抗菌肽B-13 對初生仔豬生長性能、小腸結(jié)構(gòu)及盲腸微生物的影響

梁秀麗 ，馬發(fā)順，韓方方，連凱琪，王世瓊，魏戰(zhàn)勇*，張文舉

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽 455000；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450000）

抗菌肽（Antibacterial peptides，ABPs）又稱抗微生物肽（Antimicrobialpeptides，AMPs）或肽抗生素（Peptideantibiotics），是生物機體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)（Defense Response）過程中所產(chǎn)生的一類抗微生物的短肽（Antimicrobialand Malignant Small Peptides），與干擾素、補體等組成了宿主的免疫防御系統(tǒng)[1]。抗菌肽對絕大多數(shù)的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有顯著的抗菌作用[2-4]，對病毒[5]、真菌[6]、寄生蟲[7]也有一定的殺傷作用，此外還有調(diào)節(jié)免疫功能[8]及抑制或殺傷腫瘤細胞[9]等作用?？咕木哂蟹肿恿啃?、水溶性好、耐熱、無免疫原性等特點。近幾年由于抗生素的一系列副作用和人們對食品安全的高要求，迫切需要抗生素替代物，因此抗菌肽正逐步地應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)?？咕脑谧胸i生產(chǎn)上的應(yīng)用較多[10]。麻延峰等[11]研究表明，與對照組和抗生素組相比，日糧中添加抗菌肽制劑可顯著提高仔豬平均日增重，降低腹瀉率；劉丁健等[12]在基礎(chǔ)日糧中添加抗菌肽顯著提高了仔豬生產(chǎn)性能和健康水平；李方方等[13]和肖發(fā)沂等[14]在斷奶仔豬日糧中添加抗菌肽均提高了仔豬的生長性能和免疫力。目前的研究多集中在抗菌肽對斷奶仔豬的影響，對初生仔豬研究較少，且很少有病毒感染方面的研究。本試驗研究以初生仔豬為試驗動物，在攻毒和未攻毒情況下觀察抗菌肽B-13（APB-13）對其生產(chǎn)性能及小腸形態(tài)發(fā)育、盲腸微生物的影響，為抗菌肽更為廣泛地應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗菌肽、基礎(chǔ)日糧及病毒 APB-13 為來源于牛源抗菌肽序列（ILPWKWPWWPWRR），分子量為1.6 ku，由上海吉爾生化有限公司合成，純度98%。初生仔豬基礎(chǔ)日糧為北京愛地科技有限公司生產(chǎn)的代乳粉，其營養(yǎng)成分見表1。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏戰(zhàn)勇教授惠贈。

表1 仔豬基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)成分

1.2 試驗設(shè)計 試驗用初生4 d、體重約1.6 kg 的杜洛克×長白×大白健康仔豬36 頭，公、母各半，購于河南安陽某種豬場。將仔豬隨機分為4 處理組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)3 頭仔豬。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧不加肽不攻毒，TGEV 組飼喂基礎(chǔ)日糧不加肽TGEV 攻毒，APB-13 組飼喂基礎(chǔ)日糧+10 g/kg BW 抗菌肽不攻毒，APB-13+TGEV 組飼喂基礎(chǔ)日糧+10 g/kg BW 抗菌肽并TGEV 攻毒。TGEV 組和APB-13+TGEV 組攻毒時間為仔豬出生第6 天20:00，TGEV（TCID50=108）攻毒量是10 mL/頭。攻毒后觀察4 d 屠宰。

1.3 飼養(yǎng)管理 按照仔豬常規(guī)飼養(yǎng)管理方法進行，從購買仔豬開始飼喂代乳粉和APB-13，用40～50℃溫水按6 L/kg 比例稀釋代乳粉，APB-13 按照10 g/kg BW 添加到代乳粉中。每3 h 喂1 次代乳粉，每2 h 喂1 次溫水。對照組和APB-13 組、TGEV 組、APB-13+TGEV 組分別在不同的實驗動物房，每個重復(fù)3 頭仔豬1 個豬欄，由2 位專職人員分別管理以防止病原傳染。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能 以重復(fù)為單位記錄仔豬每天的投料量和余料量，計算平均日采食量（ADFI）。仔豬出生第4、7、11 天08:00 稱量體重，以重復(fù)為單位計算仔豬平均日增重（ADG）。根據(jù)試驗期內(nèi)的總耗料量和總增重計算耗料增重比（F/G）。試驗期內(nèi)每天觀察和記錄仔豬腹瀉情況，根據(jù)腹瀉頭數(shù)和觀察總頭數(shù)計算腹瀉率。

