低分子肝素通過EGFR/PI3K/Akt信號通路對胚泡植入障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響

王春雪,牛凱迪,于月新?

(1.錦州醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地生殖醫(yī)學中心,沈陽 110000;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心,沈陽 110000)

低分子肝素在生殖領域常用于復發(fā)性流產(chǎn)、反復植入失敗等多種疾病的治療。已有研究表明低分子肝素通過影響囊胚與子宮內(nèi)膜表面的粘附、滋養(yǎng)層分化和浸潤[1],對子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生調(diào)控作用,從而提高胚泡植入的成功率[2],但其具體機制仍不清楚。肝素結(jié)合性表皮生長因子(heparin binding epidermal growth factor,HB-EGF)是子宮內(nèi)膜容受性的標志物之一,HBEGF與其受體表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的相互作用是胚泡植入和滋養(yǎng)層浸潤過程中母胎對話的重要因素。

EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Serine/threonine protein kinase,PKB也稱Akt)(EGFR/PI3K/Akt)信號通路是體內(nèi)一條極為重要的信號通路,在刺激細胞外生長因子與細胞生長、分化、增殖和血管生成等多種細胞過程之間發(fā)揮重要作用[3]。本研究旨在探討低分子肝素對EGFR/PI3K/Akt信號通路的影響,探究其對子宮內(nèi)膜容受性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8～10周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠72只,體重(18±2)g,未交配過;雄性小鼠30只,體重(20±2)g,證明有生育能力,購于遼寧長生生物技術有限公司【SCXK(遼)2015-0001】,實驗動物飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學動物實驗室【SYXK(軍)2015-020】,室溫(23±2)℃,自然光照條件,自由攝食、飲水。福利倫理審查證號2019004,動物實驗過程中遵循3R原則。

1.1.2 藥物制備

吲哚美辛腸溶片,規(guī)格每片25 mg(臨汾寶珠),取25 mL在研缽中研碎,溶于25 mL生理鹽水,制成濃度為1 mg/mL的溶劑;注射用低分子量肝素鈣,規(guī)格5000 IU/支(兆科藥業(yè)),取1支溶于500 mL生理鹽水制成10 IU/mL的溶液;阿司匹林腸溶片,規(guī)格每片100 mg(湖南新匯),取50 mg在研缽中研碎,溶于10 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中,制成濃度為10 mg/mL的溶液。

1.1.3 試劑和儀器

HBEGF抗體(Affinity);pEGFR抗體(Affinity);pPI3K抗體(Affinity);pAkt抗體(Affinity);DAB顯色試劑(20×)(邁新);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(近岸蛋白);熒光定量PCR試劑盒(近岸蛋白);SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(美侖);飛克特超敏ECL液(美侖);垂直電泳槽(六一儀器);半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀(六一儀器);紫外凝膠成像儀(美國Bio-Rad);普通PCR儀(ABI);Real-time PCR儀7300(ABI);光學顯微鏡CX40(OLYMPUS);PCR引物:生工生物工程股份有限公司,引物序列及其內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)序列(見表1)。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模

將72只C57BL/6小鼠隨機分為6組,空白組、模型組、低分子肝素高劑量組、低分子肝素中劑量組、低分子肝素低劑量組、阿司匹林組,每組12只。

雌鼠每日陰道涂片觀察動情周期變化,當陰道涂片有大量無核角化上皮細胞時即為發(fā)情期,將發(fā)情期的雌鼠于每日16:00與雄鼠合籠,雌雄比2∶1。次日檢查合籠雌鼠的陰道,有陰道栓或引道涂片可見精子的小鼠視為妊娠第1天。除空白組外,其余各組用吲哚美辛建立胚泡植入障礙模型,于第2、3天的9:00和16:00皮下注射0.13 mL吲哚美辛溶劑,空白組皮下注入等量生理鹽水。第1天開始每日15:00給藥,連續(xù)5日。空白組和模型組皮下注射生理鹽水0.3 mL,低分子肝素高劑量組200 IU/kg,中劑量組150 IU/kg,低劑量組100 IU/kg皮下注射藥物,阿司匹林組100 mg/kg灌胃給藥。第5天下午尾靜脈注射1%臺盼藍0.2 mL,10 min后頸椎脫臼法處死孕鼠,取出子宮,計數(shù)小鼠子宮植入位點數(shù)。PBS緩沖液沖洗子宮,將子宮分為兩部分,一部分4%甲醛固定,用于免疫組化檢測,另一部分液氮速凍后-80℃保存,用于Western Blot、Real-time PCR檢測。

