硒化銅納米晶體的高效抗菌活性研究

呂文毅， 李 雪， 郭青娟， 鄒鴻雁， 黃承志*

(1.發(fā)光與實時分析化學教育部重點實驗室，西南大學藥學院，重慶 400715; 2.生化醫(yī)學分析重慶市重點實驗室，西南大學化學化工學院，重慶400715)

細菌是所有生物中數(shù)量最多的一類，它是最為常見的一種病原體，可引起許多嚴重疾病的爆發(fā)[1 - 2]，如肺結(jié)核、淋病、梅毒、鼠疫等。抗菌材料是指通過一定工藝，將抗菌劑添加到基體材料中制備成的具有殺滅和抑制微生物生長的一類新型功能材料[3]，該材料在醫(yī)療衛(wèi)生、家庭用品、家用電器、食品包裝等領(lǐng)域有極其廣闊的應用前景。在人們對環(huán)境衛(wèi)生要求日益提高的今天，抗菌材料的應用受到更加廣泛的關(guān)注。

圖1 Cu2-xSe NCs抗菌活性示意圖Fig.1 Schematic representation of the antibacterial activity of Cu2-xSe NCs

對病原微生物有殺死或抑制生長作用的抗菌劑是抗菌材料的核心部分，它可分為無機抗菌劑、有機抗菌劑和天然抗菌劑[4]。其中，無機抗菌劑一般利用銀、銅、鋅等金屬自身的抗菌能力而制成抗菌劑[5]，其耐熱性較好且抗菌廣譜；有機抗菌劑主要為香草醛或乙基香草醛類化合物[6]，但耐熱性較差，容易水解，且有效期短；天然抗菌劑主要來源于天然植物的提取，這也導致其數(shù)量較少且不能廣譜抗菌。納米技術(shù)的快速發(fā)展提供了用納米材料控制病原微生物的可能和機會，由于其具有獨特的化學和物理性質(zhì)，現(xiàn)今已成為新型抗菌劑[7 - 8]。與銀相比，銅的價格更低廉，且對各種細菌菌株具有優(yōu)異的抗菌活性，因此銅基納米材料越來越受歡迎。革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌對銅基納米顆粒特別敏感，因此可用于治療燒傷、手術(shù)傷口和糖尿病足潰瘍感染[9]。作為抗菌劑，硫?qū)巽~化物擁有耐熱性好、毒性低的優(yōu)點，且可廣譜持續(xù)抗菌[10]。基于硫?qū)巽~化物的這些特點，本實驗利用硫?qū)巽~化物的重要代表之一的硒化銅納米晶體(Cu2-xSe NCs)進行廣譜抗菌。我們以常見的E.coli(革蘭氏陰性菌)和S.aurues(革蘭氏陽性菌)為模型菌株(圖1)，通過測定細菌存活率、細菌生長曲線和殺菌曲線，納米材料的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，以及殺菌動力學來評價Cu2-xSe NCs的抗菌性能。實驗結(jié)果顯示，Cu2-xSe NCs對大腸桿菌及其耐藥菌株的MIC均為32 μg/mL，而對金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株的MIC則為4 μg/mL，這是由于大腸桿菌具有雙層膜而金黃色葡萄球菌僅有單層膜。此外，僅需32 μg/mL Cu2-xSe NCs就可在1 h內(nèi)殺死所有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，證明了Cu2-xSe NCs擁有良好的抗菌性能。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

細菌實驗使用的所有玻璃器皿、試劑和材料均用LDZX-40SBI蒸汽壓力滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)進行高溫滅菌；所有細菌實驗均在SW-CJ-IF(蘇凈集團安泰公司)潔凈工作臺上進行；細菌培養(yǎng)均在型號為QYC211 INCUBATOR SHAKER的全溫空氣搖床(上海?，攲嶒炘O備有限公司)中進行；Biotek多功能酶標儀Synergy H1(美國)用于測定細菌的OD600；實驗所用細菌菌種均在-80 ℃的冰箱中保存，接種和純化后的細菌均在0 ℃的冰箱中保存。

