嵌合抗原受體基因修飾的T細胞治療實體瘤研究進展①

石崇燈 胡 淵 張 彩

(山東大學藥學院免疫藥物學研究所，濟南 250012)

治療癌癥的工程化T細胞的出現(xiàn)標志著醫(yī)學新時代的開始，為癌癥等復雜疾病提供了一種全新的治療方式。目前最受關(guān)注的治療方法之一是在T細胞中引入嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)以產(chǎn)生具有超強抗腫瘤活性的CAR-T細胞。自2010年以來，許多臨床試驗已證明CAR-T細胞用于血液系統(tǒng)腫瘤具有良好的臨床反應，其中急性B淋巴細胞白血病的緩解率高達70%～90%[1]。由于其令人振奮的治療效果，諾華公司的Tisagenlecleucel(KYMRIAH)于2017年8月被美國FDA批準用于復發(fā)性或難治性急性B淋巴細胞白血病，并于2018年5月被批準用于彌散性大B細胞淋巴瘤[2]。

對血液腫瘤治療的成功使得越來越多的研究者將目光集中在CAR-T細胞對實體瘤治療的研究上，但收效甚微。Kershaw等[3]測試了靶向表達α-葉酸受體的卵巢癌細胞的CAR-T細胞的功效(NCT00019136)，在所有的14例患者中都沒有觀察到臨床反應。在一些治療實體瘤的臨床試驗中，CAR-T細胞治療甚至顯示出嚴重的腫瘤外靶向毒副作用。在一項靶向人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor,HER2)治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的臨床研究中，1例患者在接受高劑量CAR-T細胞治療5 d內(nèi)死亡，導致該研究被迫終止。這可能是由于大量CAR-T細胞聚集至肺部，識別正常肺上皮細胞表達的低水平HER2而釋放大量炎癥細胞因子引起級聯(lián)細胞因子風暴，導致急性肺損傷、低血壓及多器官缺血和衰竭[4]。由于類似的原因，一項靶向癌胚抗原相關(guān)的細胞黏附分子5(CEACAM5)的CAR-T細胞治療胃腸道腫瘤的試驗也被終止[5]。本綜述討論與總結(jié)了最新的CAR-T細胞治療實體瘤的研究進展，包括腫瘤特異性抗原的選擇、增強免疫細胞向腫瘤遷移、克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境及與免疫檢查點抑制劑聯(lián)用等新策略以增強CAR-T細胞對實體瘤的療效，希望對臨床前與臨床CAR-T細胞治療實體瘤研究提供新的思路與方向。

1 CAR-T細胞治療實體瘤效果不佳的原因

CAR-T細胞治療急性B細胞淋巴瘤取得出人意料的療效的原因之一是CD19抗原選擇的合理性。針對急性B細胞淋巴瘤，CD19是一個近乎完美的抗原。它幾乎在所有的B細胞淋巴瘤細胞上高表達，除B細胞譜系外，在其它組織或細胞上均沒有表達。其次，B細胞淋巴瘤是一種血液系統(tǒng)腫瘤，腫瘤細胞會在外周血與淋巴系統(tǒng)中循環(huán)，這有利于CAR-T細胞與腫瘤細胞相遇，進而消滅腫瘤細胞。

