受激輻射耗盡超分辨顯微成像的研究進(jìn)展及應(yīng)用

阮賀飛， 吳亞運(yùn)， 袁景和， 石 彥， 方曉紅*

(1.中國科學(xué)院化學(xué)研究所,分子納米結(jié)構(gòu)與納米技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京分子科學(xué)國家研究中心，北京 100190；2.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100084)

1 前言

1994年，德國科學(xué)家Hell等首次提出受激輻射耗盡顯微術(shù)概念，并在理論上驗(yàn)證了其突破光學(xué)衍射極限的可行性[1]。2000年，他們在實(shí)驗(yàn)中突破衍射極限并將橫向分辨率提高了2倍左右，縱向分辨率提高了6倍左右[2]。隨后多種遠(yuǎn)場光學(xué)超分辨技術(shù)相繼出現(xiàn)并得到快速發(fā)展，橫向分辨率可以達(dá)到幾十納米[3 - 4]。光學(xué)超分辨成像技術(shù)主要分為兩類：一類是基于照明光路空間調(diào)制的受激輻射耗盡(Stimulated Emission Depletion，STED)顯微術(shù)[2]、結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(Structured Illumination Microscopy，SIM)[5]等；另一類是基于單分子高精度定位的光活化定位顯微術(shù)(Photo-Activated Localization Microscopy，PALM)[6]、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM)[7]等。與PALM和STORM技術(shù)相比，基于共聚焦顯微鏡點(diǎn)掃描成像模式的STED顯微鏡具有更快的時間分辨，以及更加精細(xì)的三維解析能力，因此成為生化研究中重要的超分辨成像工具。憑借對STED超分辨顯微鏡發(fā)展所做出的突出貢獻(xiàn)，Hell獲得2014年度諾貝爾化學(xué)獎。

本文結(jié)合我們課題組近年來在STED顯微成像研究方面的工作，首先從STED成像的基本原理、熒光探針的選擇、多色及三維成像以及STED與其他技術(shù)的聯(lián)用等方面，綜述了STED顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展，然后介紹了STED顯微鏡在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像中的應(yīng)用，最后對STED顯微成像技術(shù)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

2 受激輻射耗盡顯微成像技術(shù)的研究進(jìn)展

2.1 超分辨成像原理

1873年，Abbe提出著名的光學(xué)衍射極限理論：任何理想物點(diǎn)經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成像后都不可能得到一個理想像點(diǎn)，而是得到一個彌散光斑即艾里斑，這樣兩個彌散光斑靠近后就無法分辨，進(jìn)而限制了系統(tǒng)的分辨率，用公式表述橫向分辨率為[8 - 9]：

(1)

STED顯微鏡其基本原理是采用兩束激光同時照射樣品[10]，其中一束激光用來激發(fā)熒光分子，使艾里斑范圍內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)；同時，用另外一束中心光強(qiáng)為零的環(huán)形損耗激光(STED光)與之疊加，使艾里斑邊沿區(qū)域處于激發(fā)態(tài)的熒光分子，通過受激輻射損耗過程返回基態(tài)而不自發(fā)輻射熒光，因此只有中心STED光為零的區(qū)域中的熒光分子可自發(fā)輻射熒光，從而獲得衍射極限范圍內(nèi)的熒光發(fā)光點(diǎn)。從理論上來講，由于STED損耗光為環(huán)狀光束，其強(qiáng)度符合高斯分布且環(huán)狀中心強(qiáng)度為零，因而環(huán)狀損耗光強(qiáng)度越強(qiáng)，則激發(fā)光激發(fā)的熒光分子自發(fā)輻射熒光的區(qū)域就越小，其橫向分辨率就越高，用公式表示為[1,3]：

(2)

其中，Δr為兩個物點(diǎn)的最小分辨距離，λ為激發(fā)光波長，n為介質(zhì)折射率，θ為物鏡孔徑角的一半，Idep為損耗激光強(qiáng)度，Isat為熒光分子飽和激發(fā)強(qiáng)度。

圖1 STED超分辨熒光顯微鏡成像原理示意圖[11]Fig.1 Schematic diagram of STED super-resolution fluorescence imaging[11]

