LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型及其細(xì)胞分子機(jī)制研究進(jìn)展

曹康軍，潘亞磊，李引剛

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育) 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712083；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院骨一科，陜西 咸陽(yáng) 712000)

骨質(zhì)疏松癥是一種骨量減少、骨脆性增加、易發(fā)生骨折的慢性代謝性疾病。研究表明，免疫系統(tǒng)功能失常在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，而炎癥是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的直接因素[1-3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分[4]，LPS誘導(dǎo)炎癥模型廣泛應(yīng)用于抗炎、免疫、損傷等的研究[5-6]。近年來(lái)，成功構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型，其細(xì)胞和分子機(jī)制研究也有了新進(jìn)展[7]。作者在此從構(gòu)建方法、細(xì)胞機(jī)制、分子機(jī)制等三方面對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為炎癥導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的臨床治療及新藥研究提供幫助。

1 LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型的構(gòu)建方法

采用LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥多以小鼠為模型。高云兵等[8]在6周齡C57BL/6小鼠顱蓋的矢狀縫局部皮下注射LPS(5 mg·kg-1)，隔天注射1次，28 d后分離顱骨并進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，LPS組小鼠顱骨的骨侵蝕顯著增加，骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁減少，骨丟失較為嚴(yán)重，采用注射器注射LPS雖然方法簡(jiǎn)便、給藥周期短，但對(duì)小鼠的傷害較大。Wei等[9]采用相同的方法注射LPS(5 mg·kg-1)，隔天注射1次，7 d后分離顱骨檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，骨體積分?jǐn)?shù)顯著降低，骨孔數(shù)和孔隙率增加。Kang等[10]對(duì)5周齡雄性小鼠于第1 d和第4 d腹腔注射LPS(5 mg·kg-1),8 d后處死小鼠，micro-CT檢測(cè)顯示股骨骨小梁結(jié)構(gòu)顯著減少，血清酸性磷酸酶測(cè)定結(jié)果顯示破骨細(xì)胞增多。Park等[11]對(duì)小鼠腹腔注射相同濃度的LPS，每周1次，持續(xù)3周，結(jié)果顯示LPS組小鼠的骨密度、骨容量及骨小梁較PBS組明顯減少。另有研究將出生早期雄性小鼠分為L(zhǎng)PS組與對(duì)照組，LPS組腹腔注射LPS(2 mg·kg-1)，持續(xù)5 d，分別于出生2個(gè)月后、4個(gè)月后、8個(gè)月后進(jìn)行全身骨掃描，結(jié)果顯示LPS組的骨量均低于對(duì)照組[12]，表明出生早期注射LPS后造成的骨丟失會(huì)使小鼠成年后骨量減少。

除注射法給予LPS外，Dusad等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，霧化吸入LPS造成肺部炎癥也可導(dǎo)致骨丟失，具體方法為：對(duì)3～4周齡C57BL/6小鼠每日鼻內(nèi)吸入LPS(100 ng)，每周5 d，持續(xù)3周后，經(jīng)骨顯微CT證實(shí)模型構(gòu)建成功。Nelson等[15]采用霧化吸入LPS法構(gòu)建小鼠骨質(zhì)疏松癥模型，并研究該模型對(duì)不同性別小鼠是否具有差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8周齡C57BL/6小鼠每天霧化吸入LPS(100 ng)，持續(xù)3周后，雄性小鼠的骨小梁厚度、密度及數(shù)量下降明顯，但雌性小鼠可能因雌激素的作用未見(jiàn)明顯改變。

LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型具有周期短、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。霧化吸入LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型更適合雄性小鼠， LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型的性別差異性仍需要通過(guò)注射法給予LPS進(jìn)行證實(shí)。