相對于血液瘤，實體瘤的組織微環(huán)境特點限制了CAR-T細胞的療效。首先，實體瘤腫瘤細胞的異質(zhì)性更加復雜，特異性高與安全性好的靶點選擇更加困難。按照腫瘤抗原的特異性，可將腫瘤抗原分為腫瘤特異性抗原(tumor-specific antigens,TSA)和腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigens,TAA)。TSA指僅表達于腫瘤細胞而不存在于正常細胞的抗原。TAA是指非腫瘤細胞所特有，在正常細胞上也有微量表達，只是在細胞發(fā)生癌變時表達量明顯增加的一類抗原。實際上，大多數(shù)正在進行的針對實體瘤CAR-T細胞療法臨床試驗都針對這樣的TAA，包括間皮素(mesothelin,MSLN)、HER2、癌胚抗原、白細胞介素-13受體亞基α-2( IL-13 Receptor alpha 2,IL-13Rα2)、前列腺特異膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)和前列腺干細胞抗原等[6,7]。因此CAR-T細胞在實體瘤的臨床治療中可能出現(xiàn)明顯的脫靶效應。并且，經(jīng)CAR-T細胞治療后，實體腫瘤由于壓力選擇而使抗原表達轉(zhuǎn)陰，從而逃逸CAR-T細胞的特異性識別[8,9]。將靶向HER2的CAR-T細胞與膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U373共培養(yǎng)的實驗證實了這一現(xiàn)象，起初U373細胞只表達HER2的比例為18%，只表達IL-13Rα2抗原的比例為16%，兩種抗原均表達的比例為52%，約有14%的細胞這兩種抗原均不表達。抗HER2-CAR-T細胞與U373細胞共培養(yǎng)至14 d時，98%的U373細胞只表達IL-13Rα2而未檢測到HER2的表達[10]。

腫瘤周圍存在許多屏障組織，并缺乏趨化因子分泌，這使得CAR-T細胞難以浸潤至腫瘤內(nèi)部。實體瘤的一個特點是基質(zhì)細胞中含有大量的腫瘤相關(guān)成纖維細胞。這些細胞通過分泌膠原蛋白，形成致密的腫瘤組織，導致腫瘤內(nèi)間質(zhì)壓的異常升高，成為阻擋CAR-T細胞浸潤的物理屏障。異常的歸巢分子表達和腫瘤血管系統(tǒng)也使T細胞難以滲入腫瘤組織并發(fā)揮其效應功能[11,12]。

即使有部分CAR-T細胞到達腫瘤內(nèi)，它們也將面臨抑制性腫瘤微環(huán)境的挑戰(zhàn)。腫瘤細胞通過產(chǎn)生和分泌IL-1、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和前列腺素E2等細胞因子來塑造腫瘤微環(huán)境，這些細胞因子可通過募集免疫抑制性細胞直接或間接抑制T細胞功能[13]。由于缺氧、低營養(yǎng)成分及高濃度代謝酸的腫瘤組織微環(huán)境抑制T細胞正常代謝，導致T細胞無法增殖與分泌細胞因子[14]。腫瘤微環(huán)境高表達程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)、細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)等免疫抑制性受體(免疫卡控點)的配體，可與浸潤的T細胞表面抑制性受體結(jié)合進而抑制T細胞功能。因此，CAR-T細胞在抑制性腫瘤微環(huán)境中功能往往被顯著抑制[15]。

2 目前CAR-T細胞在治療實體瘤的研究進展

2.1靶點選擇 對實體瘤進行CAR-T細胞療法的最大挑戰(zhàn)是需要找到完美的靶抗原。甄選目標抗原需在安全性與有效性之間找到平衡點，以提供足夠的CAR-T細胞活性并使毒副作用最小化。首先應該解決CAR-T在實體瘤治療過程中因脫靶效應所引起的安全性問題。已有策略設(shè)計串聯(lián)型 CAR，通過對同一細胞表達的兩種腫瘤抗原的雙重識別來確保靶抗原選擇的特異性[16]，或設(shè)計抑制型CAR，識別腫瘤上不存在或下調(diào)但由脫靶組織表達的組織特異性靶抗原以避免對正常組織的損傷[17]。但這些策略不能從根本上改善CAR-T細胞的安全性，因此腫瘤特異性抗原靶點的尋找十分關(guān)鍵。