當(dāng)Idep/Isat比值很大時，橫向分辨率Δr就無限小，因此STED顯微術(shù)沒有理論分辨率極限。圖1為STED超分辨率熒光顯微鏡成像原理示意圖。

2.2 熒光探針

熒光成像過程中，細(xì)胞或者組織等生物樣品需要用具有熒光發(fā)色團(tuán)的熒光探針進(jìn)行標(biāo)記。理論上所有的熒光發(fā)色團(tuán)均能發(fā)生受激輻射過程，應(yīng)該都可以用于STED超分辨成像。然而，實(shí)際成像過程中為了實(shí)現(xiàn)超分辨成像，使用的受激輻射光強(qiáng)度非常高(一般為共聚焦激發(fā)光的100倍)，往往會導(dǎo)致熒光發(fā)色團(tuán)的快速漂白。另外，活細(xì)胞生物成像要求熒光探針具有良好的生物相容性、細(xì)胞穿透性和特異性標(biāo)記能力。目前報道的熒光探針主要包括三類：熒光蛋白、有機(jī)染料和熒光納米顆粒。

熒光蛋白由于其優(yōu)越的基因編輯和特異性標(biāo)記效果以及多種顏色可選的特性，已成為生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)原位熒光成像的主要標(biāo)記策略[12 - 13]。2006年，Hell等報道了使用綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行STED成像，達(dá)到了70 nm的分辨率，實(shí)現(xiàn)了病毒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超分辨成像[14]。T?nnesen等使用GFP和黃色熒光蛋白(YFP)標(biāo)記觀察活體腦切片中前突觸和后突觸的結(jié)構(gòu)[15]。然而，目前可用于STED成像的熒光蛋白只有GFP和YFP。紅色熒光蛋白的穩(wěn)定性和亮度相較于其他熒光蛋白更差，無法用于STED成像。熒光蛋白的穩(wěn)定性和亮度難以與有機(jī)染料和熒光納米顆粒相比，目前依舊難以滿足STED成像的要求。

有機(jī)染料作為小分子熒光探針目前被廣泛應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域。由于STED成像需要高強(qiáng)度受激輻射光猝滅周圍熒光信號，必須選擇具有優(yōu)越抗光漂白性質(zhì)、亮度高的有機(jī)小分子熒光探針進(jìn)行標(biāo)記。有機(jī)染料分子相比于熒光蛋白普遍具有更小的尺寸、更好的熒光穩(wěn)定性和亮度，因而標(biāo)記密度更高，成像效果更好。目前STED生物成像采用的熒光探針主要是結(jié)構(gòu)優(yōu)化過的有機(jī)染料分子，具有良好的抗漂白性質(zhì)和生物相容性，已經(jīng)有多種商品化產(chǎn)品可供選擇(Atto系列、Abberior系列染料)。如特殊結(jié)構(gòu)優(yōu)化的染料PB430能夠進(jìn)行250 s的持續(xù)STED成像并保留70%的熒光強(qiáng)度[19]，SiR染料能進(jìn)行長達(dá)1 500 s的STED成像并保留67%的熒光信號[20]。多種組合的染料對已經(jīng)被用于雙色STED生物成像和活細(xì)胞成像中，為研究細(xì)胞器和生物分子在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用提供了重要工具。Bottanelli等采用Atto590和SiR兩種染料結(jié)合SNAP和Halo-tag的標(biāo)記方法，實(shí)現(xiàn)了長達(dá)3 min的活細(xì)胞雙色STED示蹤細(xì)胞器相互作用[21]。此外，具有點(diǎn)亮熒光性質(zhì)(Fluorogenic)的染料[22]和大斯托克斯位移的染料[23]也被用于STED成像，能夠有效消除背景信號干擾和簡化顯微鏡光路系統(tǒng)。

