克羅恩病大小鼠動物模型研究進展

方磊,喬立超,顧一帆,徐雪梅,楊柏霖,陳紅錦

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,南京 210029)

克羅恩病(Crohn’s disease,CD)是一種非特異性腸道炎性疾病,屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的一種,其病變可累及全消化道,最常見的是回腸或結(jié)腸的透壁間斷性炎癥,隨著疾病的發(fā)展,半數(shù)患者會出現(xiàn)并發(fā)癥(狹窄、腸瘺或膿腫),通常需要手術(shù)治療[1]。CD的確切發(fā)病機制尚不明確,一般認為是因環(huán)境、遺傳、免疫以及微生物間復(fù)雜的相互作用而致病的[2]。西方發(fā)達國家CD的發(fā)病率已趨于穩(wěn)定,而我國的發(fā)病率正逐年上升,且呈低齡化發(fā)展[3]。目前用于治療CD的藥物也只是緩解患者癥狀,維持治療,而不是改變或逆轉(zhuǎn)潛在的致病機制。在剖析特定藥物的可能作用機制,研究開發(fā)其他替代治療方案中,動物模型發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近些年用于研究CD的動物模型主要包括化學(xué)誘導(dǎo)模型、自發(fā)模型、基因工程模型和細胞移植模型等。這些模型為研究疾病的發(fā)病機制以及發(fā)掘潛在的治療靶點提供了可能。本文旨在對CD動物模型進行綜述,并闡述其機制、模型應(yīng)用的優(yōu)缺點。

1 化學(xué)誘導(dǎo)動物模型

1.1 2,4,6-三硝基苯磺酸動物模型

2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)是一種半抗原,可與高分子組織蛋白結(jié)合成為抗原,誘發(fā)以T細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng),從而造成結(jié)腸炎癥。目前TNBS誘導(dǎo)多選用SD、Wistar大鼠和BALB/c、SJL/J、WT、C57BL/6J小鼠,大鼠模型在形態(tài)上與人類腸道結(jié)構(gòu)相似方面表現(xiàn)出優(yōu)勢,并且易于操作,而小鼠模型具有更廣泛的遺傳特征。用藥采用灌腸的方式,用乙醇作為載體增加黏膜的通透性[4],使TNBS可進入局部腸組織,與高分子組織蛋白結(jié)合。不同品系的大小鼠對TNBS的易感濃度不同,可能與不同品系的大小鼠攜帶的腸道菌株不同有關(guān),臨床上在使用TNBS誘導(dǎo)CD動物模型時需根據(jù)個體優(yōu)化TNBS濃度[5]。動物組織可見腸壁增厚,潰瘍形成,肌層破壞,肉芽腫形成,類似CD[6]。TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎可用于研究急性結(jié)腸炎、中程結(jié)腸炎以及慢性結(jié)腸炎,其中慢性結(jié)腸炎與纖維狹窄型CD具有相似的病理改變[5]。該模型具有造模簡單、模型持續(xù)時間長、費用低以及與人CD有相似的病理改變等優(yōu)點。但TNBS動物模型缺乏自發(fā)性復(fù)發(fā)和進行性的體重減輕、血性腹瀉等癥狀,且動物死亡率高。

1.2 2,4-二硝基苯磺酸動物模型

2,4-二硝基苯磺酸(dinitrobenzene sulfonic acid,DNBS)與TNBS一樣,也是半抗原,同樣也需要乙醇作為載體來破壞黏膜屏障,并選用SD大鼠和WT、Wistar、NMRI小鼠作為誘導(dǎo)動物。DNBS較TNBS少一個活性硝基,所以需要更高的濃度才易與組織高分子蛋白質(zhì)結(jié)合成抗原,但在結(jié)合蛋白質(zhì)時DNBS具有選擇性,它只與賴氨酸的ε-氨基團結(jié)合[7]。研究[8]表明DNBS動物模型的腸道損傷與活性氧(reactive oxygen species,ROS)有關(guān),DNBS在動物體內(nèi)代謝的產(chǎn)物會導(dǎo)致氧化應(yīng)激,增加ROS的產(chǎn)生,過多的ROS會增加谷胱甘肽的消耗,更多的不飽和脂質(zhì)降解而損傷腸道。DNBS動物組織肉眼可見結(jié)腸、盲腸和直腸存在嚴重炎癥和出血性潰瘍,病理改變?yōu)閺V泛的形態(tài)學(xué)紊亂、水腫、彌漫性白細胞浸潤以及結(jié)腸黏膜下層的淋巴細胞浸潤[9]。該模型的結(jié)腸炎特征與TNBS模型相似,有明顯的血性腹瀉和體重減輕,但相對危害較小[10]。同樣具有重復(fù)性高,價格低廉等優(yōu)點,但目前國內(nèi)對DNBS動物模型的報道較少,仍需進一步驗證該模型的適用面。

