STZ制備糖尿病大鼠模型影響因素的研究進展

韓旭,王璇,余芝,徐斌

(南京中醫(yī)藥大學針藥結(jié)合教育部重點實驗室,南京 210023)

2019年,國際糖尿病(diabetes mellitus,DM)聯(lián)合會發(fā)布數(shù)據(jù)顯示:2019年全球DM患病率為9.3%,2030年將上升到10.2%,2045年將上升到10.9%[1]。迫切需要更優(yōu)的診療方案來對抗DM,而臨床前模擬人類DM的動物模型至關重要。相比基因動物,化學藥物損傷胰島功能誘導DM操作簡單、成本低、應用更廣泛[2]。常用試劑是鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和四氧嘧啶(alloxan,ALX),ALX在1943年首次用來誘導DM[3],它通過氧化應激破壞胰腺β細胞,但和STZ比,有效性低、副作用大,會引起肝、腎毒性,故應用較少[4]。STZ最初是在1960年從不產(chǎn)色鏈霉菌中分離出來的,是一種亞硝基脲類似物,其DM致病性到1963年被報道[5],STZ對胰島β細胞有高度選擇性破壞作用,通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2進入β細胞,其細胞內(nèi)作用導致DNA改變,β細胞死亡的主要原因是DNA烷基化,一氧化氮和活性氧的協(xié)同作用也可能導致STZ引起DNA斷裂和其他有害變化。DNA損傷激活多聚ADP核糖基化,導致細胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷的耗竭,蛋白質(zhì)合成減少,β細胞死亡[4,6]。STZ對其他組織器官毒性相對較小,造模成功率高,是國內(nèi)外應用最廣泛的DM模型化學誘導劑[7]。但具體應用方法各文獻報道不一,本文就STZ誘導的DM大鼠模型探討可能對模型產(chǎn)生影響的要素,以期對今后DM大鼠模型的制備有所裨益。

1 動物選擇

小鼠、大鼠、豬和猴子等對STZ敏感,兔不那么敏感[8],大鼠和小鼠較常用[9]。應用最多的是大鼠,體積小、生命周期短、來源廣泛、經(jīng)濟、壞境及遺傳因素易控制,是較理想的選擇,對于品系常使用SD或Wistar大鼠[4,10]。農(nóng)慧等[10]使用同條件STZ,Wistar大鼠死亡率>50%,SD大鼠抵抗力強于Wistar大鼠,推薦SD大鼠。且不同等級SD大鼠亦有差別,普通級死亡率>50%,SPF級死亡率僅2.17%。郭學軍等[11-12]研究顯示W(wǎng)istar大鼠的成模率和死亡率均高于SD大鼠,推測Wistar大鼠敏感性強于SD大鼠,抵抗力弱于SD大鼠。

1.1 大鼠性別

STZ作用效果與大鼠性別相關,雄性比雌性更敏感[13-14]。Ostenson等[15]用STZ誘導雄性和雌性新生大鼠2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),兩者的β細胞損傷參數(shù)無差異,但成年后雄性比雌性大鼠DM更嚴重,并證實了這種性別差異是雄激素依賴性的。Cortright等[16]研究顯示,和雌性相比,雄性大鼠在線性生長和身體成分改變方面更受STZ影響。李莉等[17]采用同條件STZ,雌性和雄性大鼠成模率分別為26.7%和46.7%。蔣升等[18]觀察了STZ誘導DM大鼠的血糖變化,雄性大鼠2周后血糖趨于穩(wěn)定,雌性大鼠4周后趨于穩(wěn)定。故除必須使用雌性的模型,建議選用雄性大鼠。

1.2 大鼠體重

陳靜等[19]研究顯示180～240 g大鼠成模率較高,隨體重增加,成模率降低,死亡率增大。張新蘭等[20]結(jié)合成模率和死亡率考慮,220～260 g大鼠最適合。黃琛等[21]結(jié)果顯示201～240 g大鼠成模率最高。后兩項研究均表示隨體重增加,死亡率逐漸降低。章成昌等[22]采用高糖高脂飲食聯(lián)合STZ誘導T2DM,體重在(240±5)g的大鼠成模率高,胰島素水平接近正常對照組,體重高于此范圍的成模率低,胰島素水平偏低。綜上建議選用體重在220～240 g的大鼠。