TSA的篩選主要是針對新抗原與腫瘤相關(guān)抗原表位轉(zhuǎn)錄后修飾突變的研究。非人類正?；蚪M來源的腫瘤新生抗原由基因組發(fā)生突變而產(chǎn)生，未經(jīng)胸腺陰性篩選，與TCR親和力高，免疫原性強，能誘發(fā)強有力的抗腫瘤免疫反應[18]。近幾年多項臨床研究結(jié)果均顯示，腫瘤特異性新抗原是腫瘤浸潤淋巴細胞、免疫卡控點阻斷劑等發(fā)揮免疫治療作用的主要靶點，且較高的腫瘤突變負荷與較好的臨床免疫療效密切相關(guān)，因此，新抗原被認為是包括CAR-T療法的腫瘤免疫治療十分理想的靶點[19,20]。表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)為人腫瘤中發(fā)現(xiàn)的最為常見的EGFR突變體，它源于自刪除表達框2至7外顯子外顯子1和8連接處產(chǎn)生新的甘氨酸殘基，而人體正常細胞不會表達EGFRvⅢ。對10名復發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤患者進行靶向EGFRvⅢ 的CAR-T細胞治療后，均未觀察到脫靶效應或者細胞因子釋放綜合征[21]。但新抗原在不同個體之間存在巨大差異，因而鑒定一個能在不同個體之間通用的新抗原是十分困難的。

腫瘤相關(guān)抗原的表位受轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控，例如糖基化與構(gòu)象改變等。利用現(xiàn)有龐大的抗體庫與蛋白質(zhì)組學分析，尋找靶點抗原在腫瘤與正常組織上特定表位的差異，可特異性靶向該表位，使CAR-T細胞能區(qū)分腫瘤與正常組織。Hosen等[22]利用不同多發(fā)性骨髓瘤細胞系建立了超過10 000種雜交瘤抗體庫。將不同抗體與病人來源的多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細胞或正常白細胞或非MM細胞染色，篩選出MMG49抗體只特異性結(jié)合MM。研究發(fā)現(xiàn)該單抗特異性識別活化性的整合素β7的N端區(qū)域，且該表位只在活化型構(gòu)像時暴露，而靜息時隱藏。基于MMG49抗體的CAR-T細胞不對正常細胞造成損傷，而是展現(xiàn)出良好的抗腫瘤效應。

2.2增強CAR-T細胞浸潤至腫瘤組織內(nèi)部的能力 腫瘤組織血管結(jié)構(gòu)功能缺陷且富含細胞外基質(zhì)，猶如堅實的壁壘使免疫細胞難以有效浸潤[11,23]。 除此之外，腫瘤組織中黏附分子表達下調(diào)、趨化因子及其受體表達失調(diào)等因素也限制了免疫細胞在腫瘤組織中的聚集。

為增加CAR-T細胞向腫瘤的浸潤，首先應突破腫瘤的物理屏障。已有許多研究通過設(shè)計靶向周圍成纖維細胞、腫瘤血管系統(tǒng)及腫瘤基質(zhì)的CAR-T細胞來突破腫瘤屏障[24-27]。設(shè)計表達趨化因子或趨化因子受體的CAR-T細胞可以促進其向腫瘤內(nèi)部的浸潤。例如，將趨化因子受體CCR2引入靶向MSLN和GD2的CAR-T細胞中，可明顯增強T細胞的浸潤并增強CAR-T細胞的抗腫瘤活性[28,29]。

此外，有研究者從T細胞自身特性出發(fā)，尋找特定的高遷移性、高殺傷能力的T細胞亞群。研究發(fā)現(xiàn)人類CD26high的T細胞亞群具有更強的遷移能力、抗凋亡能力、細胞毒作用與干細胞特性，使得這群細胞更易向腫瘤內(nèi)浸潤，并具有更強的腫瘤內(nèi)存活能力。這些特性使得CD26high的T細胞亞群有希望成為一群十分理想的針對實體瘤的CAR-T細胞來源[30]。轉(zhuǎn)錄因子Runx3能夠編碼促進CD8+T細胞在非淋巴組織和腫瘤中的駐留[31]。相比于引入某個單一的趨化因子受體，在CAR結(jié)構(gòu)中引入關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子能從根本上提高CAR-T細胞的遷移能力。