1.4.2 腸道組織形態(tài) 試驗結(jié)束后，每組選擇3 頭有代表性的仔豬屠宰，取十二指腸、空腸、回腸腸段保存于4%甲醛溶液中固定。隨后將固定的十二指腸、空腸、回腸組織經(jīng)過切塊、沖水、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、制片、HE 染色等一系列處理后，在顯微鏡下觀察小腸黏膜結(jié)構(gòu)，選擇典型視野拍攝圖片，用Lei-ca Qwin 圖像分析系統(tǒng)測量絨毛高度（VH，絨毛頂端到根部的垂直高度）和隱窩深度（CD，絨毛根部至基底層的距離），并計算絨毛高度/隱窩深度（V/C）。每個樣品做3 張不連續(xù)切片，每張切片選取5 根完整的絨毛。

1.4.3 腸道微生物 屠宰仔豬時將各腸段結(jié)扎，防止腸內(nèi)容物相互移動，速取盲腸中段內(nèi)容物保存于-80℃冰箱，以干冰包裹（每組3 個樣本）送專業(yè)生物公司進行16S rRNA 高通量測序檢測盲腸微生物的α 多樣性、菌群屬水平和分類模型。微生物群落α 多樣性指數(shù)代表不同的含義，Chao1 和ACE 都是微生物菌群豐富度估計指數(shù)，Chao1 通過計算群落中只檢測到1 次和2 次的OUT 數(shù)估計群落中實際存在的物種數(shù)，ACE 通過默認序列量10 以下的OUT 估計群落中實際存在的物種數(shù)；Shannon 和Simpson 都是菌群多樣性指數(shù)，指數(shù)越高表明群落的多樣性越高，Shannon 對群落的豐富度和稀有OUT 更敏感，而Simpson 指數(shù)對均勻度和群落中的優(yōu)勢OUT 更敏感。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 初步處理，再用SPSS 17.0 軟件進行方差分析和Duncan′s 多重比較，包括加肽、攻毒及互作效應(yīng)3 個因素。除F/G 和腹瀉率外，結(jié)果以平均值± 標準誤表示。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 APB-13 對初生仔豬生長性能和腹瀉率的影響 由表2 可知，添加APB-13 能極顯著提高仔豬ADG，而對仔豬ADFI 指標無顯著影響，攻毒可極顯著降低仔豬的ADFI 和ADG，而是否加肽與是否攻毒間互作效應(yīng)不顯著。從F/G 和腹瀉率來看，加肽組均低于不加肽組，攻毒組均高于未攻毒組。

2.2 APB-13 對初生仔豬小腸形態(tài)的影響 由表3 可知，添加抗菌肽可極顯著提高十二指腸和空腸的VH，而對回腸的VH 無顯著影響。攻毒極顯著降低了十二指腸和空腸的VH，而對回腸VH 無顯著影響。是否加肽與攻毒僅對十二指腸的VH 存在互作（P＜0.05），對空腸和回腸的VH 均不存在互作效應(yīng)。添加抗菌肽可極顯著降低十二指腸和空腸的CD，而對回腸的CD 無顯著影響。攻毒極顯著提高了十二指腸、空腸及回腸的CD。是否加肽與攻毒僅對十二指腸的CD 存在互作效應(yīng)（P＜0.01）。添加抗菌肽可極顯著提高空腸V/C，而對十二指腸和回腸的V/C 無顯著影響。攻毒極顯著提高了十二指腸和空腸V/C，而對回腸V/C 無顯著影響。是否加肽與攻毒在十二指腸和空腸對V/C 存在互作效應(yīng)（P＜0.01），對回腸無影響。小腸CD 越低，V/C 越大則小腸形態(tài)發(fā)育越好。

由圖1 可知，APB-13 可改善初生仔豬小腸形態(tài)發(fā)育，特別是對空腸影響最明顯。加肽處理組的腸絨毛相對長，濃密且結(jié)構(gòu)完整，攻毒組的腸絨毛較短，且脫落、斷裂較嚴重，小腸基底組織受損明顯。