1.3 大鼠年齡

Wang等[23]探究了STZ對6～23周齡大鼠的毒性作用,發(fā)現(xiàn)STZ注射1周內(nèi)動物的急性死亡率和年齡成反比,為降低死亡率應選擇周齡<12周的大鼠,如需更年長的動物,應考慮降低劑量。大鼠β細胞數(shù)量增加能力隨年齡減弱,當年齡>1歲后似乎沒有這種能力,故不同年齡段大鼠對同劑量STZ的反應不同。高脂飲食(high fat diet,HFD)聯(lián)合STZ的T2DM模型多使用4～12周的大鼠,8周最常用[24]。STZ聯(lián)合煙酰胺(nicotinamide,NA)的T2DM模型常用6～12周的大鼠,較年輕的大鼠對STZ的敏感性低,可以被NA更好的保護[4]。使用STZ誘導1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)較常用8～10周的大鼠[25]。陳玥等[26]匯總了常用實驗動物和人類年齡相關性理論及計算方式,制成人類年和動物日匹配表,可以根據(jù)研究目的參考選擇適合日齡的大鼠。

2 實驗方案及操作

2.1 STZ注射前禁食時間

STZ分子含有一個高度活性葡萄糖側(cè)鏈,β細胞會對其錯誤識別,毒性基因隨即帶入細胞內(nèi),如果注射前或中給予含葡萄糖的物質(zhì)或類似物,會與STZ競爭性的和β細胞結(jié)合,影響STZ發(fā)揮毒性作用,故注射前動物應充分禁食[27-28]。有研究探究了禁食對成模的影響,黃琛波等[29]結(jié)果顯示非空腹組成模率為60%,空腹組為66.7%。黃琛等[21]結(jié)果顯示正常飲食組成模率33.3%,禁食組成模率66.6%。葉桐江等[30]觀察了STZ注射前禁食12、16、20、24 h的造模情況,隨禁食時間的延長,造模率逐漸增高,但當超過20 h,成模率無明顯上升,死亡率大幅增高,故建議20 h為最佳禁食時間。

2.2 STZ劑量

STZ用量主要取決于想要模擬DM的類型及嚴重程度[14]。通常參考已發(fā)表文獻,但即使同一品系動物來自不同供應商也存在差異,建議先進行預實驗確定所用劑量。從造模成功率、死亡率、緩解率綜合評判,以成模率高、病死率低、緩解率低為最佳劑量[7]。STZ價格較昂貴,盧慧等[31]通過建立數(shù)學模型描述制作DM大鼠模型的成本,根據(jù)對血糖值及病程的要求計算出STZ劑量和大鼠體重的最優(yōu)組合,但其僅考慮了死亡率和未成模率,未把發(fā)病機理的因素納入。本文根據(jù)STZ注射劑量和次數(shù)分為:大劑量單次、小劑量單次和小劑量多次。

2.2.1 大劑量單次

大劑量單次多用于誘導T1DM,損傷胰島導致胰島素分泌絕對減少而血糖增高。熊煜欣等[32]設置了20～60 mg/kg梯度劑量組,STZ注射5 d后,20、30 mg/kg組血糖依舊在正常范圍,說明此劑量不足以引起足夠的β細胞損害,另外3組均出現(xiàn)高血糖,50、60 mg/kg組成模率均為100%。高鑫等[28]對不同劑量STZ比較發(fā)現(xiàn),劑量越小轉(zhuǎn)陰率越高,不應<40 mg/kg。黃琛等[21,33]比較了40、50、60 mg/kg STZ的造模情況,50 mg/kg最佳。葉桐江等[30]比較了50、60、70 mg/kg STZ,成模率均較高,死亡率隨劑量增加成倍增加,故推薦50 mg/kg。李釗至等[34]建議劑量在40～50 mg/kg最合適,45 mg/kg有較高的成模率和較低的死亡率。郭延敏[35]設置了55～70 mg/kg梯度劑量,65 mg/kg成模率較高、死亡率低,與以上研究差異較大,可能是成模標準定的過高。綜上建議STZ誘導T1DM單次注射劑量45～50 mg/kg。