1.2 實驗試劑及材料

合成Cu2-xSe NCs所用的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和CuSO4·5H2O(99%)從國藥化學試劑(上海)有限公司購買。SeO2(99.9%)購自阿拉丁化學(上海)有限公司。維生素C(VC)購自Alfa Aesar Co.Ltd(美國)。配制細菌Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基所用酵母提取物來自拜爾迪生物(OXOID)公司，蛋白胨來自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，NaCl(分析純)來自成都市科龍化工試劑廠，瓊脂粉來自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。實驗中其他溶劑均為分析純，水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

實驗菌種大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli,ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus,ATCC 25923)、大腸桿菌耐藥菌(L339)、金黃色葡萄球菌耐藥株(L393)均由西南醫(yī)院檢驗科提供。

1.3 硒化銅納米晶體的制備

本文采用溫和的室溫水相法合成Cu2-xSe NCs。具體方法參照Lie等的合成原理[11]并略有改進。將800 μL 30 mmol/L CTAB和2.4 mL H2O加入圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下，依次加入50 μL 0.2 mol/L SeO2和300 μL 0.2 mol/L VC。反應10 min后，加入50 μL 0.4 mol/L CuSO4·5H2O和400 μL 0.2 mol/L VC。劇烈攪拌混合溶液，在30 ℃下反應1.5 h，并將混合溶液用10 kDa透析袋透析純化24 h以去除小分子，然后再離心去除大分子。將合成的等離子體Cu2-xSe NCs儲存在4 ℃冰箱，待用。

1.4 培養(yǎng)基的配制

按照每1 L培養(yǎng)液中含5 g酵母提取液、10 g蛋白胨、10 g NaCl、15 g瓊脂的比例配制LB固體培養(yǎng)基，并按照每200 mL培養(yǎng)液中含1 g酵母提取液、2 g蛋白胨、2 g NaCl的比例配制LB液體培養(yǎng)基。將制備的培養(yǎng)基放入錐形瓶中，搖晃均勻，并配制50 mL含0.9%NaCl溶液備用。將抑菌實驗使用的培養(yǎng)皿、試管(試管上端用棉花堵住)、移液槍槍頭、EP管(微量離心管)，以及加入培養(yǎng)液的錐形瓶、加入NaCl溶液的廣口瓶、接純水的廣口瓶用報紙包好，在高溫滅菌鍋中于120 ℃滅菌30 min。待滅菌鍋降溫至60 ℃ 左右時取出所有物品，并輕輕搖晃錐形瓶中的培養(yǎng)液使其混合均勻，待沒有氣泡后將其倒入培養(yǎng)皿中使其自然冷卻凝固，用保鮮膜包裹后放入4 ℃的冰箱中待用。上述過程均在無菌操作臺上進行，且無菌操作臺必須提前打開紫外燈殺菌30 min，傾倒培養(yǎng)液和自然冷卻的過程需一直通風確保沒有雜菌。

1.5 標準菌株細菌懸液的配制

于-80 ℃冰箱中取出標準菌株，將接菌環(huán)置于酒精燈上直至燒紅，冷卻后用接菌環(huán)沾取菌液在培養(yǎng)基上輕輕平行地畫線，梯度稀釋三次。將畫好線的培養(yǎng)基置于全溫空氣搖床中進行細菌的一代活化，時間為12 h。取出一代活化的細菌，重復接菌的步驟，挑取單菌落，將其放入全溫空氣搖床，在37 ℃下孵育12 h進行細菌的二代活化。測其OD值，當OD在0.6～0.8，表明細菌處于旺盛生長的對數(shù)生長期。

向試管中加入1 mL 0.9% NaCl溶液，將接菌環(huán)置于酒精燈上直至燒紅，冷卻后用接菌環(huán)挑取單菌落，并將其放入試管中，讓細菌分散于NaCl溶液中，此時溶液將變得渾濁。采用BaSO4比濁法，制得濃度為1.0×108CFU/mL(CFU：菌落形成單位)的細菌懸液。以下抑菌實驗所用的細菌懸液均在此基礎上稀釋了100倍，即細菌懸液的濃度均為1.0×106CFU/mL。以上步驟均在無菌操作臺上進行。

1.6 細菌存活率的測定

取100 μL濃度為1.0×106CFU/mL的細菌懸液，100 μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液和800 μL LB液體培養(yǎng)基加入已滅菌的試管，混合均勻后放入恒溫搖床，在37 ℃、120 r/min下孵育24 h。用酶標儀測其OD600值并計算細菌的存活率。

