淮南豬線粒體DNA D-loop 遺傳多樣性及母系起源研究

徐秋良，段廣瑩，張 瀟，朱寬佑，李婉濤，黃炎坤*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省畜禽遺傳資源保護(hù)與利用工程技術(shù)中心，河南鄭州 450046）

淮南豬原產(chǎn)于淮河上游以南、大別山以北、桐柏山以東的沖積平原，主產(chǎn)區(qū)為新縣、固始、商城、羅山和光山等地，已有一千多年的飼養(yǎng)歷史；淮南豬具有肉質(zhì)好[1]、繁殖力強[2]、雜交配合力高和適應(yīng)性強[3]等優(yōu)點，是河南省優(yōu)良的地方豬種之一，在《中國畜禽遺傳資源志?豬志》中與淮北豬、山豬、灶豬、定遠(yuǎn)豬和皖北豬5 個類群一并被列入淮豬[4]。自20 世紀(jì)80年代以來，國外瘦肉型豬種不斷被引進(jìn)和雜交，同時原產(chǎn)區(qū)飼養(yǎng)淮南豬的散戶不斷退出市場，導(dǎo)致純種淮南豬飼養(yǎng)量逐年減少，淮南豬遺傳多樣性及品種保護(hù)受到威脅，已出現(xiàn)瀕危傾向[5]。因此，了解淮南豬現(xiàn)有群體的遺傳背景，并對其遺傳多樣性進(jìn)行評估，對淮南豬種質(zhì)資源的生態(tài)保護(hù)和科學(xué)利用具有重要的理論和實際意義。

線粒體DNA（Mitochondrion DNA，mtDNA）是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的遺傳物質(zhì)，具有分子結(jié)構(gòu)簡單、較核DNA 突變率高、進(jìn)化速率快、在世代傳遞中幾乎不發(fā)生重組和嚴(yán)格的母系遺傳特征[6]；能直觀保存群體多數(shù)中性突變的發(fā)生狀態(tài)[7]。D-loop 區(qū)（Control Region Displacement loop，D-loop）為mtDNA 序列最重要的非編碼區(qū)，進(jìn)化速率較編碼區(qū)更快[8]，是對品種內(nèi)個體間及親緣關(guān)系較近群體進(jìn)行遺傳分化研究的理想分子標(biāo)記。目前，利用mtDNA 研究世界各地家豬和野豬遺傳多樣性及起源進(jìn)化已有廣泛報道，然而對淮南豬遺傳多樣性的研究較少，僅見周鑫等[9]、張晶等[10]和張家慶等[11]分別采用隨機擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對淮南豬遺傳背景進(jìn)行了分析。本研究采集了淮南豬主產(chǎn)區(qū)養(yǎng)殖場和部分散養(yǎng)戶的淮南豬個體耳組織樣本，獲取和分析mtDNA D-loop 區(qū)序列，結(jié)合GenBank 中國內(nèi)外主要豬種及黃河流域古家豬D-loop 區(qū)序列信息，試圖揭示現(xiàn)存淮南豬群體的遺傳多樣性和母系起源，為淮南豬種質(zhì)資源的生態(tài)保護(hù)和合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗豬群 32 頭淮南豬母豬耳組織樣本分別采自淮南豬養(yǎng)殖場和農(nóng)戶散養(yǎng)群體，其中新縣淮南豬養(yǎng)殖場12 頭、湖北紅安縣農(nóng)戶6 頭、信陽市郊區(qū)農(nóng)戶6 頭、商城縣農(nóng)戶8 頭。每頭采集耳組織0.5 g 左右，保存于75%乙醇溶液，用OMEGA 基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成 以NCBI 上豬（Sus scrofa）mtDNA 已知序列（GenBank：AJ002189）為參考，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，用于擴(kuò)增淮南豬mtDNA D-loop區(qū)，上、下游引物分別為：F：5'-ATGCAAACCAAAACGCCA GTA-3'；R：5'-TATTCAGATTGTGGGCGTATG-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增及測序 20 μL PCR 擴(kuò)增體系：2×PCR Mix（廣州東盛生物科技有限公司）10 μL，上、下游引物（10 nmol/L）各0.8 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，54.5℃褪火60 s，72℃延伸75 s，30 個循環(huán)。擴(kuò)增完成后，72℃再延伸5 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后委托上海生物工程有限公司純化并雙向測序，測序引物為PCR 引物。