1.2.2 胚泡植入位點數(shù)

每組平均植入位點數(shù)=該組植入胚泡總數(shù)/該組妊娠小鼠數(shù)

1.2.3 RT-PCR法檢測HB-EGF、EGFR、PI3K、Akt基因表達

TRIzol法提取總RNA;逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;熒光定量檢測CT值,每個樣品重復3次;2-△△Ct法計算基因表達量。

1.2.4 免疫組化法檢測HB-EGF、EGFR、PI3K、Akt蛋白定位

切片、貼片;脫蠟、水化;封閉;一抗4℃過夜;二抗孵育;DAB顯色;蘇木素復染;脫水、透明;中性樹脂封片。

1.2.5 Western Blot檢測HB-EGF、EGFR、PI3K、Akt蛋白表達

蛋白提取;BCA蛋白定量;SDS-PAGE凝膠制備;上樣電泳;半干法轉(zhuǎn)膜;抗體雜交;印記膜發(fā)光;用Image-Pro Plus 6.0軟件對目的條帶進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示。組間比較差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩比較采用LSD法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胚泡植入位點數(shù)

與空白組比較,模型組平均胚泡植入位點數(shù)降低(P<0.05),證明建模成功。與模型組比較,藥物治療組平均胚泡植入位點數(shù)均增高(P<0.05),治療組間無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 各組小鼠妊娠第5天平均胚泡植入位點數(shù)Note.Compared with the blank group,?P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.(The same in the following Figures)Figure 1 Average number of blastocyst implantation sites on the 5th day of pregnancy in each group of mice

2.2 HB-EGF的表達

2.2.1 HBEGF蛋白定位

HBEGF蛋白主要表達于子宮腔上皮、腺上皮及間質(zhì)細胞?？瞻捉M在子宮腔上皮、腺上皮及間質(zhì)細胞呈陽性表達;模型組在子宮腔上皮和腺上皮呈弱陽性,間質(zhì)細胞呈陰性表達;藥物組在子宮腔上皮、腺上皮及間質(zhì)細胞均有表達,其中低分子肝素低劑量組表達呈弱陽性表達,低分子肝素中劑量組與阿司匹林組相呈陽性,低分子肝素高劑量組呈陽性或強陽性表達(圖2)。

2.2.2 HBEGF蛋白表達

與空白組比較,除低分子肝素高劑量組外,模型組及其他藥物治療組HBEGF蛋白表達均顯著降低(P<0.01);與模型組比較,低分子肝素各劑量組均顯著增高(P<0.01),其中低分子肝素高劑量組最高(圖3)。

圖2 小鼠子宮內(nèi)膜HBEGF蛋白定位Figure 2 Location of HBEGF protein in mouse endometrium

圖3 小鼠子宮內(nèi)膜HBEGF蛋白表達Figure 3 HBEGF protein expression in mouse endometrium

2.2.3 HBEGF mRNA表達

與空白組比較,模型組子宮內(nèi)膜HBEGF mRNA表達量降低(P<0.05)。與模型組比較,低分子肝素高劑量組子宮內(nèi)膜HBEGF mRNA表達量增高(P<0.05)(圖4)。

2.3 EGFR表達

2.3.1 pEGFR蛋白定位

pEGFR蛋白主要表達于子宮腔上皮、腺上皮及間質(zhì)細胞。空白組在子宮腔上皮、腺上皮及間質(zhì)細胞呈陽性表達;模型組在子宮腔上皮、腺上皮呈陽性,間質(zhì)細胞呈弱陽性表達;藥物治療組在子宮腔上皮、腺上皮及間質(zhì)細胞均表達,其中低分子肝素低劑量組呈弱陽性,低分子肝素中劑量組與阿司匹林組呈陽性,低分子肝素高劑量組呈強陽性(圖5)。

2.3.2 pEGFR蛋白表達

與空白組比較,低分子肝素高劑量組pEGFR蛋白表達增高(P<0.05),其余各組均降低(P<0.05);與模型組比較,藥物治療組pEGFR蛋白表達均增高(P<0.05)(圖6)。