1.7 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)是描述藥物抗菌活性的主要定量參數(shù)，也是衡量抗菌試劑抑菌能力的重要指標。在本文中，我們使用液體培養(yǎng)基稀釋法測定MIC和MBC。取一系列EP管并寫上編號，采用二倍稀釋法，依次加入100 μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液，再加入100 μL 1.0×106CFU/mL細菌懸液和800 μL LB液體培養(yǎng)基，混勻后置于37 ℃全溫搖床孵育24 h。取出試管，觀察各EP管的渾濁程度，第一個澄清透明的EP管所對應的濃度即為MIC。

將所有未生長細菌試管及MIC的前一個試管中的培養(yǎng)液取200 μL轉(zhuǎn)移到干凈的固體LB培養(yǎng)基上，涂板并在37 ℃全溫搖床中孵育12 h，觀察細菌生長情況。如果培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn)，則說明該濃度只能抑制細菌生長而不能殺死細菌，若無菌落或只有少量菌落(小于5)出現(xiàn)則表明該濃度有殺菌效果。第一個無細菌生長的板所對應的濃度即為MBC。

1.8 細菌生長曲線的測定

取一塊96孔板進行該實驗，向每孔中加入100 μL溶液，該溶液為1.0×106CFU/mL細菌懸液和Cu2-xSe NCs的混合溶液。其中，對于E.coli，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、2、4、8、16、32 μg/mL；對于S.aureus，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5、1、2、4、8 μg/mL。每個濃度做3個平行樣，第4個孔為調(diào)零孔，該孔溶液為只含有相應濃度Cu2-xSe NCs的LB液體培養(yǎng)基，即為菌液存在。加好樣后將其置于37 ℃恒溫箱中孵育，并分別于0、1、2、4、6、8、12、16 h取出，搖勻后用酶標儀測定OD600。去除底物吸光度后，以孵育時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制細菌的生長曲線。

1.9 時間-殺菌曲線的測定

取100 μL濃度為1.0×106CFU/mL的細菌懸液，100 μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液和800 μL LB液體培養(yǎng)基加入已滅菌的試管。其中，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC，即對于E.coli，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、16、32、64、128、256 μg/mL；而對于S.aureus，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、2、4、8、16、32 μg/mL。每個濃度做3個平行樣。加好樣后將其置于37 ℃恒溫箱中孵育，并分別于0、1、2、4、8、12 h取出，涂板后繼續(xù)置于37 ℃恒溫箱中孵育12 h，計算菌落數(shù)。以時間為橫坐標，菌落數(shù)為縱坐標，繪制時間-殺菌曲線。

1.10 硒化銅納米晶體中銅離子的釋放

取一定量的Cu2-xSe NCs裝入10 kDa透析袋中，并將其放入500 mL超純水中，在室溫下攪拌透析。分別于1、2、4、6、8、12、24 h用原子吸收光譜儀測定透析袋外液中Cu2+的濃度并繪制Cu2+釋放曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 硒化銅納米晶體的表征

用水熱法合成的Cu2-xSe NCs分散均勻且粒徑均一，約為12.8 nm，因其獨特的銅缺陷結(jié)構(gòu)而在近紅外區(qū)具有強烈的局域表面等離子體共振吸收。此外，由于所用包被劑為CTAB，所以該Cu2-xSe NCs表面帶正電。Cu2-xSe NCs的表征結(jié)果見圖2。

圖2 Cu2-xSe NCs的表征。(A)Cu2-xSe NCs的透射電鏡(TEM)圖像;(B)Cu2-xSe NCs的粒度分布，其通過在視野中隨意計數(shù)100個顆粒而獲得;(C)Cu2-xSe NCs的UV-Vis吸收光譜；(D)Cu2-xSe NCs和H2O的Zeta電位Fig.2 Characterization of Cu2-xSe NCs.(A) TEM image of Cu2-xSe NCs;(B) Particle size distribution map of Cu2-xSe NCs obtained by randomly counting 100 particles in the field of view;(C) UV-Vis absorption spectrum of Cu2-xSe NCs;(D) Zeta potential of Cu2-xSe NCs and H2O