近年來，熒光納米顆粒因其優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)，包括高亮度、抗漂白性和光開關(guān)性等，被廣泛應(yīng)用于超分辨成像和單分子示蹤領(lǐng)域，量子點(diǎn)(QDs)[24]、上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UC NPs)[25]、熒光納米鉆石(FNDs)[26 - 27]、碳點(diǎn)(CDs)[28]、聚集誘導(dǎo)發(fā)光納米顆粒(AIE NPs)[29]、染料復(fù)合等離子體納米顆粒[30]等新型熒光納米探針正在被逐漸應(yīng)用于STED成像領(lǐng)域。相比于熒光蛋白和有機(jī)染料，熒光納米顆粒具有更高的亮度和抗漂白性質(zhì)，能夠進(jìn)行長達(dá)數(shù)十分鐘到數(shù)小時的持續(xù)STED成像。不過熒光納米顆粒的一些缺點(diǎn)也無法忽視，例如較大的尺寸和活細(xì)胞標(biāo)記困難。另外，QDs和AIE NPs具有雙光子效應(yīng)，發(fā)光點(diǎn)周圍會產(chǎn)生一圈由損耗光激發(fā)出的虛影從而降低了信噪比[24，31]。UC NPs和染料復(fù)合等離子體納米顆粒只需要較低的受激輻射光強(qiáng)度就能實(shí)現(xiàn)超分辨成像，但UC NPs由于較低的量子產(chǎn)率和較長的熒光壽命限制了成像速度，染料復(fù)合等離子體納米顆粒則會因?yàn)榈入x子體顆粒的熱效應(yīng)導(dǎo)致染料和顆粒的分解。

我們課題組曾報道了具有優(yōu)異抗光漂白性能的熒光導(dǎo)電聚合物點(diǎn)(PDs)作為納米探針，并用于長時間的STED生物成像[32]。將具有優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)的紅色熒光半導(dǎo)體聚合物(668 nm)包裹于兩親性聚合物中，得到粒徑為40 nm的PDs，并進(jìn)一步偶聯(lián)生物素，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞囊泡的標(biāo)記，得到了70 nm的分辨率和長達(dá)2 h的持續(xù)STED成像(圖2)，并能夠?qū)崟r動態(tài)觀察內(nèi)吞囊泡的融合和分離過程。該P(yáng)Ds與商品化STED染料(Atto 565)和包裹染料的聚苯乙烯微球相比，具有更好的亮度和熒光穩(wěn)定性，成像2 h無明顯熒光衰減，是目前STED成像熒光穩(wěn)定性最高的熒光探針。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，不同分子結(jié)構(gòu)的PDs的熒光穩(wěn)定性有明顯差異。因此，PDs可以作為一類有潛力的新型受激輻射損耗超分辨成像熒光探針，進(jìn)一步設(shè)計開發(fā)新結(jié)構(gòu)的熒光聚合物，有望滿足廣泛應(yīng)用STED成像的要求。

圖2 熒光聚合物點(diǎn)(Pdots)用于長時間STED生物成像[32]Fig.2 Fluorescent polymer dots for long-term STED bioimaging[32]

2.3 多色及三維成像

為了精細(xì)解析細(xì)胞內(nèi)不同組分的空間分布和相互作用，發(fā)展STED多色成像和三維成像成為新的趨勢。例如，Neumann等利用雙色STED顯微鏡觀察到三種線粒體孔蛋白(hVDAC)亞型在線粒體上的不同分布，并發(fā)現(xiàn)hVDAC3與I型己糖激酶的共定位比例要高于hVDAC2和hVDAC1[33]。Pellett等利用改進(jìn)的SNAP和CLIP標(biāo)簽技術(shù)，實(shí)現(xiàn)表皮生長因子和受體相互作用的雙色STED成像表征[34]。Li等人利用雙色STED顯微鏡觀察到單純性皰疹病毒(HSV-1)基因組的復(fù)制過程[35]。北京大學(xué)席鵬等使用連續(xù)激光器實(shí)現(xiàn)雙色CW-STED，獲得了71 nm的空間分辨率，并對人類呼吸道合胞病毒(hRSV)蛋白的共定位情況進(jìn)行了分析[36]。