2 LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型的細(xì)胞機(jī)制

近幾年對(duì)骨骼代謝相關(guān)細(xì)胞的研究越來(lái)越多，與骨質(zhì)疏松相關(guān)的細(xì)胞主要有成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨襯細(xì)胞等[16]。在生命活動(dòng)過(guò)程中，骨組織不斷進(jìn)行著重塑，即一方面存在骨吸收和骨溶解，另一方面存在骨形成。破骨細(xì)胞的骨吸收與成骨細(xì)胞的骨形成在骨平衡中扮演著重要角色[17]。破骨細(xì)胞是骨細(xì)胞中唯一具有骨溶解能力的細(xì)胞[18]，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生首先是破骨細(xì)胞的增殖與分化增強(qiáng)，其次伴隨著成骨細(xì)胞分化的減弱，最終形成骨質(zhì)疏松癥[19]。因此，研究LPS對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的影響至關(guān)重要。

王勝利[20]研究了不同濃度LPS對(duì)破骨細(xì)胞分化及成熟破骨細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)能夠促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，且能促進(jìn)已分化的破骨細(xì)胞破骨相關(guān)基因的表達(dá)。曾立等[21]研究了不同濃度LPS對(duì)破骨細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)LPS能提高破骨細(xì)胞活力，且LPS濃度為100 ng·mL-1時(shí)效果最顯著；采用含有LPS的培養(yǎng)基誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，發(fā)現(xiàn)LPS能明顯促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，并增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨溶解能力。

LPS不僅對(duì)破骨細(xì)胞增殖分化具有明顯的促進(jìn)作用，還可以對(duì)成骨細(xì)胞骨架蛋白F-actin造成損傷[22]。LPS對(duì)成骨細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。

3 LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型的分子機(jī)制

研究LPS對(duì)成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞功能相關(guān)分子蛋白的影響有利于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的功能運(yùn)轉(zhuǎn)方式，可進(jìn)一步揭示骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的本質(zhì)，闡明骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)變機(jī)制，為臨床診斷和治療LPS誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥提供更加充足的證據(jù)。

3.1 RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路

LPS可以激活RANKL通路而促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化[23]。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)具有抑制破骨細(xì)胞形成的作用[24]。破骨前體細(xì)胞表面的核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)可以與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor,TNFR)結(jié)合，使NF-κB和JNK被激活，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的增殖分化能力[25-26]。核因子κB受體活化因子配體(RANKL)主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，與RANK結(jié)合促進(jìn)了破骨細(xì)胞的增殖分化[27]。OPG與RANK競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RANKL，且阻斷了RANK/RANKL通路，使破骨細(xì)胞受到抑制。LPS可促進(jìn)破骨細(xì)胞RANK蛋白的表達(dá)，且其濃度為100 ng·mL-1時(shí)效果最好，濃度過(guò)高反而會(huì)抑制RANK表達(dá)[20]。LPS對(duì)小鼠骨細(xì)胞OPG表達(dá)無(wú)顯著影響，但RANK增加后與OPG競(jìng)爭(zhēng)加劇[28]，這可能是LPS在一定濃度下促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化的機(jī)制之一。陳俊[29]研究表明，LPS能促進(jìn)炎癥的發(fā)生，期間NF-κB核蛋白呈高表達(dá)，這也可能是LPS通過(guò)RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖分化的機(jī)制。

3.2 Connexin43蛋白

Connexin43蛋白是縫隙連接蛋白中的一種，其主要作用是介導(dǎo)細(xì)胞之間小分子的物質(zhì)交換[30]，在成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞的小分子物質(zhì)交換中起著重要作用[31]。在LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型中，Connexin43蛋白在成骨細(xì)胞中的表達(dá)降低，而在破骨細(xì)胞中的表達(dá)升高[32]，Connexin43基因缺乏后小鼠骨量減少[33]。曾立等[21]采用Western blot技術(shù)檢測(cè)破骨細(xì)胞中Connexin43蛋白，發(fā)現(xiàn)LPS能促進(jìn)Connexin43蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果也表明LPS能促進(jìn)Connexin43的基因表達(dá)。在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，機(jī)體為了減少破骨細(xì)胞的生成，維持骨動(dòng)態(tài)平衡，Connexin43蛋白表達(dá)會(huì)呈下降趨勢(shì)[34]。另有研究顯示，RANKL對(duì)Connexin43蛋白在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的下降有抑制作用[35]，而LPS可促進(jìn)RANK蛋白的表達(dá)，提示LPS促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖分化可能是通過(guò)RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路與Connexin43蛋白分子交互關(guān)聯(lián)發(fā)揮作用。

