FTY-720通過(guò)S1P1受體調(diào)節(jié)哮喘小鼠氣道炎癥①

劉函曄 劉衛(wèi)東 陳正愛(ài) 高 歌 延光海 張婧瑤 崔 弘

(延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,延吉 133002)

近年哮喘的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，威脅世界3億人口，主要特征為持續(xù)氣道炎癥和氣道壁重塑體積為上皮細(xì)胞脫落、杯狀細(xì)胞增生、氣道平滑肌束增生和肥大、基底膜增厚和血管密度增加等病理變化。變應(yīng)原反復(fù)刺激產(chǎn)生的炎癥通過(guò)加重氣道平滑肌病理變化加重哮喘，與慢性阻塞性肺疾病(COPD)相似，部分哮喘患者由于氣道重塑、黏膜及平滑肌增厚引起氣流受限導(dǎo)致死亡[1]。

鞘氨醇1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)通過(guò)5種G蛋白偶聯(lián)受體S1P1-5參與細(xì)胞增殖、凋亡、淋巴細(xì)胞流出、內(nèi)皮屏障功能、血管生成和炎癥等細(xì)胞過(guò)程。研究表明S1P是肥大細(xì)胞的鞘脂代謝產(chǎn)物，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化，肥大細(xì)胞激活后脫顆粒并釋放生物活性物質(zhì)，導(dǎo)致哮喘[2]。另外，S1P是淋巴細(xì)胞從次級(jí)淋巴器官進(jìn)入體循環(huán)的主要調(diào)節(jié)劑，隨著哮喘病程延長(zhǎng)，血清S1P水平顯著升高[3]。

FTY-720是治療多發(fā)性硬化癥的藥物，是S1P受體激動(dòng)劑，可與除S1PR2外的所有S1PRs結(jié)合[4]。FTY-720磷酸化后結(jié)構(gòu)與S1P結(jié)構(gòu)相似，與S1P競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合S1P1受體，阻斷S1P1下游促炎通路，但S1P對(duì)哮喘的作用機(jī)制尚未明確。本研究以O(shè)VA誘導(dǎo)小鼠哮喘模型，探究FTY-720對(duì)S1P1的作用及其在哮喘小鼠中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 OVA、氫氧化鋁混懸液(美國(guó)Sigma公司)，IL-4、IL-5、IgE(美國(guó)Invitrogen公司),全蛋白提取試劑盒、AB-PAS染色試劑盒(北京索萊寶公司)，S1P1、Wnt1、Phospho-RAC1-S71(美國(guó)Santa Cruz公司)，β-actin、P38-MAPK(美國(guó)Cell Signaling公司)，F(xiàn)TY-720(美國(guó)Cell Signaling公司)；402型超聲霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠)，RT-2100C酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Rayto公司)，電泳儀、Western blot轉(zhuǎn)膜儀和Gel Doc凝膠成像儀(Bio Rad公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組:正常組、模型組、治療組，每組10只，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1哮喘模型建立 除正常組外，模型組和治療組第0、7、14天腹腔注射0.05 g OVA和0.56 ml Al(OH)3溶于200 μl生理鹽水。第21天起，將0.1 g OVA溶于10 ml生理鹽水中激發(fā)30 min，共激發(fā)5天。第19天起連續(xù)給藥7 d，第21天至第25天在激發(fā)前30 min腹腔注射FTY-720(2 mg/kg)200 μl。

1.2.2樣本獲取與處理 最后一次激發(fā)24 h后，乙醚麻醉小鼠并眼球取血，室溫放置3 h后4℃1 500 r/min 離心15 min，取上清，-80℃儲(chǔ)存待用。以生理鹽水1 ml進(jìn)行肺部灌洗，取支氣管肺泡灌洗液(0.8 ml以上為合格)。取小鼠左肺于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片；右肺進(jìn)行勻漿處理，并進(jìn)行蛋白提取，-80℃儲(chǔ)存待用。

1.2.3HE、AB-PAS染色 將組織石蠟塊切成4 μm 切片，脫蠟處理進(jìn)行常規(guī)HE染色；中性樹(shù)膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺組織病理學(xué)變化。AB-PAS染色，觀察肺組織氣管周圍杯狀細(xì)胞含量變化。HE染色分析肺組織病理學(xué)變化。

1.2.4血清IgE含量檢測(cè) 血清室溫平衡2 h，ELISA檢測(cè)版室溫平衡30 min后每孔加入檢測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)試劑，加入檢測(cè)試劑檢測(cè)。加入TMB顯色液，100 μl/孔避光30 min，加入終止液。酶標(biāo)儀于562 nm處檢測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

1.2.5BALF中IL-1、IL-4、IL-5檢測(cè) 眼球取血后處死小鼠，氣管插管注入1 ml生理鹽水，輕壓小鼠胸部，回吸灌洗液(>80%為合格)，4℃ 1 500 r/min離心5 min，取上清，ELISA檢測(cè)BALF中IL-1、IL-4、IL-5含量。

