(jié)果

根據(jù)P值(校正)<0.01的標(biāo)準(zhǔn)，在Metascape數(shù)據(jù)庫對39個關(guān)鍵靶點進(jìn)行計算分析，最終得到關(guān)鍵靶點的相關(guān)通路信息。其中主要包括白介素信號通路、細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)信號通路、PIP3激活A(yù)KT信號通路等，見圖4和表2。

A.

表2 關(guān)鍵靶點的信號通路

4 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對夏枯草的主要活性成分、作用靶點、相關(guān)生物信號通路及對阿爾茨海默病的作用等幾方面的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了探討。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共發(fā)現(xiàn)夏枯草的主要活性成分11 個，通過TCMID數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)檢索得到另外8個活性成分，一共得到19個主要活性成分，這19個成分分別是：Vulgaxanthin-I、Betulinic acid、Quercetin、Morin、Stigmasterol、poriferasterol monoglucoside_qt、Spinasterol、Kaempferol、Delphinidin、stigmast-7-enol、beta-sitosterol、Luteolin、wogonin、Oleanolic acid、ursolic acid、Hesperidin、Hyperoside、Rutin、Rosmarinic Acid，這可能是夏枯草發(fā)揮藥效的主要活性物質(zhì)，其中M3(Quercetin)、M8(Kaempferol)、M12(Luteolin)、M13(wogonin)、M15(ursolic acid)、M19(Rosmarinic Acid)共6種活性成分可能為抗阿爾茨海默病的關(guān)鍵化合物。檢索阿爾茨海默病的相關(guān)靶點，與夏枯草活性成分作用靶點進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到39個關(guān)鍵靶點。對關(guān)鍵靶點進(jìn)行富集，得到夏枯草抗阿爾茨海默病的關(guān)鍵信號通路，主要包括炎癥相關(guān)白介素信號通路、細(xì)胞對應(yīng)激的反應(yīng)信號通路、PIP3激活A(yù)KT信號通路，推測夏枯草的活性成分可能通過作用于相關(guān)的靶點蛋白從而影響相關(guān)的信號通路而發(fā)揮抗阿爾茨海默病的藥效。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討并揭示夏枯草的主要活性成分、作用靶點、相關(guān)生物信號通路和阿爾茨海默病的關(guān)系，為后續(xù)進(jìn)一步研究夏枯草的作用機制提供理論依據(jù)，同時也為夏枯草的進(jìn)一步臨床研究開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

人類社會老齡化已成為人類發(fā)展的一種趨勢，隨著我國老齡化速度加快，老齡化人口急劇上升，且為世界老年人口最多的國家，阿爾茨海默病(Alzheimer Disease)的發(fā)病率也隨著老齡化的進(jìn)程而節(jié)節(jié)攀升。AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，老年人是主要的發(fā)病人群，在65～74歲老年人中的發(fā)病率為3%，而在75～84歲的老年人中發(fā)病率上升至17%，更嚴(yán)重的是在85歲以上的老年人中發(fā)病率有32%[28]。目前在臨床上針對阿爾茨海默病使用的藥物有膽堿酯酶抑制劑類和谷氨酸受體阻斷劑兩類[29]，患者長期服用藥物后雖癡呆癥狀得到減輕，但會產(chǎn)生睡眠障礙、肌肉痙攣、嘔吐腹瀉、心動過慢和加重哮喘等不良反應(yīng)。因此，研究并開發(fā)有效的抗AD藥物，具有非常重要的科學(xué)意義和社會價值。