STED多色成像面臨的一個重要問題是如何解決通道間的交叉干擾(串色)和簡化成像光路。從成像裝置及光路設(shè)計上來說，目前研究人員主要通過以下兩種方式來實(shí)現(xiàn)多色STED成像：(1)選擇激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可以截然分離的多種熒光分子進(jìn)行標(biāo)記，裝置上使用相應(yīng)的多束激發(fā)光和多束STED損耗光來實(shí)現(xiàn)多色STED超分辨成像[37]；(2)選擇激發(fā)光譜不同，發(fā)射光譜相近的多種熒光分子進(jìn)行標(biāo)記，裝置上使用多束激發(fā)光且共用一束STED損耗光的成像模式[38 - 39]。然而，無論使用哪種方法，僅僅使用濾波片對不同通道的熒光信號進(jìn)行分離是無法徹底消除串色問題的。雖然基于圖像的后期處理也能實(shí)現(xiàn)多色成像[15,40 - 41]，但是難以實(shí)現(xiàn)不同通道信號的徹底分離，并且容易產(chǎn)生假象。目前研究人員使用基于點(diǎn)掃描模式的時間門分離法來徹底消除串色問題，但是該方法需要較高的激光脈沖頻率，并且對脈沖時序的調(diào)控要求極為嚴(yán)格且裝置復(fù)雜，不僅需要嚴(yán)格控制單一通道內(nèi)的熒光激發(fā)、損耗和探測順序，還需要控制多通道之間的門控順序，因此實(shí)現(xiàn)起來比較困難。我們課題組提出通過不同通道間線切換掃描的方式實(shí)現(xiàn)門控多色STED成像，該方法在徹底消除串色問題的同時，還解決了點(diǎn)掃描時間門分離模式下裝置復(fù)雜、難以控制的問題。

基于共聚焦成像模式的STED顯微鏡本身具有三維層析能力，為細(xì)胞內(nèi)的三維成像提供便利，但是如何提高軸向分辨率具有一定的挑戰(zhàn)性。提高軸向分辨率比較經(jīng)典的方法是4Pi技術(shù)[43]，需將兩個反向的物鏡聚焦在同一焦平面上，并通過將所有的光束相干疊加來實(shí)現(xiàn)軸向分辨率的顯著提高，但此方法比較復(fù)雜，實(shí)現(xiàn)起來有一定難度。另一種方法是Hell等設(shè)計并使用了一塊0/π位相板對損耗光進(jìn)行位相調(diào)控，經(jīng)過物鏡匯聚后得到一束軸向中空的光斑，進(jìn)而在單物鏡成像系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)軸向分辨率的顯著提高。受全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)成像原理啟發(fā)，北京大學(xué)席鵬等使用鏡面代替顯微鏡載玻片成功的將STED顯微鏡軸向分辨提高了6倍[45]。

2.4 受激輻射耗盡顯微成像與其他技術(shù)聯(lián)用

將超分辨熒光顯微術(shù)與納米表征和操縱等技術(shù)聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)納米尺度上生物樣品的同時多模態(tài)成像和納米操縱，具有重要的發(fā)展前景。

原子力顯微鏡(AFM)的生物成像分辨率與STED成像接近，但是其探針不具有生物分子特異性識別功能。將AFM技術(shù)和STED顯微技術(shù)聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)納米尺度下的光學(xué)信號和力學(xué)信號同時成像，同時STED顯微鏡可為納米尺度的AFM微操縱提供更精確的引導(dǎo)。我們課題組基于三態(tài)弛豫(T-Rex)概念成功研制了超連續(xù)脈沖激光激發(fā)的SC-STED顯微鏡，獲得了好于40 nm的成像分辨率。在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了與AFM的聯(lián)用，并開發(fā)了同時成像和引導(dǎo)成像兩種聯(lián)用成像模式，在國際上首次實(shí)現(xiàn)了熒光和力學(xué)信號的同時同步獲取。利用STED成像精確引導(dǎo)AFM成像，能夠結(jié)合兩種成像的優(yōu)點(diǎn)，既可以快速找到感興趣的區(qū)域，又能準(zhǔn)確獲取光學(xué)信息、形貌特征和力學(xué)參數(shù)。如圖3所示，我們利用同時成像模式實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞偽足表面形態(tài)和原位肌動蛋白微絲的超分辨熒光表征[46]。

