大動(dòng)物多能干細(xì)胞建立研究進(jìn)展

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(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動(dòng)物研究中心,呼和浩特 010018)

多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells,PSCs)是一類能高度分化,具有體外無限自我更新和自我增殖,并且能夠分化成三胚層多種細(xì)胞類型的一類干細(xì)胞。PSCs可以起源于胚胎,生殖細(xì)胞或體細(xì)胞,并且處于不同的多能性狀態(tài):原始態(tài)(Na?ve)和始發(fā)態(tài)(Primed)。PSCs向外胚譜系(如原始內(nèi)胚層和滋養(yǎng)外胚層)的分化能力雖然在干細(xì)胞領(lǐng)域的科學(xué)家中仍存在爭議,但是其廣泛地分化能力使多能性細(xì)胞系成為了研究哺乳動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)的重要工具,并使它們?cè)谝浦布?xì)胞進(jìn)行治療的再生醫(yī)學(xué)中具有巨大的應(yīng)用前景。目前為止,雖然PSCs的研究主要集中在小鼠和人細(xì)胞模型上,然而,由于存在人類干細(xì)胞使用相關(guān)嚴(yán)格的規(guī)定及倫理上的限制,導(dǎo)致許多干細(xì)胞應(yīng)用在臨床試驗(yàn)之前必須進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),這一點(diǎn)要求相關(guān)動(dòng)物模型的積極開發(fā)。而嚙齒類動(dòng)物,尤其是小鼠雖然是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最經(jīng)典的模式動(dòng)物,但由于其個(gè)體大小、壽命和生理特性方面與人類及其他大動(dòng)物的差別過于顯著,使得其在很大一部分疾病中無法很好地模擬人類或者大動(dòng)物的狀況,促使著研究者們致力于開發(fā)更多樣化的動(dòng)物模型。其中馬、豬等大型哺乳動(dòng)物不僅在解剖學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上與人類有許多相似之處,還允許復(fù)雜的實(shí)驗(yàn),以測試來源于PSCs的移植物的適用性、安全性和有效性等。其次,在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)方面PSCs還可以應(yīng)用于開發(fā)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其目的就是將新的或修飾的基因整合到其基因組中來改變動(dòng)物及其后代的特征[1]。如修飾生長激素的表達(dá)從而提高豬肉品質(zhì);敲出某些蛋白或基因生產(chǎn)出具有乳腺炎抗性的牛等。另外,PSCs基本上是不斷增殖的,如果得到適當(dāng)?shù)谋４媾c維持,它們具有很高的遺傳穩(wěn)定性,這使它們對(duì)保護(hù)稀有品種和物種,對(duì)產(chǎn)生可存活的卵母細(xì)胞和精子,從而實(shí)現(xiàn)體外受精(in vitro fertilization,IVF)和后代的產(chǎn)生也具有價(jià)值。此外,在獸醫(yī)臨床和人類醫(yī)療臨床前實(shí)驗(yàn)等方面它們還可以為檢測藥物、潛在毒素和致畸物以及內(nèi)分泌干擾物對(duì)發(fā)育的影響,甚至細(xì)胞移植提供實(shí)驗(yàn)室材料[2]。也有學(xué)者對(duì)這些PSCs的另一種潛在用途,分化為骨骼肌,用于生產(chǎn)肉制品或移植組織等也抱有很大希望[1]。簡而言之,干細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)步,結(jié)合生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效方法以及我們對(duì)大型動(dòng)物模型價(jià)值的日益了解,有望為臨床研究治療及動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供更多的資源并大大加速人類醫(yī)學(xué)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 大動(dòng)物ESCs的建立