1.2.6肺組織中S1P1、Wnt1、p-RAC1、p-P38-MAPK含量檢測(cè) 肺組織勻漿后提取蛋白并進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，對(duì)肺組織中S1P1、Wnt1、p-RAC1、p-P38-MAPK等蛋白進(jìn)行半定量檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1FTY-720抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘 與正常組相比，模型組小鼠氣管周圍有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管壁明顯變厚；FTY-720處理后，哮喘小鼠病理狀況明顯改善。AB-PAS染色后，模型組小鼠氣管壁上有明顯杯狀細(xì)胞增生，F(xiàn)TY-720處理后杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少。說(shuō)明FTY-720抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘的發(fā)生發(fā)展(圖1)。

2.2FTY-720降低哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞含量 模型組總細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯升高，F(xiàn)TY-720處理后，小鼠BALF中OVA誘導(dǎo)增多的總細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低(圖2)。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)染色結(jié)果(×200)Fig.1 Pathological staining results of lung tissue in each group of mice(×200)

圖2 BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量Fig.2 Numbers of inflammatory cells in BALF

圖3 FTY-720對(duì)BALF中炎癥因子水平及血清IgE含量的影響Fig.3 Effect of FTY-720 on inflammatory factors in BALF and IgE content in serum

圖4 FTY-720對(duì)S1P1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of FTY-720 on S1P1 protein expressions

圖5 FTY-720對(duì)WNT1，RAC1，P38-MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of FTY-720 on expressions of WNT1,RAC1 and P38-MAPK proteins

2.3FTY-720降低BALF中炎癥因子及血清IgE含量 與對(duì)照組相比，OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠BALF中IL-1、IL-4、IL-5含量明顯升高，F(xiàn)TY-720處理后，細(xì)胞因子含量顯著降低。OVA誘導(dǎo)提高小鼠血清IgE含量，F(xiàn)TY-720處理后IgE水平顯著降低(圖3)。

2.4FTY-720競(jìng)爭(zhēng)性抑制S1P1表達(dá) 結(jié)果顯示，給予FTY-720后S1P1表達(dá)降低，表明FTY-720競(jìng)爭(zhēng)性拮抗S1P1受體表達(dá)(圖4)。

2.5FTY-720抑制WNT1、RAC1、P38-MAPK的磷酸化 OVA誘導(dǎo)增加小鼠肺組織WNT1、RAC1、P38-MAPK磷酸化水平，F(xiàn)TY-720處理后WNT1、RAC1、P38-MAPK磷酸化水平顯著降低(圖5)。

3 討論

哮喘由遺傳因素與環(huán)境因素(如空氣過(guò)敏原和呼吸道病毒)共同引起。在氣道內(nèi)腔內(nèi)，過(guò)敏原可被樹(shù)突狀細(xì)胞捕獲，處理抗原分子，并將其呈現(xiàn)為輔助T(Th0)細(xì)胞。過(guò)敏原特異性激活Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4和IL-13，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體；釋放IL-5誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞成熟[5]。除Th2細(xì)胞外，IL-9釋放的Th9細(xì)胞被激活后導(dǎo)致肥大細(xì)胞生長(zhǎng)和募集，在IgE依賴性脫粒釋放中發(fā)揮預(yù)形成作用和合成新介質(zhì)。多種介質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等作用于慢性哮喘細(xì)胞，產(chǎn)生作用物影響包括上皮在內(nèi)的氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)的功能和增殖速度[6]。

Wnt家族由多種糖蛋白組成，具有高度保守的半胱氨酸殘基。Wnt 信號(hào)途徑在細(xì)胞間呈現(xiàn)自分泌和旁分泌兩種信號(hào)傳導(dǎo)方式，同S1P生物學(xué)功能相似，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、形態(tài)發(fā)生和發(fā)育等多種生物學(xué)活動(dòng)[7]。在肺部疾病中Wnt可激活TGF-β通路，引發(fā)肺纖維化[8]。研究表明WNT5A通過(guò)RAC和JNK通過(guò)不依賴于增殖的WNT信號(hào)誘導(dǎo)形成延長(zhǎng)的淋巴網(wǎng)絡(luò)，參與炎癥反應(yīng)[9]。RAC1在哮喘中起重要作用，敲低RAC1導(dǎo)致抗炎因子水平下降，影響上皮細(xì)胞的吞噬作用。P38-MAPK是MAPKs的亞群，與JNK通路相似，可被促炎因子如TNFα、IL-1等激活，或被脂多糖及G+細(xì)菌細(xì)胞壁成分激活。研究表明p38-MAPK參與哮喘炎癥表達(dá)，可通過(guò)p38-MAPK/PI3K信號(hào)通路被抑制[10,11]。

盡管S1P與WNT等信號(hào)通路均有研究，但在哮喘中S1P與WNT的作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)給予FTY-720，發(fā)現(xiàn)S1P1受體表達(dá)可抑制哮喘炎癥及改善病理狀態(tài)；FTY-720處理后WNT、RAC1等蛋白含量明顯減少，證明S1P可通過(guò)S1P1受體調(diào)控WNT通路，并通過(guò)抑制RAC1緩解哮喘。進(jìn)一步檢測(cè)MAPK通路中的P38-MAPK，P38-MAPK含量減少并可進(jìn)一步激活NF-κB等通路，進(jìn)一步抑制哮喘的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，F(xiàn)TY-720可抑制WNT通路，并通過(guò)抑制S1P1/WNT1/RAC1/P38-MAPK通路改善哮喘的炎癥反應(yīng)，改善肺組織病理變化。