1.2.3 統(tǒng)計分析 測序結(jié)果用Chromas 2.1.3 軟件查看、核對，修正讀取錯誤的堿基。得到的序列用DNAStar 7.1軟件的SeqMan 進(jìn)行拼接。用DnaSP 5.0 軟件統(tǒng)計單倍型數(shù)、單倍型多樣度和核苷酸多樣度等。采用Arlequin 3.5 軟件進(jìn)行堿基不配對分析和Tajima's D 檢驗，以推斷種群是否發(fā)生過擴(kuò)張。用MEGA 5.0 分析序列的平均堿基組成、多態(tài)位點數(shù)、簡約信息位點數(shù)和總體轉(zhuǎn)換/顛換比例。

從GenBank 下載非洲疣豬、金華豬、通城豬、皮特蘭和漢普夏等國內(nèi)外主要豬種以及黃河流域家豬古代（FJ601545，F(xiàn)J601530，F(xiàn)J601531）mtDNA D-loop 信息，采用MEGA 5.0 和NetWork 4.6 分別構(gòu)建NJ 樹和網(wǎng)絡(luò)圖，分析淮南豬與國內(nèi)外其他豬種的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 淮南豬mtDNA D-loop 區(qū)序列及遺傳多樣性分析引物PCR 擴(kuò)增片段與預(yù)期目的片段大小一致，條帶單一（圖1），去除序列兩端可能測序不準(zhǔn)確區(qū)域及引物序列，經(jīng)序列比對分析，得到有效片段長度為1 170 bp（圖2）。序列T、C、A 和G 4 種堿基平均含量分別為24.7%、27.1%、29.8%和18.4%，A+T 含量（54.5%）高于C+G 含量（45.5%），符合mtDNA D-loop 非編碼區(qū)富含A/T 堿基的序列特征。MEGA5.0 軟件在供試淮南豬群體mtDNA D-loop 區(qū)共檢測到27 個多態(tài)位點，其中13 個簡約信息位點，14 個單突變位點，轉(zhuǎn)換/顛換平均值為2.9。DnaSP 5.0 軟件分析表明，群體核苷酸多樣性（Pi）為0.004 25，核苷酸平均差異數(shù)（K）為4.118；單倍型多樣性（Hd）為0.968，并據(jù)此界定了20 種單倍型Hap1～Hap20（圖3），其中Hap4 包含5 個個體，Hap3、Hap12 和Hap13 各包含3 個個體，Hap9 和Hap15 各包含2 個個體，其余單倍型均為1 個個體，表現(xiàn)為高度的遺傳多樣性（Hd＞0.5）。

2.2 淮南豬群體歷史動態(tài)分析 采用DnaSP 5.0 軟件分析淮南豬種群的歷史動態(tài)，利用岐點分布和Tajima's D中性檢測分析淮南豬群體是否歷經(jīng)群體擴(kuò)張。結(jié)果顯示，淮南豬群體岐點分布（Mismatch Distribution）分析圖譜呈單峰分布（圖4），中性檢驗Tajima's D 值為負(fù)值且差異顯著（D=-1.445 990，P=0.027 893），表明淮南豬在形成或馴化進(jìn)程中發(fā)生過明顯的種群擴(kuò)張。

2.3 基于mtDNA D-loop 區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析 本研究以非洲疣豬的mtDNA D-loop 序列為外群，利用MEGA 5.0 軟件采用鄰接法（NJ）構(gòu)建了淮南豬與國內(nèi)外83 個主要豬種的mtDNA D-loop 序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。