1981年,胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)是英國劍橋大學(xué)Evans等[3]首次通過體外培養(yǎng)從小鼠囊胚期胚胎的內(nèi)部細(xì)胞群分離出來的具有多能性的細(xì)胞類型,其特征是呈現(xiàn)圓頂克隆,單細(xì)胞存活率高,依賴JAK/STAT信號(hào),表達(dá)與糖酵解、脂質(zhì)、囊泡生物學(xué)和代謝相關(guān)的基因。它具有無限增長,并且能夠分化為所有三個(gè)胚層細(xì)胞的能力。當(dāng)被注射到植入前胚胎中時(shí),可以形成嵌合體,并參與生殖細(xì)胞的發(fā)育[4],在雌性中包含重新激活的X染色體,并在多能性方面顯示出高度的同質(zhì)性。盡管不同克隆的增殖效率不同,但是小鼠胚胎干細(xì)胞通常是在含有白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)和ERK/MAPK信號(hào)抑制劑的培養(yǎng)基中增殖的,例如CHIR99021和PD0325901(也稱為2i條件)。確定ESC系多能性的常用方法有干細(xì)胞相關(guān)基因和表面標(biāo)志物的表達(dá)、在體外形成胚狀體的能力以及其分化為代表三個(gè)胚層的特定細(xì)胞類型的能力、在動(dòng)物體內(nèi)多向分化的潛能,如移植到免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)是否可以形成畸胎瘤并含有三個(gè)胚層的組織和來源物種體內(nèi)嵌合后代的產(chǎn)生、最高級(jí)別的黃金標(biāo)準(zhǔn)還有四倍體嵌合實(shí)驗(yàn)。而至今為止,從植入前的胚胎中建立的小鼠ESCs是滿足所有這些多能性測量標(biāo)準(zhǔn)的唯一細(xì)胞類型。而與小鼠ESCs相比,豬、牛、馬等大動(dòng)物的ESC細(xì)胞系的建立和研究進(jìn)展滯后很多,以下分別做概述。

1.1 豬胚胎干細(xì)胞

嚙齒類動(dòng)物小鼠因易飼養(yǎng)、妊娠期短等優(yōu)勢已成為醫(yī)學(xué)研究最常見的哺乳動(dòng)物模型,但是它無法很好地模擬一些人類疾病。而豬由于其壽命、器官大小和生理特性與人類相似,對(duì)于研究某些人類遺傳疾病和異種器官移植方面比起其他大型動(dòng)物更具有優(yōu)勢[5]。目前豬胚胎干細(xì)胞可以從體外胚胎、孤雌激活和核移植等方法建立[6-7]。這些細(xì)胞通常以扁平的多邊形上皮樣細(xì)胞在體外增殖,它具有堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)活性,可以在體外培養(yǎng)物中維持較長時(shí)間并形成胚狀體,但僅分化為有限數(shù)量的細(xì)胞類型。同時(shí),他們還顯示了包括OCT4、NANOG、SOX2和SSEA-1等多能性標(biāo)記物的表達(dá)[8-10],可其中只有2011年Telugu等[10]通過上調(diào)KLF4和POU5F1的表達(dá),從豬胚泡內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)中獲得的白血病抑制因子依賴性類似na?ve型多能干細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了畸胎瘤。而且除了少數(shù)[9],能促成嵌合體但未觀察到種系傳播的細(xì)胞系外,他們中的大多數(shù)并不能促成嵌合體。與小鼠和人類相比,豬的植入前發(fā)育期延長,導(dǎo)致很難確定導(dǎo)出ESC的最佳胚胎階段,也無法確定衍生和維持這些細(xì)胞的理想培養(yǎng)條件。迄今為止,仍然沒有滿足所有體內(nèi)多能性標(biāo)準(zhǔn),包括嵌合體產(chǎn)生以及種系貢獻(xiàn)的豬胚泡來源胚胎干細(xì)胞系。

1.2 牛胚胎干細(xì)胞

奶牛因其生殖周期的相似性,成為研究女性卵巢功能、衰老對(duì)生育力的影響以及某些子宮疾病的重要?jiǎng)游锬Ｐ蚚11]。通過基因選擇或基因編輯來生產(chǎn)具有遺傳優(yōu)勢的?？梢杂行p少奶牛乳房炎等疾病,從而提高奶制品和肉制品的營養(yǎng)價(jià)值改善人類健康,因此牛胚胎干細(xì)胞系的建立對(duì)生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)應(yīng)用都具有巨大的價(jià)值。已有許多方法產(chǎn)生牛胚胎干細(xì)胞系,如體外胚胎生產(chǎn)[12-14]、孤雌生殖激活[15]以及體細(xì)胞核移植法(somatic cell nucleus transplantation,SCNT)[14]等,這些牛ESC樣細(xì)胞系,具有高的AP活性,并表達(dá)了OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81等多能性標(biāo)記物,并且有些可以形成畸胎瘤[13-14]。雖然人們?cè)诟纳婆囵B(yǎng)基等方面做了許多工作,但由于收集胚胎較難及沒有合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)等問題,尚未有報(bào)道關(guān)于可產(chǎn)生種系嵌合體的牛胚胎干細(xì)胞系。