2.3.3 EGFR mRNA表達

圖4 HBEGF mRNA表達量Figure 4 HBEGF mRNA expression

與空白組比較,模型組子宮內(nèi)膜EGFR mRNA表達量顯著降低(P<0.05),其余各組無顯著差異;與模型組比較,低分子肝素高劑量組子宮內(nèi)膜EGFR mRNA表達量增高(P<0.05)(圖7)。

2.4 PI3K表達

2.4.1 pPI3K蛋白定位

pPI3K蛋白主要表達于子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮以及血管上皮細胞?？瞻捉M在子宮腔上皮、血管上皮呈陽性表達,腺上皮呈弱陽性;模型組在子宮腔上皮、腺上皮及血管上皮細胞呈弱陽性或陰性表達;藥物治療組在子宮腔上皮、腺上皮以及血管上皮細胞與均呈陽性表達(圖8)。

圖6 小鼠子宮內(nèi)膜pEGFR蛋白表達Figure 6 pEGFR protein expression in mouse endometrium

圖7 小鼠子宮內(nèi)膜EGFR mRNA表達量Figure 7 EGFR mRNA expression

2.4.2 pPI3K蛋白表達

與空白組比較,除低分子肝素高劑量外,其余各組pPI3K蛋白表達均降低(P<0.05);與模型組比較,藥物治療組pPI3K蛋白表達均增高(P<0.05)(圖9)。

2.4.3 PI3K mRNA表達

與空白組比較,模型組及低分子肝素中、低劑量組子宮內(nèi)膜PI3K mRNA表達量降低(P<0.05),低分子肝素高劑量組表達量增高(P<0.05);與模型組比較,低分子肝素高劑量組子宮內(nèi)膜PI3K mRNA表達量增高(P<0.05)(圖10)。

2.5 Akt表達

2.5.1 pAkt蛋白定位

pAkt蛋白主要表達于子宮腔上皮、血管上皮細胞?？瞻捉M在子宮腔上皮及血管上皮呈陽性表達;模型組在子宮腔上皮及血管上皮細胞呈弱陽性或陰性表達;藥物治療組在子宮腔上皮及血管上皮細胞均呈陽性表達(圖11)。

2.5.2 pAkt蛋白表達

與空白組比較,模型組及阿司匹林組子宮內(nèi)膜pAkt蛋白表達均顯著降低(P<0.05),低分子肝素高劑量組顯著增加(P<0.05);與模型組比較,藥物治療組pAkt蛋白表達均顯著增高(P<0.05),其中低分子肝素高劑量組pAkt蛋白表達最高(圖12)。

圖8 小鼠子宮內(nèi)膜pPI3K蛋白定位Figure 8 Location of pPI3K protein in mouse endometrium

圖9 小鼠子宮內(nèi)膜pPI3K蛋白表達Figure 9 pPI3K protein expression in mouse endometrium

2.5.3 Akt mRNA表達

與空白組比較,模型組子宮內(nèi)膜Akt mRNA表達量降低(P<0.05),低分子肝素高劑量組表達量增高(P<0.05);與模型組比較,低分子肝素高劑量組子宮內(nèi)膜Akt mRNA表達量增高(P<0.05)(圖13)。

圖10 PI3K mRNA表達量Figure 10 PI3K mRNA expression

3 討論

3.1 動物模型的建立

為探討低分子肝素對胚泡植入的影響,本研究使用吲哚美辛建立小鼠胚泡植入障礙模型。吲哚美辛是環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)抑制劑,可通過抑制COX的表達,使前列腺素(prostaglandin,PGs)合成減少,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth facto,VEGF)的表達降低,使子宮內(nèi)膜血管生成減少,從而抑制子宮內(nèi)膜容受性[4]。有研究表明,小鼠妊娠第4天發(fā)育正常的胚泡可移行至子宮腔,第4.5天植入子宮內(nèi)膜[5],因此于妊娠第3、4天9:00和16:00皮下注射吲哚美辛溶劑,可使小鼠子宮內(nèi)膜的腺體、血管等均受到影響,且植入障礙程度與吲哚美辛呈劑量依賴性,當劑量為3 mg/kg時,胚泡植入率可降低77%,為建模最佳劑量[6-7]。