2.2 硒化銅納米晶體對常見致病菌的抗菌活性

本實驗從Cu2-xSe NCs對E.coli和S.aureus的細菌存活率、MIC和MBC三個方面考察其抗菌活性。如圖3所示，隨著Cu2-xSe NCs濃度的增加，無論是E.coli還是S.aureus，其細菌存活率都逐漸下降。此外，Cu2-xSe NCs對S.aureus的影響明顯強于對E.coli的影響。對于E.coli，當Cu2-xSe NCs的濃度為32 μg/mL時，細菌存活率為0，即無細菌生長，而對于S.aureus，只需4 μg/mL的Cu2-xSe NCs已可以抑制其生長。Cu2-xSe NCs對常見致病菌的MIC測定進一步證實了上述結(jié)論。因MIC是指引起細菌肉眼觀察下未見生長的藥物最低濃度，故我們選擇肉眼可見細菌培養(yǎng)液澄清透明的EP管對應的Cu2-xSe NCs濃度為該材料的MIC。如圖4所示，Cu2-xSe NCs對E.coli的MIC為32 μg/mL，對S.aureus的MIC為4 μg/mL。這一現(xiàn)象也和其細菌存活率結(jié)果一致。

圖3 Cu2-xSe NCs對E.coli(A)和S.aureus(B)細菌存活率的影響Fig.3 Effect of Cu2-xSe NCs on bacterial viability of E.coli(A) and S.aureus(B)

圖4 Cu2-xSe NCs對常見致病菌的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)Fig.4 MIC of Cu2-xSe NCs against common pathogens(Cu2-xSe NCs concentration unit is μg/mL)

以MIC為界，將MIC及其后未長菌試管和MIC的前一個試管中的培養(yǎng)液取200 μL轉(zhuǎn)移到干凈的固體LB培養(yǎng)基上，涂板并在37 ℃全溫搖床中孵育12 h，觀察細菌生長情況，結(jié)果見圖5。對于E.coli，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC為32 μg/mL，而對于S.aureus，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC則為4 μg/mL。

圖5 Cu2-xSe NCs對常見致病菌的MBCFig.5 MBC of Cu2-xSe NCs against common pathogens

2.3 硒化銅納米晶體對耐藥菌株的抗菌活性

圖6 Cu2-xSe NCs對E.coli耐藥菌株(A)和S.aureus耐藥菌株(B)細菌存活率的影響Fig.6 Effect of Cu2-xSe NCs on bacterial viability of E.coli resistant strains (A) and S.aureus resistant strains (B)

考察了Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的抗菌活性，其內(nèi)容為Cu2-xSe NCs對E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株的細菌存活率、MIC和MBC三個方面。如圖6所示，Cu2-xSe NCs對耐藥菌株細菌存活率的影響和對其普通菌株的影響相似，對于E.coli耐藥菌株，當Cu2-xSe NCs濃度為32 μg/mL時，細菌存活率為0，而對于S.aureus耐藥菌株，只需4 μg/mL Cu2-xSe NCs。

Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的MIC也和對其普通菌株的MIC一致，對于E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株，MIC分別為32 μg/mL和4 μg/mL(圖7)。而Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的最小殺菌濃度MBC則不太相同(圖8)。對于E.coli耐藥菌株，Cu2-xSe NCs的MBC為32 μg/mL，對于S.aureus耐藥菌株，Cu2-xSe NCs 的MBC為8 μg/mL，和Cu2-xSe NCs對S.aureus普通菌株的MBC 4 μg/mL相比，略高。

圖7 Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)Fig.7 MIC of Cu2-xSe NCs against resistant strains(Cu2-xSe NCs concentration unit is μg/mL)

圖8 Cu2-xSe NCs對耐藥菌株的MBCFig.8 MBC of Cu2-xSe NCs against resistant strains

2.4 硒化銅納米晶體的抑菌動力學

為了探究Cu2-xSe NCs對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的的抑菌動力學，我們測定了細菌生長曲線和時間-殺菌曲線。如圖9所示，對于E.coli，細菌在孵育2 h后開始進入對數(shù)生長期，直至12 h后進入平臺期。隨著Cu2-xSe NCs濃度的逐漸增加，雖然細菌的生長趨勢并未改變，但是增長速度逐漸減小，當其濃度為16 μg/mL時，細菌在孵育8 h后才進入對數(shù)生長期并于12 h后進入平臺期；而當Cu2-xSe NCs濃度增加到32 μg/mL時，即達到MIC時，細菌不再生長。對于S.aureus，細菌在孵育1 h后就開始進入對數(shù)生長期，12 h后進入平臺期。并且S.aureus受Cu2-xSe NCs濃度影響更大，隨著其濃度的逐漸增加，細菌的增長速度大幅降低。當Cu2-xSe NCs濃度到達MIC時，細菌基本不生長。再一次證明了S.aureus對Cu2-xSe NCs更敏感。