從系統(tǒng)樹可以看出，所分析樣本明顯分為2 個獨立的支系：第一支以國外豬種為主，將東北野豬、杜洛克、皮特蘭和漢普夏聚為一類；第二支以國內(nèi)豬種為主，將淮南豬20 個單倍型與約克夏、巴克夏、長白豬和國內(nèi)其他豬種聚為一類，淮南豬20 個單倍型與以大圍子豬、皖南花豬、樂平花豬、上高花豬、圩豬、東鄉(xiāng)花豬、通城豬、萊蕪豬、沂蒙黑豬、河套大耳豬等為代表的華中、華北型豬種關(guān)系較近，而與華南型、西南型、高原型豬種關(guān)系較遠(yuǎn)。總體而言，淮南豬20 個單倍型在系統(tǒng)樹上分布較為分散，母源血統(tǒng)遺傳復(fù)雜，與華中、華北型豬種基因交流較廣泛。

為進(jìn)一步研究淮南豬起源進(jìn)化的地域特征，本研究引入3 條黃河流域家豬mtDNA D-loop 序列古老單倍型，與淮南豬、國內(nèi)外主要豬種構(gòu)建Median-Joining Network 網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。網(wǎng)絡(luò)圖所呈現(xiàn)的各豬種之間的關(guān)系與分子系統(tǒng)發(fā)育樹類似，但更清晰地顯示，網(wǎng)絡(luò)圖中H_4、H_5、H_6 和H_7 即淮南豬的Hap5、Hap7、Hap12、Hap16 和Hap19 為淮南豬特有單倍型，其余單倍型為品種間共享單倍型；淮南豬Hap1、Hap2、Hap3、Hap6、Hap9、Hap10、Hap11、Hap13、Hap14、Hap15、Hap17、Hap18 共12 個單倍型與華中、華北型豬種構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)圖中的主流單倍型（H1 和H2），并且與2 個黃河流域家豬古老單倍型距離關(guān)系較近。Hap4、Hap8 和Hap20 則分布于以華南型豬種為主的群體中（H3 和H8）。國外豬種皮特蘭、漢普夏和杜洛克構(gòu)成獨立的一支（H9），而長白豬、巴克夏和約克夏與國內(nèi)豬種有基因交流。

3 討 論

3.1 淮南豬群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析 遺傳多樣性是指生物種內(nèi)遺傳變異程度，是生物適應(yīng)環(huán)境與進(jìn)化的基礎(chǔ)，由Hd 和Pi 值衡量[12]。本研究結(jié)果顯示，淮南豬群體mtDNA D-loop 區(qū)Hd 和Pi 分 別 為0.968 和0.004 25，屬高Hd（Hd＞0.5）低Pi（Pi＜0.5%）群體，據(jù)此推測淮南豬在進(jìn)化過程中歷經(jīng)一段有效群體規(guī)模較小時期之后，可能發(fā)生了一次大而快速的群體擴(kuò)張，群體擴(kuò)張消除了擴(kuò)張前的種群遺傳結(jié)構(gòu)，是導(dǎo)致群體單倍型多樣度高而核苷酸多樣度低的重要原因[13]，這與本研究中性檢驗結(jié)論一致；此外，淮南豬群體單倍型分布較分散也進(jìn)一步說明了群體進(jìn)化過程中曾經(jīng)出現(xiàn)過群體擴(kuò)張，表現(xiàn)為多母系起源。與淮南豬群體遺傳多樣性類似，我國多數(shù)地方豬種表現(xiàn)具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，趙曉楓[14]用mtDNA D-loop 區(qū)研究44 個國內(nèi)地方豬種遺傳多樣性表明，華北型、華南型、華中型、江海型和西南型豬種Hd 和Pi 值分別為0.899～0.989和0.003 4～0.004 4，總體呈現(xiàn)單倍型多樣性豐富，核苷酸多樣型匱乏的特征，相似結(jié)果在東北民豬[15]、甘南藏豬[16]、石頭豬、德保豬和隆林豬[17]中均有報道；但部分豬種如陸川豬[18]、馬身豬[19]、里岔黑豬、煙臺黑豬和昌濰白豬[20]單倍型多樣性和核苷酸多樣性均相對匱乏，這可能與每個豬種形成的歷史有關(guān)。因此，我國地方豬保種工作刻不容緩。