大劑量單次誘導T2DM,使用STZ聯(lián)合NA,NA是維生素B3的酰胺形式,利于細胞內(nèi)DNA修復、維持煙酰胺腺嘌呤二核苷酸水平,對胰島β細胞化學性與免疫性損傷有明顯的防護作用[9,36]。NA對STZ的DM效應起保護作用,STZ聯(lián)合NA是一種非胰島素抵抗、胰島素缺乏的T2DM模型[9]。Masiello等[37]比較了100～350 mg/kg范圍內(nèi)4個濃度的NA,結(jié)果顯示230 mg/kg NA結(jié)合65 mg/kg STZ致約60%的β細胞功能喪失,產(chǎn)生穩(wěn)定、中度高血糖。Furman等[9]重復了上述方案,結(jié)果顯示75%～80%的大鼠出現(xiàn)中度高血糖。此方法主要變量是NA劑量(60～290 mg/kg)、STZ劑量(45～65 mg/kg)和間隔時間(普遍15 min)。翁琰等[38]設置了100～200 mg/kg不同劑量NA聯(lián)合65 mg/kg STZ造模,120 mg/kg組成模率為80%,無死亡,為最優(yōu)劑量。

2.2.2 小劑量單次

小劑量單次多用于誘導T2DM。T2DM多發(fā)于成年,遺傳易感性固然存在,但營養(yǎng)過剩、生活習慣不良等導致的超重、肥胖在病程中起重要作用[39]。DM前期患者通常會存在以高胰島素血癥、胰島素抵抗和血脂異常為特征的肥胖狀態(tài)[24,40]。肥胖是T2DM發(fā)展最常見的危險因素[41]。T2DM早期以糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗為主,晚期以胰島素相對缺乏為主,理想的模型應具備以上特點[42-44]。HFD可以引起糖脂代謝紊亂,通過糖脂肪酸循環(huán)、胰島素信號轉(zhuǎn)導等途徑降低胰島素敏感性[44]。單純HFD可以誘導DM,短期內(nèi)可引起胰島素抵抗和/或葡萄糖耐受不良,但要使血糖升高需更長時間(>10周)[4]。早期代償機制(β細胞的數(shù)量增加或功能增強)可以維持血糖正常,這時如給予小劑量STZ輔助部分破壞β細胞,機體失去了足夠的代償能力,短期內(nèi)即可造模成功[24,45]。

HFD的成分和喂養(yǎng)時間都會影響體重增加和脂肪分布,本文主要探討喂養(yǎng)時間,短期往往會誘發(fā)胰島素抵抗和/或葡萄糖耐受不良,相對長期(5周)會導致更高的體脂率,發(fā)展肥胖癥要更長時間(>3個月),可以根據(jù)需要模擬的DM前期狀態(tài)選擇喂養(yǎng)時間[24]。HFD喂養(yǎng)時間的長短和胰島素抵抗程度、血脂異常程度正相關,和STZ用量負相關,但考慮到動物生命周期、慢性并發(fā)癥的發(fā)展及后續(xù)實驗,建議8周為宜[46-48]。陸少君等[49]比較了4周和8周HFD的造模差異,發(fā)現(xiàn)8周動物生存狀態(tài)差,4周更佳,減少了死亡率,縮短實驗周期和成本。T2DM典型特征包括胰島素抵抗和胰島功能受損,桑延霞等[50]研究顯示,高熱量飲食僅能誘導約50%的大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗,因此誘導后需先測量空腹胰島素,篩選胰島素抵抗大鼠,淘汰肥胖抵抗大鼠,保留肥胖大鼠,再行STZ,使病理機制保持一致。少有報道STZ給藥前高胰島素血癥、肥胖癥、葡萄糖耐量降低等數(shù)據(jù),它們代表DM前期狀態(tài),可以反映模型這一階段的病理類型[24]。

