綿羊紅細(xì)胞溶血素制備方法的改進(jìn)及其在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用①

孫元杰 國(guó) 航 唐 康 馬 櫻 張春梅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,西安 710032)

在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，溶血素參與的溶血實(shí)驗(yàn)常作為補(bǔ)體系統(tǒng)中起到重要生物學(xué)功能的溶細(xì)胞的一個(gè)教學(xué)實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)有教學(xué)組用不同動(dòng)物紅細(xì)胞制備溶血素，并對(duì)溶血實(shí)驗(yàn)的效果進(jìn)行了對(duì)比[1,2]。本教研室曾用全細(xì)胞加佐劑免疫小鼠的方法，用免疫組織化學(xué)方法篩選針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的抗體，發(fā)現(xiàn)全細(xì)胞加佐劑組篩選到陽(yáng)性抗體的比率明顯增加。據(jù)此，本文嘗試用綿羊紅細(xì)胞(sheep red blood cell，SRBC)加佐劑方法免疫家兔制備溶血素，發(fā)現(xiàn)其ELISA效價(jià)和溶血效價(jià)均明顯高于常規(guī)SRBC經(jīng)耳緣靜脈免疫組，并在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中取得滿意效果。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料與試劑 酶標(biāo)板購(gòu)自康寧公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自伯樂公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色劑購(gòu)自碧云天生物公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自Sigma公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物均由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。新西蘭家兔4只,雌性,體重2～3 kg/只，隨機(jī)分為A、B兩組,每組2只。豚鼠心臟取血分離新鮮血清，將3只豚鼠血清混合作為補(bǔ)體來源。

1.2方法

1.2.1SRBC懸液制備 選用健康綿羊，頸靜脈無菌取血，將羊血放入有玻璃珠的無菌三角燒瓶中，同一方向均勻用力搖動(dòng)，充分混合，去除纖維蛋白,直至血液不會(huì)凝固。將抗凝血置離心管中，2 000 r/min，離心5 min，用生理鹽水洗滌5次后,配成20%或10% SRBC懸液,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫方案 A組(常規(guī)耳緣靜脈注射組) 首次劑量為每只家兔1 ml 20% SRBC懸液，第2～5次采用10% SRBC，每次間隔6 d，末次注射后第7天取免疫兔血，分離血清檢測(cè)效價(jià)。B組首次劑量1 ml 20% SRBC懸液和1 ml完全弗氏佐劑混合，制備成“油包水”乳狀液，2 ml/只家兔，腋下多點(diǎn)注射，第2～5次免疫用10% SRBC和不完全弗氏佐劑體積按1∶1混合制備成“油包水”乳狀液，2 ml/(只·次)，注射次數(shù)和間隔時(shí)間同A組(見表1)。

1.2.3免疫血清效價(jià)的檢測(cè) 于末次免疫后一周進(jìn)行兔頸動(dòng)脈無菌取血，4℃冰箱過夜，次日收集血清，分裝，置于-80℃冰箱保存。采用補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)和間接ELISA方法分別檢測(cè)兩種不同免疫方案所制備的免疫血清效價(jià)。

1.2.4溶血實(shí)驗(yàn) 溶血素稀釋度及各種試劑的量，見表2。

1.2.5間接ELISA測(cè)定免疫血清效價(jià) 用包被緩沖液將抗原(10% SRBC懸液反復(fù)凍融5次)1∶100稀釋，100 μl/孔加入ELISA板，加封口膜后置4℃過夜。用PBST緩沖液洗板3次后，每孔加入1% BSA封閉液200 μl，37℃孵育。PBST洗滌3次，依次加入倍比稀釋的免疫兔血清(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000和1∶512 000)，100 μl/孔，置于 37℃孵育1 h，PBST洗滌5次，甩干后，加入1∶1 000 稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG 100 μl(同上孵育及洗滌)，加入TMB底物顯色液，100 μl/孔，37℃避光反應(yīng)20 min后，450 nm處讀取結(jié)果。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照孔。

表1 A 組、B 組制備家兔SRBC溶血素的免疫方案

表2 溶血素效價(jià)的測(cè)定

2 結(jié)果

2.1兩種免疫方法溶血素效價(jià)的比較 A組家兔溶血素效均價(jià)為1∶800；B組溶血素效價(jià)均為1∶3 200。B組溶血素比A組效價(jià)高4倍(見表3)。

2.2兩種免疫血清間接ELISA效價(jià)的比較 經(jīng)間接ELISA檢測(cè)免疫家兔的效價(jià)，A組效價(jià)均為1∶64 000，B組效價(jià)均為1∶256 000。見表4。

表3 兩組溶血素效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

表4 兩組溶血素ELISA的測(cè)定結(jié)果

3 討論

補(bǔ)體參與的溶血實(shí)驗(yàn)是以綿羊紅細(xì)胞為抗原，在體外與相應(yīng)的IgG和/或IgM抗體(溶血素)結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，在紅細(xì)胞膜上形成攻膜復(fù)合物(MAC)，引起紅細(xì)胞的溶破，發(fā)生溶血反應(yīng)。由于該實(shí)驗(yàn)可驗(yàn)證補(bǔ)體細(xì)胞毒的生物學(xué)功能，并與臨床上常見的輸血反應(yīng)、新生兒溶血癥和自身免疫性溶血性貧血密切相關(guān)，成為醫(yī)學(xué)免疫學(xué)中經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)之一。采用SRBC懸液作為抗原，經(jīng)耳緣靜脈免疫家兔制備溶血素是經(jīng)典的制備溶血素方法[3]。本實(shí)驗(yàn)室單抗平臺(tái)研究組在制備抗腫瘤相關(guān)抗原抗體的免疫過程中，設(shè)計(jì)了完整細(xì)胞加佐劑免疫組，其獲得陽(yáng)性克隆的比例明顯高于單純細(xì)胞免疫組。受此啟發(fā)，本研究以常規(guī)耳緣靜脈免疫途徑制備溶血素方法為對(duì)照，采用SRBC懸液加佐劑免疫方法制備溶血素，通過比較溶血實(shí)驗(yàn)和間接ELISA兩種方法，得出結(jié)果，加佐劑免疫方法比常規(guī)方法制備溶血素效價(jià)高4倍，值得推廣。溶血素效價(jià)的判斷可能和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有關(guān)。李洱花等[1]和張淑莉等[4]溶血試驗(yàn)中采用0.1 ml 1% SRBC抗原檢測(cè)溶血素效價(jià)達(dá)到1∶4 800和1∶3 000。為了方便學(xué)生觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本溶血實(shí)驗(yàn)采用0.2 ml 2% SRBC作為抗原，抗原量比有些院校的溶血實(shí)驗(yàn)高4倍，這可能是SRBC懸液經(jīng)耳緣靜脈免疫家兔制備溶血素造成效價(jià)差別的原因。