圖9 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的生長曲線Fig.9 The growth curve of common pathogens inhibited by Cu2-xSe NCs

時間-殺菌曲線可以評估一種抗菌藥物對細菌的殺菌速率。我們?nèi)u2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC進行實驗(圖10)。對于E.coli，當Cu2-xSe NCs濃度為0或者0.5倍MIC時，細菌數(shù)目持續(xù)增長，但當其濃度到達32 μg/mL，即Cu2-xSe NCs對E.coli最小殺菌濃度MBC時，細菌在1 h內(nèi)全部死亡。對于S.aureus，當Cu2-xSe NCs濃度為0時，細菌不斷生長，但隨著其濃度的增加，細菌逐漸減少，當其到達Cu2-xSe NCs對S.aureus最小殺菌濃度的MBC(4 μg/mL)時，細菌在8 h 內(nèi)全部死亡。伴隨著Cu2-xSe NCs濃度的不斷增大，細菌死亡時間愈來愈短，當其為32 μg/mL時，細菌在1 h內(nèi)全部死亡。即，當Cu2-xSe NCs濃度為32 μg/mL時，不管是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌，都會在1 h內(nèi)全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強的殺菌性能。

圖10 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的時間-殺菌曲線Fig.10 The times-killing curve of common pathogens inhibited by Cu2-xSe NCs

2.5 硒化銅納米晶體的抗菌機制

圖11 Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線Fig.11 Cu2+ release curve in Cu2-xSe NCs

在抗菌劑抗菌機制研究中，較為公認的有四種途徑：其一，金屬離子接觸反應，這也是無機抗菌劑最普遍的抗菌作用機理；其二，催化激活機理，即通過催化產(chǎn)生活性氧物質(zhì)從而殺死細菌；其三，陽離子固定機理，即抗菌劑攜帶陽離子基團，以此固定負電荷的細菌，從而使其接觸性死亡并破壞細胞壁和細胞膜；其四，細胞內(nèi)容物、酶、蛋白質(zhì)、核酸損壞機理，這是許多有機抗菌劑的抗菌機理。為考察Cu2-xSe NCs的抗菌機制，我們首先測定Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線(圖11)，不斷增加的Cu2+濃度證明了Cu2-xSe NCs可以持續(xù)釋放Cu2+，從而實現(xiàn)持久抗菌的作用。其次，我們使用了活性氧(ROS)熒光探針DCFH-DA，并通過熒光共聚焦分析Cu2-xSe NCs與細菌作用是否有活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，通過實驗我們發(fā)現(xiàn)Cu2-xSe NCs并不會產(chǎn)生ROS，即不是通過催化激活機理殺死細菌。Zeta電位(圖2D)證實Cu2-xSe NCs因其包被劑為CTAB，一種帶季胺鹽基團的陽離子表面活性劑而帶正電，證明Cu2-xSe NCs可通過陽離子固定機理實現(xiàn)殺菌。最后我們考察了細胞內(nèi)容物、酶、蛋白質(zhì)、核酸損壞機理，實驗結(jié)果證明Cu2-xSe NCs并不能通過該途徑滅菌。

綜上所述，Cu2-xSe NCs的殺菌性能主要依靠金屬離子接觸反應和陽離子固定機理實現(xiàn)。

3 結(jié)論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，Cu2-xSe NCs擁有較強的殺菌性能，對常見的E.coli(革蘭氏陰性菌)和S.aureus(革蘭氏陽性菌)表現(xiàn)出殺菌活性，并且對其耐藥菌株具有良好抑菌能力，而S.aureus對Cu2-xSe NCs更為敏感，這是由于E.coli具有雙層膜而S.aureus僅擁有單層膜。此外，當Cu2-xSe NCs濃度為32 μg/mL時，不管是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌，都會在1 h內(nèi)全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強的殺菌性能。因此，在新型抗菌藥的研究中，納米材料Cu2-xSe NCs具有成為新型抗菌劑的潛力。