小劑量單次的用量要區(qū)分于T1DM,即單獨使用不能致高血糖,小部分破壞胰島細胞,又保證一定的成模率[48]。楊架林等[51]研究顯示,同用25 mg/kg,只有在HFD后才能引起高血糖,普通飼料喂養(yǎng)不能引起高血糖,因為動物本身沒有胰島素抵抗,β細胞對于小損傷還可以代償。2周HFD后,Islam等[52]分組給予30、40、50 mg/kg STZ,發(fā)現(xiàn)40 mg/kg組更符合T2DM的特點;徐文平[53]進行了40、45、50 mg/kg的劑量比較,45 mg/kg成模率最高,無死亡。4周HFD后,李柱云等[54]比較了30、40、50 mg/kg STZ的造模情況,結(jié)果顯示40 mg/kg組具有T2DM的主要特征,成模率最高,死亡率較高劑量低,穩(wěn)定性較低劑量好。肖艷紅等[55]比較了15～45 mg/kg STZ,35 mg/kg最佳。陸少君等[49]比較35、40 mg/kg STZ造模,成模率相同但40 mg/kg死亡率較高。邵俊偉等[56]采用35 mg/kg STZ,除因注射不當未成模外,其余均成模,無死亡,建議劑量在30～40 mg/kg。章成昌等[22]采用35 mg/kg STZ,成模率93%,無死亡。8周HFD后,何清華等[57]注射STZ 30 mg/kg,成模率100%,無死亡。同劑量魏占英等[58]成模率80%,死亡率30%,優(yōu)于其他方案。周迎生等[59]建議HFD喂養(yǎng)4～8周后,以25～40 mg/kg STZ為宜。張汝學等[60]采用3個月HFD加30 mg/kg STZ,模型成功后如停用HFD,空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)會在5～7 d后恢復正常,建議成模后最好維持HFD。綜上,HFD喂養(yǎng)時間越長,胰島素抵抗越明顯,需要STZ的量越少。

2.2.3 小劑量多次

劉霆等[61]應用STZ誘導T1DM,30 mg/kg每周1次,連續(xù)4周,觀察到STZ誘導胰島損傷有量效和時效關系,即逐漸加重胰島損傷。大多數(shù)T1DM患者由于自身免疫系統(tǒng)紊亂,β細胞被嚴重破壞,胰島素分泌絕對不足而導致血糖升高,是一個自身免疫系統(tǒng)參與的漸進過程。小劑量多次可以不斷激活自身免疫反應,破壞免疫機制,最終出現(xiàn)穩(wěn)定持久的DM。和大劑量單次比,能更好的模擬T1DM的發(fā)病過程,降低死亡率,不過造模周期較長。曾新生等[62]認為一次性大量破壞胰腺β細胞使動物迅速達到過高的FBG(>20 mmol/L),不能很好的模擬T1DM,其采用30或40 mg/kg隔天注射3次,期間喂養(yǎng)1%葡萄糖水,成模率較高。孟召祥等[63]采用35 mg/kg每周1次,連續(xù)4周,成模率91%,無死亡。

亦有HFD結(jié)合小劑量多次注射STZ的造模研究。林心君等[64]在4周HFD后,2次注射STZ,對注射的間隔時間和用量進行探索,證實以25 mg/kg間隔2 d最佳,劑量計算使用體重聯(lián)合表面積的算法,因當大鼠>300 g時,單純以體重計算導致2/3大鼠死亡。此方案成模率高,無死亡,8周后無自愈。Zhang等[65]等認為小劑量多次注射可能會引起毒性反應和免疫反應的結(jié)合,逐漸引發(fā)高血糖,4周HFD后,每周注射1次,連續(xù)2周,25 mg/kg成功率25%,30 mg/kg成功率85%。林燕超等[46]在8周HFD后,連續(xù)2 d注射20 mg/kg STZ,優(yōu)于單次注射20或30 mg/kg組。但小劑量多次工作量大,總誤差大,增加動物感染率。

大劑量單次廣泛用于T1DM的藥物實驗,小劑量多次主要用于探討胰島壞死及增殖機制的研究[66]。農(nóng)慧等[10]認為關于DM并發(fā)癥的研究,因T1DM和T2DM的病理改變基本相同,所以可采用大劑量單次注射,縮短造模周期。對于妊娠DM模型,STZ的用量從25～65 mg/kg不等,由于增加了胚胎因素,要根據(jù)具體研究目的,結(jié)合成模率、母鼠死亡率、子鼠生長狀況等因素綜合考慮[67]。López等[68]研究表明,在大鼠妊娠第6天,注射35 mg/kg STZ可以模擬不受控制的或中度的妊娠期DM的大多數(shù)病理變化。