圖3 STED顯微鏡與AFM聯(lián)用的原理示意圖[46]。左邊為聯(lián)用光路示意圖，右邊為細(xì)胞偽足的原位光學(xué)信息和形態(tài)特征。(a)共聚焦圖像；(b)AFM圖像；(c)STED圖像；(d)STED去卷積圖像Fig.3 Schematic diagram of the integrated STED microscope and AFM[46].The left figure shows the optical path of integrated system,and the right figure shows in situ optical imaging and morphological characteristics of the cellular pseudopod.(a) Confocal image;(b) AFM image;(c) STED image;(d) STED deconvolution image

與共聚焦模式下的熒光相關(guān)光譜(Fluorescence Correlation Spectroscopy，F(xiàn)CS)技術(shù)相比，基于STED顯微鏡的FCS技術(shù)可將有效探測體積減小到Confocal-FCS的十分之一，進(jìn)而可用于探測濃度更高的生物樣品。因此，STED -FCS技術(shù)更有利于研究細(xì)胞膜上高密度的蛋白受體寡聚化、脂筏和脂質(zhì)分子的動力學(xué)信息。如細(xì)胞膜上的微結(jié)構(gòu)域脂筏，由于具有較小的尺寸(直徑5～200 nm)和高度的動態(tài)特性，普通熒光顯微鏡無法對其進(jìn)行直接表征和研究，其存在與否一直都具有爭議性。Hell等使用STED -FCS聯(lián)用技術(shù)，直接觀察到鞘磷脂和糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI-anchored proteins)能夠被膽固醇富集的微結(jié)構(gòu)域(～20 nm)短暫的(10～20 ms)捕獲，而其他的一些磷脂不具有這種行為，直接證明了細(xì)胞膜上微結(jié)構(gòu)域的存在[47]。

光鑷技術(shù)(Optical Tweezer)廣泛用于生物樣品的微操縱，STED顯微技術(shù)與光鑷微操縱技術(shù)的聯(lián)用將進(jìn)一步幫助我們在納米尺度上精確解析生物樣品結(jié)構(gòu)。例如，我們知道DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)表面上緊密的分布著多種多樣的功能蛋白，它們在DNA的復(fù)制和修復(fù)過程中具有重要作用。為精確解析和追蹤單一蛋白在雙螺旋結(jié)構(gòu)上的分布，Wuite等實(shí)現(xiàn)了STED技術(shù)和光鑷技術(shù)的聯(lián)用，首先利用光鑷技術(shù)控制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象和張力，同時利用高時間分辨(<50 ms)和空間分辨(50 nm)的STED顯微鏡來解析和追蹤蛋白的位置變化[48]。

3 受激輻射耗盡顯微鏡在細(xì)胞成像中的應(yīng)用

3.1 細(xì)胞膜蛋白和微結(jié)構(gòu)域

細(xì)胞膜既是細(xì)胞生存的屏障，又是細(xì)胞與外界發(fā)生信息、物質(zhì)和能量交換的直接介質(zhì)。其中，生理狀態(tài)下細(xì)胞膜受體的聚集狀態(tài)往往與其信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，同時細(xì)胞膜上的微結(jié)構(gòu)域又能直接影響膜受體的激活和聚集，因此利用STED超分辨顯微鏡在納米尺度上研究細(xì)胞膜受體聚集程度及微結(jié)構(gòu)域的變化有助于進(jìn)一步了解細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制。

圖4 活細(xì)胞細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子的Confocal-FCS和STED -FCS分析[47]Fig.4 Confocal-FCS and STED-FCS analysis of lipids on living cell membrane[47]

在細(xì)胞膜受體聚集研究方面，Garcia-Parajo等利用STED超分辨熒光成像研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)源或者外源性脂類抗原刺激下，抗原呈遞分子CD1d在抗原呈遞細(xì)胞THP-1表面形成平均尺寸為78 nm的納米團(tuán)簇，從而調(diào)控免疫細(xì)胞iNKT的激活。進(jìn)一步的成像結(jié)果顯示，當(dāng)破壞細(xì)胞骨架或者切除CD1d分子的胞內(nèi)端時，CD1d分子能夠形成更大尺寸的納米團(tuán)簇，進(jìn)而增強(qiáng)免疫細(xì)胞iNKT的激活效應(yīng)[52]。Hell等也利用STED超分辨成像發(fā)現(xiàn)CHO細(xì)胞表面的乙酰膽堿受體(AChR)以平均直徑55 nm左右的納米團(tuán)簇存在，并且納米團(tuán)簇的尺寸和分布同樣受到細(xì)胞骨架和膽固醇去除的影響[53 - 54]。圖4為活細(xì)胞細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子的Confocal-FCS和STED -FCS分析。