1.3 吲哚美辛動物模型

吲哚美辛是一種非甾體類抗炎藥,本法用到的吲哚美辛需用無水乙醇徹底溶解后再用5%的碳酸氫鈉溶液稀釋。動物模型一般選用SD、Wistar大鼠,多采用皮下注射的方式進行給藥,皮下給藥24 h急性炎癥達到最高峰,后期每天再給藥誘導(dǎo)慢性炎癥,這種慢性炎癥至少會持續(xù)兩周,臨床會出現(xiàn)急性腸炎,以腸壁增厚、腸系膜出血、腸系膜粘連以及小腸和結(jié)腸的多發(fā)性黏膜潰瘍?yōu)橹饕攸c[11]。雖然小腸潰瘍和透壁炎癥與CD有相似之處,但動物模型的慢性潰瘍主要存在于小腸而不是回腸[11]。通常認為吲哚美辛抑制了前列腺素、前列腺環(huán)素、環(huán)氧合酶,打破了腸黏膜的動態(tài)平衡,并在腸道菌群的參與下誘發(fā)了腸炎[12]。該模型的腸道急性或慢性炎癥的制備比較容易,潰瘍與CD有許多相似之處,缺點是其潰瘍發(fā)生部位不是特征性的回腸。

1.4 肽聚糖-多糖動物模型

肽聚糖-多糖(peptidoglycan-polysaccharide,PGPS)是細菌細胞壁成分,在體內(nèi)和體外均有良好的促炎作用[13-14]。PG-PS的肽聚糖部分含有NOD2配體的胞壁酰二肽部分,后者是CD的主要致病易感基因的產(chǎn)物[13]。目前PG-PS動物模型多選用易感的Lewis大鼠造模[13,15-17],并需剖腹將藥物注射進腸道壁內(nèi),主要注射部位有回腸最遠端兩個派爾斑、遠端回腸系膜、盲腸尖端和盲腸壁[13,18]。PG-PS動物模型的急性炎癥期在1～2 d到達高峰,7～10 d為靜止期,隨后12～17 d進入慢性肉芽腫性炎癥階段,并伴有顯著的腸纖維化改變[15,17,19]。與其他動物模型相比,PG-PS誘導(dǎo)的慢性小腸結(jié)腸炎模型具有的特點[16-17]:(1)炎癥是慢性的和肉芽腫性的;(2)炎癥發(fā)生了自發(fā)的再激活;(3)腸外損害(關(guān)節(jié)炎、肝臟肉芽腫、貧血)伴隨著腸道炎癥;(4)慢性炎癥存在遺傳易感性;(5)在遠端的小腸和結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)類似的細菌細胞壁聚合物。該模型的優(yōu)點是,病變累及末端回腸和右半結(jié)腸,組織學(xué)特征包括肉芽腫性炎癥和顯著的纖維化,以及有CD患者常見的腸外表現(xiàn),如關(guān)節(jié)炎等。此外,在這個模型中的炎癥是T細胞介導(dǎo)的[17],且具有相似的炎癥細胞因子譜[14]。當然缺點也很明顯,該誘導(dǎo)方式需要手術(shù)操作,且腸內(nèi)注射部位需定位準確,對研究人員要求相對較高。

2 自發(fā)性動物模型

自發(fā)性動物模型是指未經(jīng)特殊的人工干預(yù)的實驗動物,在自然條件下發(fā)生或由于基因突變出現(xiàn)的異常表現(xiàn),并通過遺傳育種保留下來的動物模型[20]。目前,常用的CD樣自發(fā)性動物模型有SAMP1/Yit小鼠和SAMP1/YitFc小鼠。