2.3 STZ的配置

STZ粉末-20℃避光保存,其溶液極不穩(wěn)定,需現(xiàn)配現(xiàn)用,冰浴避光操作,緩沖液使用檸檬酸或枸緣酸緩沖液(pH=4.2～ 4.5),提前預冷[24,34,46,69-70]。盡管STZ在緩沖液中具有最大穩(wěn)定性,但短時間內(nèi)仍會降解,配置后要在一定時間內(nèi)盡快用完,文獻報道不一:5[9,71]、10[72]、15[70]、20[73]、30 min[30,33,49]內(nèi),最好分多次配置,保險起見在溶解后5 min內(nèi)用完。

2.4 STZ給藥途徑

STZ可以通過靜脈、皮下、腹腔給藥。黃波等[29]比較了空腹腹腔注射和尾靜脈注射的差異,后者成模率93.3%,遠大于腹腔注射組,推測可能與藥物的吸收更直接有關。也有研究表明兩種方式的成模率相當[60,74]。尾靜脈較細,不易操作,易造成藥物損耗,不好控制速度,故常選擇腹腔注射[75-76]。注射前提起腹壁30°進針,進針前先回抽,不要誤入皮下或臟器[77]。最好注射在腹部同側(cè),保持操作一致性,利于血糖的均一穩(wěn)定[56]。

2.5 STZ注射后的護理

注射后給予動物充足的水和食物,胰島細胞壞死和胰島素的突然釋放,會導致致命的低血糖,為避免在6～12 h的低血糖期出現(xiàn)死亡,可以在給藥后向動物提供10%的蔗糖水或葡萄糖水[9,28]。大鼠很快會出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀,要保證充足的供水量,及時更換墊料,保持鼠籠干燥清潔[73]。動物如出現(xiàn)無法進食、飲水、站立、體溫過低等虛弱或瀕死狀態(tài),應遵守相關動物實驗倫理規(guī)則,執(zhí)行安樂死,最大程度減少動物的痛苦[78]。

2.6 血糖測量

血糖測量最好在麻醉狀態(tài)下進行,束縛應激可致大鼠血糖升高[79]?？裳劭舨裳驍辔膊裳?但傷害較大,如測量較頻繁,可用尾靜脈采血[73,80]。采血前注意清潔消毒,避免雜質(zhì)影響測量結(jié)果,結(jié)束后止血以免感染[81]。需要注意的是,當用葡萄糖作為DM診斷時,可使用全血、血清或血漿,推薦通過標準化酶法使用靜脈血漿測量[82]。血糖精確的目標是變異系數(shù)≤2.2%,在診斷人類DM時不推薦使用測量全血的便攜式血糖儀,它們精度及重復性差且不同儀器存在差異,還沒有血糖儀達到美國DM協(xié)會設定的分析誤差<5%的目標。優(yōu)點是使用方便、創(chuàng)傷小[83]。人類測量FBG需禁食≥8 h,李莉等[17]提出20:00是大鼠進食高峰期,10:00至12:00進食基本完成,此時禁食類似人類晚飯后禁食,晚12:00至晨8:00禁食更合理。Furman等[9]認為老鼠在夜間進食,測血糖前一夜的禁食實際上禁食了24 h,可能引起影響血糖讀數(shù)的一些生理反應,可以在7:00至15:00點禁食。

3 成模判斷標準

DM模型的判定標準不一,血糖、尿糖、葡萄糖耐量、胰島素或C肽水平、胰腺組織形態(tài)學等都可以評價,最基礎的是血糖,但不同物種血糖濃度不同,因此人類DM定義不一定適于動物[84]。一般,STZ誘導的大鼠非空腹血糖水平>200 mg/dL(11.1 mmol/L),FBG>150 mg/dL(8.3 mmol/L)[9]。農(nóng)慧等[10]認為DM大鼠不耐饑餓,夜間活動量大,禁食>12 h易造成血糖過低而死亡,不推薦使用FBG,使用隨機血糖操作性更強。STZ注射后的血糖變化表現(xiàn)為急性3期反應:(1)早期高血糖(2～4 h):肝糖原分解,胰島素釋放受到抑制;(2)低血糖(6～10 h):胰島β細胞被破壞,胰島素大量釋放;(3)穩(wěn)定高血糖(24 h后):胰島β細胞呈現(xiàn)不同程度的損傷,胰島素含量下降[4]。故多數(shù)研究在至少72 h后測量血糖。