STED -FCS聯(lián)用技術(shù)為在活細(xì)胞上研究細(xì)胞膜脂肪分子、微結(jié)構(gòu)域的動態(tài)行為及相互作用提供有利條件。例如，Hell等利用STED -FCS聯(lián)用技術(shù)在活細(xì)胞細(xì)胞膜上觀察到鞘磷脂的受限擴(kuò)散，直接證明細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域的存在[47]。Eggeling等利用STED -FCS技術(shù)研究活細(xì)胞細(xì)胞膜上直徑30 min區(qū)域內(nèi)的多種脂質(zhì)分子的動態(tài)行為及相互作用，發(fā)現(xiàn)磷酸甘油酯之間形成弱的相互作用，而鞘磷脂之間能夠形成強(qiáng)的相互作用，直接證明鞘磷脂是細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域成分之一[55]。

3.2 細(xì)胞器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)

細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架、細(xì)胞核和多種細(xì)胞器組成了細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞的正常工作和運(yùn)轉(zhuǎn)?；诠簿劢钩上衲Ｊ降腟TED顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞各個層面的超分辨成像，為在納米尺度上研究各細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的分布和功能提供幫助，彌補(bǔ)了普通熒光顯微鏡在分辨率上的局限。

圖5 核孔復(fù)合體中蛋白分布的confocal和STED成像圖[39]Fig.5 Confocal and STED imaging of protein distribution in nuclear pore complexes[39]

線粒體內(nèi)膜上覆蓋著很多寡聚化的蛋白復(fù)合物，它們對維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，并與一些人類疾病相關(guān)，但是它們在內(nèi)膜上的分布情況并不明確。Stefan Jakobs等利用STED超分辨顯微鏡發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中三種已知蛋白mitofilin、MINOS1、和CHCHD3在線粒體內(nèi)膜組織系統(tǒng)中形成相似的、有規(guī)則的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞核附近的線粒體內(nèi)膜系統(tǒng)要比邊緣處的豐富[56]。

在細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的研究中(圖5)，Hell等利用分辨率好于20 nm的雙色STED顯微鏡觀察到核孔復(fù)合體中g(shù)p210蛋白的八倍體對稱分布，并對核孔的大小和蛋白復(fù)合物的尺寸進(jìn)行了表征[39]。Stave Kohtz等則利用STED顯微鏡觀察到核孔蛋白NUP62和NUP64在核孔復(fù)合體中的微觀不均一性分布[57]。

3.3 轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡

轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡在不同細(xì)胞器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間扮演重要的物質(zhì)運(yùn)輸作用，但因其尺寸較小，傳統(tǒng)熒光顯微鏡往往對其無能為力。例如，直徑為1 μm左右的突觸前神經(jīng)末梢內(nèi)富含大量直徑約為40 nm左右的突觸囊泡，它們的運(yùn)動及轉(zhuǎn)運(yùn)行為就無法用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡來表征。Hell等利用每秒可以拍攝28幀圖像的STED超分辨顯微鏡追蹤到突觸囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)行為，并發(fā)現(xiàn)這種囊泡在沒有神經(jīng)節(jié)的區(qū)域運(yùn)動速度會更快[58]。我們課題組利用自主搭建分辨率可達(dá)40 nm的STED顯微鏡實(shí)現(xiàn)了后高爾基體囊泡的超分辨成像。如圖6所示，觀察到轉(zhuǎn)化生長因子Ⅱ型受體(TβRⅡ)后高爾基體囊泡的環(huán)狀輪廓結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)TβRⅡ在到達(dá)細(xì)胞膜之前，在后高爾基體囊泡膜上以聚集體的形式存在，這樣有利于其上膜后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[59]。我們還通過發(fā)展適用于STED超分辨成像的新型導(dǎo)電聚合物點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞中內(nèi)吞囊泡結(jié)合和解離的動態(tài)變化[32]。