SAMP1品系是由一窩AKR/J小鼠經(jīng)24代同胞后代交配所建立的一系列易衰老品系之一,SAMP1小鼠壽命短(約9個月),并表現(xiàn)出早期衰老的跡象,如自發(fā)性淀粉樣變性、脫發(fā)和骨質(zhì)疏松[21]。在該品系的F1代中選擇有皮損的小鼠,進行兄妹間交配20余次,建立了SAMP1/Yit品系,與最初的SAMP1不同,SAMP1/Yit小鼠沒有出現(xiàn)淀粉樣變性,壽命也沒有縮短,并且在這個新的亞系中還觀察到了回腸炎性疾病[21]。SAMP1/Yit小鼠在20周齡時首先出現(xiàn)輕度至中度回腸炎,并在30周齡時在回腸末端形成100%外顯的不連續(xù)的透壁炎性病變,組織學(xué)發(fā)現(xiàn)回腸病變以炎癥和上皮細胞增生導(dǎo)致腸壁增厚,固有層和黏膜下層炎癥細胞浸潤為主,病變的嚴重程度和發(fā)生率隨年齡增加,沒有明顯的腸外炎癥[22]。

SAMP1/YitFc小鼠是將原先的SAMP1/Yit種群進行超過20代的兄妹間交配繁殖,繁育出帶有新的表型的小鼠。與原先的SAMP1/Yit小鼠相比,SAMP1/YitFc小鼠早在10周齡時即可出現(xiàn)回腸炎,并可早在4周齡時即可測得高水平IFN-γ,在慢性回腸炎病變部位可發(fā)現(xiàn)肌肥大和局部膠原沉積,腸系膜淋巴結(jié)中的淋巴細胞活性表型與疾病進展有關(guān),皮損發(fā)生率與腸道炎癥發(fā)生呈負相關(guān),大約5%的小鼠可產(chǎn)生肛周病變?nèi)鐫兓虔浌躘23]。另外SAMP1/YitFc小鼠還被報道發(fā)展為克羅恩樣胃炎(在沒有幽門螺桿菌感染的情況下)[24],自身免疫性肝炎[25],牙周炎[26]等。SAMP1/Yit小鼠及SAMP1/YitFc小鼠疾病表現(xiàn)與人類CD極其相似,但是成因暫不完全清楚,小鼠繁殖能力較差,與其他模型相比,需要大量的繁殖群體來生產(chǎn)實驗小鼠,維持品系穩(wěn)定的成本較高。

3 基因工程動物模型

基因工程動物模型即運用基因敲除或轉(zhuǎn)基因手段獲得目的基因缺陷的動物模型,用來研究目的基因在IBD免疫發(fā)病機制中的作用。近些年基因工程動物模型被廣泛用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域,取得了豐碩的研究成果。在人類疾病研究中,基因工程技術(shù)為深入研究人類疾病的本質(zhì)帶來了可能,并已顯示出積極的應(yīng)用前景,現(xiàn)就常見的基于基因工程技術(shù)建立的CD動物模型進行介紹。

3.1 基因敲除動物模型

基因敲除動物模型是指運用分子生物學(xué)技術(shù)將目的基因去除,或用其他相近的基因?qū)⑵涮鎿Q而得到的動物模型。目前除了單個目的基因敲除動物模型,應(yīng)用更多的是將各種目的基因敲除后的動物模型進行雜交,選取目的基因雙重甚至多重敲除后代進一步研究多基因缺陷與CD的關(guān)系,從而試圖闡明CD與特定基因背景的聯(lián)系。此類動物模型逐年增多,但都是在單個目的基因敲除的基礎(chǔ)上進行雜交,保留需要的目的基因缺陷動物,這里就不再一一贅述?？偠灾?目前研究人員通過基于體外逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因治療或通過使用可分泌相關(guān)細胞因子的轉(zhuǎn)基因細菌進行實驗性治療,為開發(fā)新藥提供了新思路,基因敲除動物模型的應(yīng)用正逐漸成為研究人員的首選,下面簡要列舉幾種目前常見的基因敲除動物模型(表1)。

3.2 轉(zhuǎn)基因動物模型

轉(zhuǎn)基因動物模型是指運用分子生物學(xué)實驗技術(shù)將外源性基因整合到動物體內(nèi),并可穩(wěn)定表達,也可穩(wěn)定遺傳給后代的一類動物模型。與基因敲除動物模型不同的是轉(zhuǎn)基因動物模型目的基因為外源性基因,它突破了種系隔離,可以進行更廣泛的目的基因研究,例如當想研究人類具有而動物不具有的基因時,即可以選擇該基因的轉(zhuǎn)基因動物模型進行研究。