3.2 低分子肝素與子宮內(nèi)膜容受性

圖11 小鼠子宮內(nèi)膜pAkt蛋白定位Figure 11 Location of pAkt protein in mouse endometrium

圖12 小鼠子宮內(nèi)膜pAkt蛋白表達Figure 12 pAkt protein expression in mouse endometrium

低分子肝素相比于普通肝素具有更高的安全性,除抗凝作用外,還有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。近年來,在臨床上常用于治療復發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)和血栓性疾病相關的妊娠并發(fā)癥[8],對RSA患者應用低分子肝素后可提高胚泡植入成功率[9]。有研究發(fā)現(xiàn),低分子肝素可通過增加流向植入部位的血流量和減少血栓性病變來改善子宮內(nèi)膜及胎盤的生物學功能[10-11]。

圖13 Akt mRNA表達量Figure 13 Akt mRNA expression

HBEGF作為子宮內(nèi)膜容受性的標志物,可促進胚泡植入部位的血管生成,維持胚泡的正常生長發(fā)育。HBEGF在整個月經(jīng)周期中表達,在“窗口期”子宮腔上皮、腺上皮、間質(zhì)細胞表面HBEGF蛋白及mRNA表達達最高[12-13]。HBEGF是EGF家族的一員,HBEGF在豬、大鼠、小鼠和人的子宮中均表達[14]。當HBEGF表達降低,胚泡植入部位血管生成減少,易出現(xiàn)胚泡發(fā)育緩慢甚至流產(chǎn)[15]。

3.3 低分子肝素激活EGFR/PI3K/Akt信號通路

HBEGF可表達為可溶性(solubility,sol)和跨膜(transmembrane,tm)兩種生物活性[16],分別激活表皮生長因子受體(human epidermalgrowth factor receptor,HER)的兩種受體EGFR(HER1)和erb4(HER4)[17],并將硫酸乙酰肝素結(jié)合到細胞表面[18]。EGFR可在蛻膜和滋養(yǎng)細胞中表達,與HBEGF相互作用可影響胚泡植入和滋養(yǎng)層浸潤[19-20],提高胚泡的存活率[21]。

EGFR具有多種配體,如EGF,TGF-α,HBEGF和雙調(diào)蛋白等[22]。EGFR通過二聚化后刺激Ras蛋白,導致磷酸化級聯(lián)反應的發(fā)生激活PI3K[23],PI3K被活化后,使底物二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)水解形成三磷酸肌醇(inositol-1,4,5-trisphosphate,IP3)和二酰甘油(diacylglycerol,DAG)。IP3是第二信使的一種,可參與信號傳導,激活Akt使其磷酸化(pAkt)[24],pAkt可影響細胞增殖分化、血管生成[25]。所以,EGFR/PI3K/Akt信號通路在刺激細胞外生長因子及細胞增殖分化、血管生成等發(fā)揮重要作用。子宮內(nèi)膜血管生成對胚泡植入具有重要意義,良好的子宮內(nèi)膜血供可提高子宮內(nèi)膜容受性,增加胚泡植入率。

本研究結(jié)果顯示:(1)胚泡植入數(shù)量:與模型組相比較,低分子肝素組與阿司匹林組胚泡植入數(shù)量增加;(2)HBEGF的表達,低分子肝素組與阿司匹林組可增加HBEGF蛋白、mRNA表達,其中高劑量組增加尤為明顯;(3)EGFR、PI3K、Akt mRNA表達:模型組子宮內(nèi)膜EGFR、PI3K、Akt mRNA表達均低于空白組及藥物治療組,低分子肝素高劑量組EGFR、PI3K、Akt mRNA高于空白組水平,阿司匹林組與低分子肝素中、低劑量組表達相近;(4)EGFR、PI3K、Akt蛋白表達:模型組子宮內(nèi)膜EGFR、PI3K、Akt蛋白表達均低于空白組及藥物治療組,低分子肝素高劑量組EGFR、PI3K、Akt蛋白表達均高于各組,低分子肝素中、低劑量組EGFR、PI3K、Akt蛋白表達高于阿司匹林組。低分子肝素高劑量平均胚泡植入數(shù)目高于空白組,雖無統(tǒng)計學差異,但該組HBEGF、EGFR、PI3K、Akt蛋白及mRNA表達均高于空白組,說明從基因到臨床表現(xiàn)需要一定時間,同時藥物起作用需要一定的起效劑量。

綜上,低分子肝素可通過增加HBEGF的表達,激活EGFR/PI3K/Akt信號通路,對小鼠子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生調(diào)控作用,從而提高胚泡植入成功率。許多因素可影響子宮內(nèi)膜容受性,低分子肝素是否與其他細胞因子的表達以及信號通路有關,還需進一步實驗研究。