2.3針對腫瘤微環(huán)境 即使CAR-T細胞成功地遷移到腫瘤部位，腫瘤微環(huán)境的許多免疫抑制因素可能抑制其功能，甚至導致其發(fā)生功能耗竭。腫瘤微環(huán)境中抑制性細胞能夠通過多種機制抑制免疫效應細胞活性，包括通過細胞與細胞間的接觸抑制和抑制性因子的釋放。腫瘤細胞通過產(chǎn)生和分泌各種抑制性細胞因子來塑造腫瘤微環(huán)境，這些細胞因子可以進一步募集免疫抑制性細胞到腫瘤部位，直接或間接抑制T細胞功能[13]。腫瘤微環(huán)境的免疫抑制是限制CAR-T療效的一大挑戰(zhàn)，研究人員已經(jīng)研發(fā)了不同的策略來改善CAR-T細胞功能以克服對抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。

腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細胞，包括調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、髓源性抑制細胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)和腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAM)。為了克服抑制性免疫細胞的作用，已有研究設(shè)計同時靶向腫瘤細胞和免疫抑制性細胞的CAR-T細胞。Ruella等[32]發(fā)現(xiàn)CD123在TAM和霍奇金淋巴瘤細胞均有表達，靶向CD123的CAR-T細胞能夠識別并殺傷TAM來克服腫瘤微環(huán)境的抑制，并發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷，并且在小鼠模型中還觀察到了長期的免疫記憶。

為了消除腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性細胞因子的抑制作用，Chmielewski等[33]將細胞因子基因插入到CAR結(jié)構(gòu)中制備了能夠產(chǎn)生特定細胞因子的TRUCKs(T cells redirected for universal cytokine killing)，其可在CAR介導的T細胞活化后釋放特定的細胞因子。如分泌IL-12的CAR-T細胞可通過Fas-FasL相互作用清除高抑制性腫瘤相關(guān)巨噬細胞來逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的抑制，并且可抵抗PD1-PD-L1信號傳導軸的抑制。迄今為止，TRUCK設(shè)計中已采用了多種細胞因子，包括IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和TNFRSF14[34-38]。

另一方面，也有研究利用細胞因子信號通路的方式促進CAR-T細胞活化增殖。將白細胞介素-2受體β鏈的胞內(nèi)段與CAR共刺激結(jié)構(gòu)域CD28和胞內(nèi)CD3z段連接，并將STAT3的結(jié)合基序YXXQ結(jié)合在CD3z C端，當CAR胞外段scFv與抗原識別后即可激活JAK-STAT3/5信號通路從而激活CAR-T細胞。因此，無需細胞因子作用，CAR-T細胞就可以獲得類似的活化效應[39]。與TRUCKs相比，這種策略不分泌細胞因子，可避免因細胞因子持續(xù)過度釋放而導致的細胞因子釋放綜合征及神經(jīng)毒性等副作用。

值得注意的是腫瘤微環(huán)境中抑制性細胞因子占優(yōu)勢。例如，腫瘤內(nèi)富含TGF-β，這是Treg分化和維持T細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵細胞因子[40]。有研究者針對此特點設(shè)計了能夠阻斷抑制性信號的受體分子。dnTGF-β受體是一種缺失TGF-β受體胞內(nèi)信號段的TGF-β受體，當其與TGF-β結(jié)合后，由于缺乏胞內(nèi)信號段而無法向下游傳遞信號，TGF-β信號被阻斷。靶向PSMA的CAR與dnTGF-β 受體共表達的CAR-T細胞在高分泌TGF-β的前列腺癌動物模型中展示出了優(yōu)異的抗腫瘤活性[41]。此外，有研究者將抑制性細胞因子受體的胞外段與活化性細胞因子受體的胞內(nèi)段融合，將抑制性信號轉(zhuǎn)化為活化性信號，以增強CAR-T細胞功效。研究者將IL-4受體的胞外段與IL-2或IL-7受體的胞內(nèi)段嵌合，當其與腫瘤微環(huán)境中的IL-4結(jié)合后可產(chǎn)生模擬IL-2或IL-7受體的活性信號，將其與CAR共同裝載在T細胞上，可將腫瘤IL-4介導的內(nèi)抑制性信號轉(zhuǎn)化為CAR-T細胞活化信號，從而抵抗腫瘤微環(huán)境的抑制[42,43]。