3.3 TLR4/NF-κB信號(hào)通路

Toll樣受體4(TLR4)是一種蛋白分子，參與機(jī)體非特異性免疫，具有預(yù)防機(jī)體感染作用。LPS作用于成骨細(xì)胞后會(huì)使其釋放RANK，TLR4與RANK結(jié)合，使得NF-κB上調(diào)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的活性[36]。徐頔等[37]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)，最終使得成骨細(xì)胞活性降低甚至凋亡，影響骨動(dòng)態(tài)平衡。

3.4 其它分子

骨質(zhì)疏松癥患者血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平顯著升高。研究表明，TNF-α通過(guò)刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[38]，進(jìn)而促進(jìn)骨吸收，形成骨質(zhì)疏松癥。LPS作為一種內(nèi)毒素，可以刺激細(xì)胞釋放多種炎癥因子，并促進(jìn)淋巴細(xì)胞等細(xì)胞轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，對(duì)于已經(jīng)成熟的破骨細(xì)胞則具有促進(jìn)其活性的作用[39]。如破骨細(xì)胞前體細(xì)胞在LPS作用下產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α、NO等炎癥因子[29]，以此促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。研究表明，COX-2途徑是另一種重要的調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞增殖分化的途徑[40]，LPS則可以上調(diào)COX-2的基因表達(dá)，以此促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖分化。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，隨著免疫系統(tǒng)失常在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的作用被廣泛證實(shí)，LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型備受關(guān)注。采用注射法或霧化吸入法給予小鼠適量LPS可在短期內(nèi)誘發(fā)明顯的骨質(zhì)疏松癥，并且對(duì)幼鼠造成的骨丟失持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間后仍然不能夠恢復(fù)。采用雄性小鼠造模效果顯著，而采用雌性小鼠造模失敗，因此應(yīng)對(duì)雌性小鼠造模的確切作用及其機(jī)制進(jìn)行深入研究。

細(xì)胞機(jī)制的研究大多集中于LPS對(duì)破骨細(xì)胞的形成及功能的影響。LPS可誘導(dǎo)加速破骨細(xì)胞的增殖分化，提高破骨細(xì)胞活力；LPS可對(duì)成骨細(xì)胞骨架造成損傷。骨質(zhì)疏松癥形成過(guò)程中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的平衡至關(guān)重要，因此應(yīng)研究LPS對(duì)成骨細(xì)胞活力、增殖分化等功能的影響，以揭示LPS對(duì)破骨和成骨平衡的綜合影響。

分子機(jī)制的研究顯示，LPS可調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路、TLR4/NF-κB信號(hào)通路、Connexin43蛋白和TNF-α因子等，而這些都和炎癥發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子NF-κB相關(guān)，初步證實(shí)了LPS是通過(guò)炎癥過(guò)程誘導(dǎo)產(chǎn)生了骨質(zhì)疏松癥。Wnt/β-catenin通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的經(jīng)典通路，此通路能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)骨的成骨功能[41]。LPS能夠通過(guò)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)小鼠肺部及腎損傷[42-43]。LPS是否通過(guò)Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能，可作為后續(xù)研究LPS對(duì)成骨細(xì)胞作用機(jī)制影響的切入點(diǎn)。

盡管對(duì)于LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型在構(gòu)建方法、細(xì)胞機(jī)制和分子機(jī)制研究都需要進(jìn)一步完善，但相信隨著研究的深入，LPS誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)疏松癥模型在炎癥所致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制研究及防治骨質(zhì)疏松癥的抗炎藥物發(fā)掘中將會(huì)發(fā)揮重要的作用。