1.3 馬胚胎干細(xì)胞

馬作為重要的運(yùn)動(dòng)動(dòng)物,被認(rèn)為是測試肌肉骨骼損傷,如軟骨損傷或退化細(xì)胞療法的理想動(dòng)物模型,因?yàn)槠涑兄丶‰旖Y(jié)構(gòu)和基質(zhì)組成以及關(guān)節(jié)和肌腱損傷的性質(zhì)與人類非常相似,因此對(duì)于同種異體肌腱細(xì)胞移植方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[15]。很多研究集中在馬ESC分化為肌腱細(xì)胞和分化衍生物的免疫原性中,關(guān)于建立馬胚胎干細(xì)胞的報(bào)道寥寥無幾。在馬匹中,最初Saito等[16]描述了從臍帶來源的牛成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的冷凍和解凍的胚泡中分離出的具有正常核型的馬ESC樣細(xì)胞,這些細(xì)胞系維持超過50代并表達(dá)了多能性標(biāo)記SSEA-1、STAT3、OCT4和堿性磷酸酶以及體外分化為神經(jīng)祖細(xì)胞和造血或內(nèi)皮細(xì)胞譜系的能力。之后分別有兩個(gè)小組[17-18]報(bào)道了從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)建立的馬ESC樣細(xì)胞,并在補(bǔ)充LIF的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)20代以上。后者發(fā)現(xiàn)馬ESC樣細(xì)胞具有干細(xì)胞特異性基因的獨(dú)特表達(dá)特征,與人和小鼠的ESC不同,從馬胚胎中分離的ES樣細(xì)胞表達(dá)了OCT4、AP、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。小鼠ESC僅表達(dá)SSEA-1,人類ESC則表達(dá)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81,不表達(dá)SSEA-1。這些所獲得的細(xì)胞它們的形態(tài)類似典型上皮樣,并能夠分化為所有三個(gè)胚層,但是當(dāng)被注入裸鼠時(shí)既沒有形成畸胎瘤,也沒有檢測到嵌合體的產(chǎn)生。另外,2011年的一項(xiàng)研究使用了克隆的和孤雌性激活的胚泡進(jìn)行馬ESC系的分離[19]。然而,由于該物種卵母細(xì)胞和胚胎的缺乏以及其體外胚胎生產(chǎn)系統(tǒng)的缺乏,馬胚胎干細(xì)胞的分離受到阻礙,因此關(guān)于馬胚胎干細(xì)胞系的描述還很模糊,有關(guān)研究也很有限。

以上對(duì)三類家養(yǎng)物種ESC的現(xiàn)狀總結(jié)表明,建立穩(wěn)定的家畜胚胎干細(xì)胞仍然是個(gè)問題,因此使用重編程的體細(xì)胞提供了一個(gè)很好的選擇。2006年,誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)是由Takahashi等[20]通過采用導(dǎo)入外源基因的方法使體細(xì)胞發(fā)生重編程而獲得的,可以無限增殖更新并具有分化為各種組織細(xì)胞潛能的一類干細(xì)胞系。他們證明了四種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC(Yamanaka因子或OSKM)的誘導(dǎo)表達(dá)能夠?qū)⑿∈篌w細(xì)胞重新編程成與ESC細(xì)胞具有相似多潛能特征的細(xì)胞。它們可以由任何類型的細(xì)胞產(chǎn)生,因此可以選擇供體的表型,而不會(huì)造成使用ESC所產(chǎn)生的倫理困境。從那以后,人們做了很多努力來獲取和鑒定家畜的iPSC細(xì)胞。以助于填補(bǔ)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(尤其是小鼠)實(shí)驗(yàn)和人類臨床實(shí)驗(yàn)之間的巨大差距,并作為比嚙齒動(dòng)物更準(zhǔn)確的研究人類疾病的模型,為測試iPSCs安全性和潛力提供寶貴系統(tǒng)[21]。