2.3 APB-13 對初生仔豬盲腸微生物的影響 仔豬盲腸微生物多樣性測定結(jié)果如表4。從Chao1 和ACE 2 種指數(shù)來看，無論在攻毒還是在未攻毒情況下，加肽組均低于未加肽組（P＞0.05），說明飼料中添加APB-13 降低了盲腸微生物菌群豐富度，且攻毒和加肽與否之間沒有互作效應(yīng)。從Simpson 指數(shù)來看，未攻毒情況下無差異，攻毒組中加肽組低于不加肽組（P＞0.05），且攻毒和加肽與否之間有顯著互作效應(yīng)，說明肽×毒互作顯著降低了微生物菌群多樣性。從Shannon 指數(shù)來看，在未攻毒情況下，加肽組高于不加肽組，攻毒情況下，加肽組低于不加肽組（P＞0.05），而攻毒與加肽與否之間有顯著互作效應(yīng)，說明肽×毒互作顯著降低了微生物菌群多樣性。

表2 APB-13 對初生仔豬生長性能和腹瀉率的影響

表3 APB-13 對初生仔豬小腸形態(tài)的影響

表4 仔豬盲腸微生物α 多樣性指數(shù)

仔豬盲腸微生物菌群差異可以通過PCoA 分析進行分類，PC1 和PC2 分別為33.38%和24.37%。從圖2 可知，對照組和APB-13 組均能各自聚類，TGEV 組和APB-13+TGEV 組相對較分散，說明APB-13 對未攻毒和攻毒的仔豬盲腸微生物菌落結(jié)構(gòu)都有調(diào)控作用。APB-13+TGEV組較TGEV 組更聚集一些，說明在TGEV 感染時APB-13 調(diào)控作用更明顯。

從圖3 可以看出，添加APB-13 后，仔豬盲腸微生物中優(yōu)勢菌群為乳酸菌屬、瘤胃菌屬和擬桿菌屬，劣勢菌群為柯林斯菌屬、普氏菌屬和鏈球菌屬。說明APB-13 的添加抑制了柯林斯菌屬、普氏菌屬和鏈球菌屬增殖，其中對柯林斯菌屬和普氏菌屬抑制作用較明顯，同時促進了乳酸菌屬、瘤胃菌屬和擬桿菌屬增殖，特別是對動物有益的乳酸菌屬增殖。

3 討 論

3.1 抗菌肽B-13 顯著改善初生仔豬生長性能、降低腹瀉率 初生仔豬比斷奶仔豬體質(zhì)更脆弱，因此更容易出現(xiàn)生長緩慢、生長性能下降及腹瀉等。為此，在飼料中添加益生菌、合生元、中草藥、酶制劑等已經(jīng)有許多研究。研究表明，抗菌肽能被快速吸收，提高種群存活率[15]；同時日糧中添加抗菌肽可提高仔豬日采食量和極顯著降低腹瀉率[16-17]；于寶君[18]研究表明，微生態(tài)制劑能促進豬體健康和生產(chǎn)性能；卜艷玲等[19]研究飼糧中添加腸桿菌肽也提高了仔豬生長性能和血清生化指標。特別是在仔豬受病原微生物感染時，抗菌肽更能發(fā)揮其功能。Liu 等[20]研究表明，大腸桿菌感染下，添加抗菌肽KR-32 可使斷奶仔豬ADG 和表觀總腸道消化率（ATTD）恢復(fù)原有水平。本試驗中，APB-13 的添加極顯著提高了ADG，明顯降低腹瀉率，在TGEV 感染時也充分發(fā)揮了促生長和抗病作用。