胰腺受損后胰腺導管中干細胞可以分化成胰島細胞,即胰島功能的自行緩解[85-87]。高鑫等[28]表明在10 d內(nèi)自然緩解率較高,最好成模10 d后再做實驗,減少自愈的干擾。邵俊偉等[56]研究顯示FBG在1周后達高峰,2周基本穩(wěn)定,推測其和STZ引起的慢性炎癥、自身免疫系統(tǒng)機制相關。張巨彪等[72]建議在建模后3、7、14 d測血糖,14 d的血糖依然穩(wěn)定者納入實驗。魏占英等[58]研究顯示STZ注射9 d后,FBG≥20 mmol/L的大鼠血糖始終維持較高的水平,反映內(nèi)源性胰島素分泌功能較差;FBG<10 mmol/L大鼠的血糖隨后會出現(xiàn)一定程度的下降;FBG處于10～19.9 mmol/L的穩(wěn)定性好,更適合T2DM的研究。FBG在10 d內(nèi)波動,17 d后基本穩(wěn)定[88]。汪峰等[89]誘導T1DM模型發(fā)現(xiàn)自愈都發(fā)生在STZ注射3周內(nèi),3周后趨于穩(wěn)定且長期維持,建議至少連續(xù)3周監(jiān)測,確保模型質(zhì)量。魏澤寧[90]等建立T1DM模型,對于單次給藥未成模的大鼠,1周后給予同劑量STZ補救,補救組均成模且和首次成模組血糖值無統(tǒng)計學差異,但在組織器官上的差異未探究。對于血糖過高(>30 mmol/L)的大鼠,在不影響實驗的前提下,可給予胰島素適當維持生命周期[30,77]。

大鼠DM診斷尚未標準化,但有3點共識:(1)同一實驗中對照組和造模組采用同一方法測血糖,即動物均處于空腹或非空腹狀態(tài);(2)同一實驗不同時使用FBG和非空腹血糖來判定;(3)高血糖被定義為模型組的血糖明顯高于對照組,有統(tǒng)計學意義[9]。對于T2DM,高胰島素—正常血糖鉗夾術(shù)是測定胰島素敏感性的金標準方法[91]。糖耐量、胰島素耐受程度、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)等可進一步評價模型的胰島素分泌能力和組織對胰島素的敏感性[92]。

4 其他因素

周衛(wèi)民等[93]探究了光照對STZ誘導的大鼠模型的影響,光照可能會影響動物的內(nèi)分泌和飲食,動物房內(nèi)籠架的設置和頂部照明很難保證動物接收同等光照,離光源近、光照較強處,大鼠成模率較低,反之越高,但對模型的穩(wěn)定性影響不大,提示光照也是一個影響因素。某些未知的環(huán)境條件和刺激可能會增加STZ誘導DM的變異性,應盡量保證動物處在均一的條件下[14]。

5 結(jié)語

STZ誘導造模是較理想且實用的DM造模方法,其缺點是價格昂貴,以非常快速、不自然的方式誘發(fā)DM,因此上述任何方案都無法精準地模擬人類DM[24]。模型的長度取決于研究目的,從幾天的急性研究到數(shù)周的并發(fā)癥研究,對于并發(fā)癥研究,還應考慮如何保證動物的存活時間[12]。T2DM模型成模后最好繼續(xù)維持HFD[94],或者后續(xù)再次注射STZ來維持模型穩(wěn)定[9]。目前DM動物模型分類較簡單,臨床上分類更加細致,如根據(jù)T2DM的持續(xù)時間和嚴重程度分為:FBG受損型、糖耐量受損型,再考慮到體脂、炎癥因素等分型,STZ誘導的DM大鼠模型能否有更細致的分類有待研究[12,24]。