2 大動(dòng)物iPSCs的建立

2.1 豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

相比于牛和馬,豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究開展的較早。早在2009年就有三個(gè)小組發(fā)文聲稱成功利用Yamanaka四因子從豬成纖維細(xì)胞產(chǎn)生豬iPS細(xì)胞系[22-24]。次年,美國密蘇里州密蘇里大學(xué)通過慢病毒載體使用重編程因子Oct4、Sox2、KIf4、c-Myc、Nanog和Lin28從豬骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生豬iPS系,并首次證明了豬iPS能夠形成對(duì)所有3個(gè)胚層,滋養(yǎng)外胚層和性腺都起作用的嵌合體,且能繁殖活后代[25]。他們將iPSCs顯微注射到胚泡期的豬胚胎中生產(chǎn)出了能適應(yīng)種系的嵌合家畜,但是在該研究中生產(chǎn)的29個(gè)嵌合動(dòng)物中的種系傳播率低(4.7%);在生產(chǎn)的兩只Oct4和Nanog轉(zhuǎn)基因陽性F1仔豬中,一只為死胎,而其同窩其他仔豬只存活了3 d。隨后,在2011年有研究報(bào)道[26]首次從豬iPS細(xì)胞系衍生功能性細(xì)胞,即成功誘導(dǎo)豬iPS細(xì)胞系,并將piPSC在補(bǔ)充抗壞血酸的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后,該細(xì)胞系自發(fā)產(chǎn)生了跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞,其通過免疫熒光分析表達(dá)GATA4、SMA和vimentin顯示出類似于心肌細(xì)胞的特征。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞雖然不涉及倫理道德等問題,但存在技術(shù)方面的困難,如病毒載體隨機(jī)整合到宿主基因組中,可能會(huì)破壞腫瘤抑制基因,激活癌基因或破壞必需基因的危險(xiǎn)性,因此盡管病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染非常有效且易于使用,人們?nèi)栽谂﹂_發(fā)其他方法來誘導(dǎo)豬iPS細(xì)胞系,如減少或替代轉(zhuǎn)錄因子[27-28]、非病毒轉(zhuǎn)染法[29-30]、microRNA誘導(dǎo)[31]等。此外也有研究團(tuán)隊(duì)致力于提高piPSC產(chǎn)生效率的研究中,如培養(yǎng)條件的改善[32-35]、宿主細(xì)胞的選擇[35]。這些研究中產(chǎn)生的豬iPS細(xì)胞表達(dá)多能性基因OCT3/4和SOX2并且可以在體外和體內(nèi)分化為三胚層的細(xì)胞[23-24,27-28,33-34],而其中的部分細(xì)胞對(duì)于SSEA-3、SSEA-4、TAR-1-60和TAR-1-81的表達(dá)呈陽性[24,27],部分卻呈陰性[23,30]。另外,它們還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)元[32]和軟骨細(xì)胞[30]。