關(guān)于AD的發(fā)病機制，有很多學(xué)者提出不同的假說，得到認(rèn)可的主要有炎癥機制、中樞膽堿能、tau蛋白的過度磷酸化、細(xì)胞凋亡機制、β-淀粉樣蛋白、遺傳因素以及腸道菌群失調(diào)等[29-30]。在AD患者的腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)特異性免疫反應(yīng)機制受損，從而激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放出炎癥介質(zhì)，引起局部的炎癥反應(yīng)，而局部的炎癥反應(yīng)又會加劇Aβ的堆積，進(jìn)而形成惡性循環(huán)[31]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的Metascape分析，發(fā)現(xiàn)夏枯草活性成分可能發(fā)揮抗阿爾茨海默病的3個關(guān)鍵信號通路，這些相關(guān)通路都已經(jīng)在相關(guān)研究中進(jìn)行了報道，而針對夏枯草活性成分在目前并無抗阿爾茨海默病的報道，但已有研究表明，水蓼中的beta-sitosterol能充分到達(dá)大腦，抑制參與膽堿酯酶代謝的酶，并作為自由基清除劑而發(fā)揮抗AD的作用[32]，β-sitosterol能通過雌激素受體介導(dǎo)PI3K / GSK3β信號結(jié)合到膜而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用[33]。kaempferol能通過抗炎而發(fā)揮抗AD[34]，沉香中的kaempferol有抗AD的作用[35]，銀杏中的kaempferol可以快速透過血腦屏障進(jìn)入海馬細(xì)胞外液，30 min內(nèi)達(dá)到最大濃度，通過抑制腦內(nèi)Aβ的形成從而發(fā)揮抗阿爾茨海默病效應(yīng)[36-38]。Spinasterol已經(jīng)被報道參與各種生物活動，可以通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑來增加腦內(nèi)細(xì)胞抗氧化的特性，具有抗氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥引起的神經(jīng)退行性疾病的治療潛力[39]，Stigmasterol已經(jīng)被報道通過激活雌激素或NMDA受體來增強膽堿能神經(jīng)傳遞系統(tǒng)從而發(fā)揮認(rèn)知改善抗阿爾茨海默病的作用[40]。Delphinidin可以抗阿爾茨海默病主要是通過減弱細(xì)胞內(nèi)鈣的內(nèi)流和tau蛋白過度磷酸化，保護(hù)細(xì)胞免受Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[41]。Luteolin被報道為一種ROS清除劑，對AD的學(xué)習(xí)缺陷和海馬結(jié)構(gòu)具有潛在的保護(hù)作用[42]，Morin可以有效的破壞Aβ的聚集，細(xì)胞毒性小，可以改善阿爾茨海默病患者的認(rèn)知能力[43]，Vulgaxanthin-I作為一種良好的過氧自由基清除劑，通過發(fā)揮抗氧化作用而對阿爾茨海默病發(fā)揮相應(yīng)的藥效[44]，丹參中的提取物stigmast-7-enol具有抗氧化抗炎及抗膽堿酯酶等活性，能對阿爾茨海默病起到一定的治療作用[45]，同時黃酮類中的quercetin由于具有高氧自由基清除活性或者是抑制黃嘌呤氧化酶和脂質(zhì)過氧化的能力，能可靠地增加神經(jīng)元的抵抗力，抑制iNOS和調(diào)節(jié)COX-2的表達(dá)產(chǎn)生抗炎作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[46]。這些有效成分在夏枯草中均為夏枯草的主要有效成分，因而夏枯草可能通過抑制大腦膠質(zhì)細(xì)胞活化所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)以及通過PI3K通路抗腦內(nèi)的氧化應(yīng)激對阿爾茨海默病起到治療作用，這將為夏枯草抗阿爾茨海默病的作用及其機制研究均能有一定的啟發(fā)作用，并為夏枯草抗阿爾茨海默病作用物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制研究提供一個思路。

本研究的結(jié)論依舊存在一定的局限性，由于本研究只依托數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)的檢索來對藥物的功效進(jìn)行預(yù)測，因此，還需要進(jìn)行體內(nèi)體外的實驗研究來驗證。同時，僅以O(shè)B和DL作為活性化合物篩選的指標(biāo)有一定的局限性，因為藥物的吸收利用不只口服這一條途徑，還可做成其他劑型應(yīng)用于臨床，口服生物利用度低的成分需要得到重視，可能存在更廣泛的治療作用。本研究僅為中藥科研提供一個思路，后續(xù)還需通過系統(tǒng)的實驗研究進(jìn)一步證實。