3.2 APB-13 促進仔豬小腸結(jié)構(gòu)發(fā)育 小腸是仔豬營養(yǎng)吸收的最主要部位，空腸占小腸比例最大，通?？漳c長度約是十二指腸和回腸之和的9 倍，因此空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育直接關(guān)系到營養(yǎng)物質(zhì)吸收和抗病能力。仔豬腹瀉病的靶部位主要是腸道。Xia 等[21]研究中TGEV 感染的仔豬小腸絨毛短、粗、斷裂等，損傷嚴重，與本研究相似。如何修復(fù)腸道損傷和促進腸道形態(tài)發(fā)育已有較多研究。肖昊等[22]研究表明，復(fù)合抗菌肽對嘔吐毒素誘導(dǎo)仔豬腸道損傷有修復(fù)作用；宦海琳等[23]研究表明，飼料中添加抗菌肽能提高仔豬VH 和降低CD；劉莉如等[24]研究表明，仔公雞飼料中添加天蠶素抗菌肽組空腸VH較對照組提高了24.08%；李平等[25]研究表明，飼料中添加抗菌肽能顯著降低V/C，隨抗菌肽添加量的增加其VH 也逐漸增加；Wu 等[26]研究表明，飼料中添加天蠶素AD 能增加仔豬空腸和回腸的V/C、空腸CD 及回腸VH。本試驗中，未攻毒組添加APB-13 可使空腸的VH和V/C 顯著升高，CD 顯著降低；攻毒組添加抗菌肽可使空腸的VH 和V/C 極顯著升高，CD 極顯著降低。此研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相吻合。這表明APB-13 的添加在仔豬無病狀態(tài)下能顯著促進空腸形態(tài)發(fā)育，在TGEV 感染下能極顯著緩解和改善空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，降低TGEV 對腸道的損傷，增強仔豬抗病能力。

3.3 APB-13 改善仔豬盲腸微生物菌群 仔豬腸道微生物菌群與仔豬生長及抗病能力，特別是仔豬腹瀉病有密切聯(lián)系。通常對仔豬腸道有益菌研究最多的是乳酸桿菌、雙歧桿菌及類球菌等，有害菌多是腸桿菌、葡萄球菌及鏈球菌的研究。張文俊等[27]研究表明，仔豬在8～22 日齡時，擬桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌及消化球菌等為優(yōu)勢菌群。Tang 等[28]研究表明，日糧中添加融合抗菌肽可增加乳酸桿菌和雙歧桿菌濃度，降低易引發(fā)腹瀉病的大腸桿菌濃度；陳張華等[29]研究表明，仔豬料中添加復(fù)合抗菌肽可極顯著增加乳酸菌量和降低大腸桿菌量；飼料中添加天蠶素和豬源PR39 抗菌肽可改善腸道微生物菌群，促進仔豬消化和保障仔豬健康[30]。本試驗中添加APB-13 提高了乳酸菌屬、瘤胃菌屬及擬桿菌屬的數(shù)量，降低了產(chǎn)氣的柯林斯菌屬、鏈球菌及普氏菌屬量。這與前人研究結(jié)果一致，都是通過增加有益菌減少有害菌來調(diào)控或改善微生物區(qū)系。因此，推測仔豬生長性能提高和腹瀉率降低與豬腸道發(fā)育及其微生物的影響密不可分，具體的作用機制仍需開展更多研究。

3.4 動物在病毒感染情況下抗菌肽對腸道微生物的改善更為明顯 很多研究表明，抗菌肽通過改善腸道微生物從而促進豬體健康，但并沒有對動物在病原微生物感染情況下開展研究。生產(chǎn)實踐中，仔豬很容易發(fā)生腹瀉病，尤其是豬傳染性胃腸炎，其感染率和致死率分別達到30%和100%[31]。因此，為驗證APB-13 在TGEV 感染情況下對仔豬的影響，本試驗中同時對未攻毒組和攻毒組APB-13 的作用進行研究，并獲得基本一致的結(jié)果。本試驗中TGEV 組和APB-13+TGEV 組微生物菌群多樣性指數(shù)Shannon 差異極顯著，PCoA 分析結(jié)果也表明，在TGEV 感染情況下APB-13 對仔豬盲腸微生物向健康區(qū)系調(diào)控作用更顯著，從而促進豬體健康。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，APB-13 能提高初生仔豬的生長性能，降低其腹瀉率，顯著改善初生仔豬小腸形態(tài)發(fā)育，對空腸形態(tài)發(fā)育影響最明顯；APB-13 能調(diào)節(jié)盲腸微生物菌群多樣性和豐富度，增加有益菌增殖，減少有害菌增殖；在TGEV 感染情況下，APB-13 能提高ADG，大大降低腹瀉率，并極顯著地改善空腸形態(tài)發(fā)育，調(diào)控盲腸微生物健康區(qū)系。