圖6 Tβ RⅡ在后高爾基體囊泡上分布的Confocal和STED成像圖[59]Fig.6 Confocal and STED imaging of Tβ RII distribution on the post-Golgi vesicles[59]

3.4 神經(jīng)元結(jié)構(gòu)

圖7 活體小鼠視覺皮層樹突中肌動蛋白微絲的超分辨成像[66]Fig.7 Super-resolution imaging of actin filaments in visual cortex dendrites of living mice[66]

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，可以通過樹突和軸突來接受和傳遞信號。在神經(jīng)生物學(xué)研究中，人們發(fā)現(xiàn)樹突棘的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，因此研究其結(jié)構(gòu)變化有助于解釋相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制。然而樹突棘尺寸位于衍射極限范圍內(nèi)(40～500 nm)[60]，再加上高密度分布的樹突結(jié)構(gòu)，使得對它們結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的研究非常困難。

超分辨熒光顯微技術(shù)從早期發(fā)明開始就被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究中。例如，N?gerl等利用自主搭建分辨率達(dá)70～80 nm的STED顯微鏡，在海馬切片中獲得了樹突棘結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)超分辨圖像[61]，并在另一篇報道中詳細(xì)解析了海馬神經(jīng)元中樹突棘頸的寬度和樹突棘頭的曲率[62]，他們還在腦切片中實(shí)現(xiàn)了深度達(dá)120 μm的突觸肌動蛋白微絲的動態(tài)超分辨成像[63]。進(jìn)一步利用STED超分辨成像發(fā)現(xiàn)，在小鼠的正常生長發(fā)育中，隨著年齡的增長，樹突棘的頭會變小，頸部會變小和變寬，但是與普遍認(rèn)知所不同的是，他們發(fā)現(xiàn)患脆性X染色體綜合癥小鼠的樹突棘的頭和頸并不會受到損傷，而是同樣隨著年齡的增長而變小變寬[64]。Brismar等利用雙色STED超分辨顯微鏡發(fā)現(xiàn)磷蛋白DARPP-32和D1R在樹突棘結(jié)構(gòu)中呈離散分布，但是在樹突棘的頭和頸部呈聚集狀態(tài)分布[65]。

另外，與其他超分辨技術(shù)相比，STED顯微鏡獨(dú)特的三維層析能力使得其具有更深的成像深度，為其在活體成像應(yīng)用中提供優(yōu)勢。如圖7所示，Hell等利用STED顯微鏡在活體小鼠大腦視覺皮層中，實(shí)現(xiàn)了深度達(dá)40 μm的樹突棘中肌動蛋白微絲的超分辨表征，并在43～70 nm的分辨率下揭示了樹突棘形態(tài)的動態(tài)變化[66]。

4 總結(jié)與展望

憑借其超高分辨率，STED顯微成像在生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域已發(fā)揮了重要的作用，證實(shí)了對一些亞細(xì)胞尺度細(xì)胞結(jié)構(gòu)的猜想，發(fā)現(xiàn)普通熒光顯微鏡無法觀察到的新現(xiàn)象[67]。但是，STED顯微術(shù)的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，包括成像裝置復(fù)雜、熒光探針抗漂白能力差難以實(shí)現(xiàn)長時間追蹤、STED損耗光可能具有光毒性、高時間分辨和空間分辨難以同時獲得等，這些問題的解決都將促進(jìn)STED顯微術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。例如設(shè)計合成結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的熒光染料、具有更小尺寸和更高亮度的納米顆粒熒光探針、發(fā)展適用于活細(xì)胞的特異性標(biāo)記策略將為STED成像領(lǐng)域的應(yīng)用帶來新的契機(jī)；開發(fā)靈敏度更高、探測速度更快的探測器，將有效地提高活細(xì)胞和活體的成像質(zhì)量和速度；簡化STED光路系統(tǒng)、發(fā)展小型STED顯微鏡等將會降低裝置的復(fù)雜性和成本，有利于STED顯微鏡的更廣泛使用；促進(jìn)STED顯微鏡與其他成像表征技術(shù)的聯(lián)用，將幫助我們同時獲取更多的樣品信息等。隨著STED超分辨顯微術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，它將成為研究生命過程中分子機(jī)制的重要分析技術(shù)。