表1 克羅恩病基因敲除大小鼠動物模型概況Table 1 The summary of genetic knockout rat and mouse models of Crohn’s disease

3.2.1 STAT 4轉(zhuǎn)基因動物模型

STAT 4基因是一種編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與IL-12受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),IL-12對TH1細胞因子如IFN-γ的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[44]。STAT4轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)類似人CD的體重減輕、腹瀉和嚴重結(jié)腸炎[45]。這種模型的致病機制可能是異常的IL-12參與激活Th1途徑,破壞腸黏膜免疫平衡,引起免疫紊亂而出現(xiàn)類似CD的結(jié)腸炎[44]。

3.2.2 HLA-B27轉(zhuǎn)基因動物模型

人類白細胞抗原-27(human leukocyte antigen-27,HLA-B27)與人類強直性脊柱炎關(guān)系密切[46]。HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠會自發(fā)形成IBD,影響胃、回腸,特別是整個結(jié)腸,組織學(xué)表現(xiàn)為隱窩增生、黏膜單核細胞浸潤和淺表潰瘍等[47]。該模型已廣泛用于研究常駐腸道細菌對胃腸道炎癥的急性和慢性階段的作用[48]。

4 CD45RBHigh細胞移植動物模型

CD45RBHigh細胞移植動物模型是通過將幼稚CD45RBHighT細胞經(jīng)尾部注入重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠體內(nèi),4周后Th1型免疫反應(yīng)模型建立,IFN-γ、TNF-α水平明顯增高[49]。這些小鼠在細胞轉(zhuǎn)移后的5～8周內(nèi)出現(xiàn)嚴重的小腸炎和胰腺炎,病變以近端結(jié)腸為主,組織學(xué)表現(xiàn)主要有腸壁增厚、炎性細胞浸潤和隱窩缺失,類似人CD的表現(xiàn),結(jié)腸炎的嚴重程度可因供體和受體小鼠的品系而不同[50-51]。

5 異種小腸移植動物模型

異種小腸移植動物模型用胎齡12～18周人胎小腸移植于6～8周齡的SCID小鼠背部皮下或空腸系膜側(cè),生長12～16周后收獲異種小腸[52]。人胎兒小腸和大腸移植的成功率約為62%,移植后的人胎兒小腸和大腸均能維持6個月之久,并出現(xiàn)新生血管的形成,所有腸道均具有適齡成熟和正常的大體組織學(xué)特征[53-55]。異種腸道移植物中存在人類固有免疫細胞和獲得性免疫細胞,腸道中人IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-β、A20等表達明顯升高,大約17%的人體異種腸道移植動物模型會自發(fā)性地發(fā)生腸皮膚瘺,并與人CD瘺管的組織病理學(xué)特點極其相似[56]。該模型成功建立了CD瘺管動物模型,缺點是技術(shù)要求高,成功率低。

6 結(jié)語

上述動物模型的建立是目前研究人員在對CD病因認識的基礎(chǔ)上運用生物學(xué)技術(shù)誘導(dǎo)的,其中化學(xué)誘導(dǎo)法主要是在腸上皮的完整性被破壞或在黏膜的通透性增加的情況下使得抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而致病,而基因工程動物模型、CD45RBHigh動物模型以及異種小腸移植動物模型是基于遺傳免疫缺陷誘導(dǎo)了CD發(fā)生。然而離開共生菌群的參與,這些動物模型大部分都無法成功誘導(dǎo),有研究[57]表明在無菌環(huán)境下,這些大小鼠無法發(fā)生IBD,所以我們?nèi)孕鑼D進行更深層次的研究。隨著人們對CD的認識逐漸清晰,肯定會有更多的動物模型被建立,研究人員才可以更好地利用每種模型的特點選取合適的一種來發(fā)掘特定的病理生理問題。雖然目前沒有一個單一的動物模型能夠概括人類CD的所有致病和臨床特征,但每個動物模型對我們更好地理解CD的發(fā)病機制及發(fā)掘可用的治療靶點能夠提供幫助。如果適當?shù)剡x擇動物模型,則可以探索疾病確切的病理機制,也將使開發(fā)新藥和治療手段變得容易,動物模型的研發(fā)仍然需要我們再做進一步的探索。