3.2 基于D-loop 區(qū)部分序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 眾多研究表明，采用mtDNA D-loop 序列構(gòu)建國內(nèi)外豬種NJ系統(tǒng)發(fā)育樹時，中國豬種和國外豬種分別聚為獨立的一支[14-15,17,19,20-23]，本研究與前人研究結(jié)果一致，進(jìn)一步支持了現(xiàn)代家豬起源于歐亞兩大母系的二元論觀點，并且東北野豬沒有與國內(nèi)豬種聚為一類，而是與以皮特蘭、漢普夏和杜洛克為代表的歐洲豬種親緣關(guān)系較近，這可能緣于東北地域毗鄰前蘇聯(lián)，東北野豬與歐洲野豬存在基因交流而含有歐洲野豬的血統(tǒng)[15]。另外，長白豬、巴克夏和約克夏與包括淮南豬在內(nèi)的國內(nèi)豬種聚為一類，主要原因可能是在17 世紀(jì)末及18 世紀(jì)初，英國曾經(jīng)引進(jìn)廣東地方豬種，參與培育了巴克夏和約克夏[24]；而長白豬是由英國豬種、中國豬種和本地豬種雜交培育而成，包含有中國豬種單倍型[25]。

根據(jù)體型、外貌特征和地理分布情況，我國地方品種豬分為華北型、華南型、華中型、江海型、西南型和高原型。為探討我國地方豬種的地域特征，本研究將淮南豬的單倍型與國內(nèi)代表性地方豬種mtDNA D-loop 序列進(jìn)行聚類。NJ 樹顯示，大圍子豬、皖南花豬、東鄉(xiāng)花豬、樂平花豬、通城豬、萊蕪豬、沂蒙黑豬、武夷黑豬、河套大耳豬和嵊縣花豬等華中、華北型聚為一類；糯谷豬、內(nèi)江豬、莆田豬、德保豬、藍(lán)塘豬、陸川豬、成華豬、榮昌豬、閩北花豬、滇南小耳豬、可樂豬、丫杈豬、烏金豬、槐豬、屯昌豬、巴馬豬和隆林豬等華南、西南型聚為一類，某些程度上，符合我國以地理分布劃分地方豬種類型的依據(jù)[21]；而玉山黑豬、贛東南花豬、八眉豬、馬身豬、金華豬、梅山豬和二花臉散布在華南、西南型類群同時也說明，國內(nèi)豬種聚類關(guān)系與產(chǎn)區(qū)地理分布并沒有非常強的關(guān)聯(lián)性，部分地方豬種間遺傳距離與地理分布遠(yuǎn)近無必然聯(lián)系，這可能與現(xiàn)代社會人類遷徙越來越便利、地方豬種之間基因交流頻繁有關(guān)。因此，mtDNA D-loop 序列特征結(jié)合品種形成和培育的文獻(xiàn)資料，可有效區(qū)分國內(nèi)外豬種，但不能夠準(zhǔn)確為我國地方豬種分類，全基因組測序研究我國豬種的分類、起源和進(jìn)化是今后研究的方向。

Network 分析顯示，除5 個特有單倍型之外，淮南豬單倍型呈現(xiàn)廣泛的地理分布，其中12 個單倍型為與華中、華北型豬種共享，表明淮南豬與華中、華北型豬種基因交流廣泛；與西南、華南、江海、高原型豬種基因交流較少，但未完全阻隔。淮南豬主產(chǎn)于河南信陽各縣區(qū)，地處淮河以南長江以北，與華中地區(qū)安徽省和湖北省接壤，是我國南北地理位置的分界區(qū)，這可能是造成淮南豬與華北、華中型基因交流廣泛的原因。

研究表明，黃河中游地區(qū)的古家豬攜帶有現(xiàn)代中國家豬的母系遺傳基因[26]，是中國家豬馴化中心[27]和中國家豬的獨立起源地之一。而淮南豬與黃河流域古家豬親緣關(guān)系較近，這可能是造成淮南豬單倍型廣泛分布于我國現(xiàn)代地方豬種的主要原因；同時也可推斷淮南豬雖為多母系起源群體，但主要來源于黃河流域古家豬。