2.4CAR-T細胞治療與其他方法聯(lián)合使用

2.4.1與免疫卡控點阻斷聯(lián)合應用 克服免疫抑制并產(chǎn)生更強大的抗腫瘤免疫反應的一個有效策略是將CAR-T細胞和免疫卡控點的單克隆抗體聯(lián)合應用。在臨床前治療模型中，抗PD1及抗CTLA-4單克隆抗體的聯(lián)用可以阻斷這些PD-1和CTLA-4介導的抑制作用，并增強CAR-T細胞的功能[44-46]。臨床上已證實，與抗PD-1單克隆抗體聯(lián)合使用的HER2-CAR-T細胞在乳腺癌和肉瘤的治療中已顯示出更強的增殖能力和抗腫瘤效應[46]。

2.4.2新型基因編輯工具 新型基因編輯工具豐富了CAR-T細胞策略，以改善其功能。例如，鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶和CRISPR/Cas9等基因編輯工具可用于敲除基因，也可以在精心設(shè)計的供體模板存在情況下將遺傳信息敲入基因組中。Eyquem等[47]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將CAR基因敲入T細胞受體α恒定基因座，這不僅使得T細胞表達統(tǒng)一的CAR分子，而且增強了CAR-T細胞的抗腫瘤能力，延緩了CAR-T細胞的分化與耗竭。有研究者利用基因組編輯技術(shù)敲除PD-1、CTLA-4和LAG-3等抑制性受體，來改善CAR-T細胞的抗腫瘤活性[48-50]。已證實，敲除PD-1的CAR-T細胞能明顯抵抗來自PD-L1+腫瘤細胞的抑制，更有效地清除荷瘤小鼠的腫瘤[48]。

2.4.3溶瘤病毒 溶瘤病毒(oncolytic virus,OVs)通過感染癌細胞,引起病毒性細胞病變并誘發(fā)宿主抗腫瘤免疫反應，從而選擇性感染和殺死癌細胞。目前，表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的溶瘤皰疹病毒已被FDA批準用于惡性黑素瘤的治療[51]。通過對OV進行編程可以特異性地靶向、在癌細胞中復制和裂解癌細胞，而不影響正常細胞。OV在腫瘤細胞中復制和繁殖可直接導致腫瘤細胞的裂解，同時亦為喚醒免疫系統(tǒng)提供必需的危險信號[52]。通過對OV進基因修飾使之表達能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境、增強療效的治療性基因(如細胞因子、趨化因子、抗PD-L1微小抗體等)并可與CAR-T細胞療法聯(lián)合治療。最近的一項研究證明，表達IL-2和TNF-α的溶瘤腺病毒能夠增強靶向間皮素的CAR-T細胞對胰腺導管癌的療效，這與增強T細胞浸潤到腫瘤部位和減少腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)[53]。

3 展望

已經(jīng)證明CAR-T細胞對血液腫瘤具有強大的治療作用，但其對于實體瘤治療的應用仍處于早期發(fā)展階段，仍然有許多問題有待解決。T細胞作為一群異質(zhì)性的細胞群，其中是否存在更合適的T細胞亞群作為CAR的宿主細胞？是否有更佳的CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計可以抵抗抑制性的腫瘤微環(huán)境？是否不同藥物聯(lián)合治療、序貫治療等方式能增強CAR-T細胞治療的效果？隨著這些問題的研究與解決，CAR-T細胞治療實體瘤的進展將取得更大的突破。