2.2 牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和多啟動(dòng)子質(zhì)粒方法從牛成纖維細(xì)胞產(chǎn)生牛iPS細(xì)胞系,正式開啟了牛iPS細(xì)胞相關(guān)研究的道路[36-38]。分別使用了6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)(Oct4、Sox2、KIf4、c-Myc、Nanog和Lin28)、Yamanaka 4TF(Oct4、Sox2、KIf4、c-Myc)以及4TF﹢Nanog的組合。其中使用6TF和5TF的小組明確指出了4TF產(chǎn)生的克隆不能傳代至第6代或第8代以上,而另一個(gè)小組并沒有明確說明,也許這一差別出自前者使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,而后者則使用了多啟動(dòng)子質(zhì)粒方法。同時(shí),研究表明,血清替代物(knockout serum replacement,KSR)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)最有利于biPS的產(chǎn)生[36];牛iPS細(xì)胞對(duì)MEK,GSK3β及其各自信號(hào)通路的成分具有依賴性[37];以及將NANOG添加到逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)混合物中對(duì)于biPS的產(chǎn)生至關(guān)重要[38]。次年,首次報(bào)道了牛iPS細(xì)胞在使用豬卵泡液和RA誘導(dǎo)分化的特定培養(yǎng)條件下,P12代biPS細(xì)胞被誘導(dǎo)為雌性生殖細(xì)胞并表達(dá)早期和晚期雌性生殖細(xì)胞特異性基因Vasa、Dazl、Gdf9、Zp2和Zp3,并觀察到多個(gè)卵母細(xì)胞樣細(xì)胞和濾泡樣結(jié)構(gòu),免疫熒光染色顯示,生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記Vasa和Nobox在卵母細(xì)胞樣細(xì)胞中呈陽性[39]。另外,這項(xiàng)研究所產(chǎn)生的牛iPS細(xì)胞對(duì)于SSEA-1的表達(dá)呈陽性,對(duì)SSEA-3、SSEA-4、TAR-1-60和、TAR-1-81的表達(dá)呈陰性,剛好與Huang等[37]的研究結(jié)果相反。同年,廣西大學(xué)石德順研究員等[40]提出,SV40大T抗原可降低p53的表達(dá)并提高biPSC重編程的效率,或者在重編程的早期使用p53抑制劑PFT(p-fifty three)抑制p53的表達(dá)可以促進(jìn)biPSC的重編程的理論。隨后,在2015年Talluri等[41]和Kawaguchi等[41-42]通過piggyBac轉(zhuǎn)座子方法使用4TF分別從牛成纖維細(xì)胞和羊膜細(xì)胞成功產(chǎn)生了牛iPS細(xì)胞。Talluri等[41]是將兩種轉(zhuǎn)座子(sleeping beauty,SB和piggy bac,PB)進(jìn)行比較,并表示相比于SB系統(tǒng)PB更適合BEF的重編程。Kawaguchi等[42]則是從羊膜細(xì)胞建立了兩種類型的牛iPS細(xì)胞,并首次證明了牛iPS細(xì)胞可以促進(jìn)嵌合胎兒并分化為所有組織,包括胚外組織。在去年,Rawat等[43]為提高牛胚胎成纖維細(xì)胞(bovine embryonic fibroblast,BEF)重編程效率進(jìn)行了不同的時(shí)間更換培養(yǎng)基來確定重編程效率的研究,并表示在第5天更換培養(yǎng)基,克隆形成率最高。而Pillai等[44]是將人和鼠類中可提高重編程效率的方法用在牛iPS誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,如通過敲低MBD3,Trp53/TP53和過表達(dá)BRD3R和多能性相關(guān)microRNA 302/367簇,結(jié)果顯示這些方法在牛中都不能有效改善重編程效率。而使用?；?qū)ε＜?xì)胞進(jìn)行重編程可能會(huì)導(dǎo)致某種程度的效率提高;且胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)中的某些成分對(duì)于增強(qiáng)牛細(xì)胞的重編程效率可能至關(guān)重要。這些牛iPS細(xì)胞可以在體外和體內(nèi)分化為三胚層的細(xì)胞[36-40],并且表達(dá)多能性相關(guān)基因NANOG和SSEA-1,個(gè)別除外[37]。

2.3 馬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

馬iPS細(xì)胞系的研究始于2011年Nagy等[45]的一篇文章,即基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的方法用重編程因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc從妊娠55 d馬胎兒成纖維細(xì)胞中生成iPS細(xì)胞。其建立的馬iPS細(xì)胞系表達(dá)標(biāo)志性多能性標(biāo)記Nanog、SSEA1、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81,即使在長期培養(yǎng)期間也顯示出穩(wěn)定的核型,并且在體內(nèi)移植到免疫功能低下的小鼠中后容易形成包含所有三個(gè)胚芽層衍生組織的復(fù)雜畸胎瘤,雖然注射的小鼠暫時(shí)接受了強(qiáng)力霉素的喂養(yǎng)之后維持重編程轉(zhuǎn)基因的表達(dá),但仍表明獲得的細(xì)胞具有體內(nèi)分化能力。隨后,澳大利亞科學(xué)家通過逆轉(zhuǎn)錄病毒利用三因子(Oct4、Sox2和Klf4)將成年馬成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞,并首次證明了不含原癌基因c-Myc,一樣可以從馬胚胎成纖維細(xì)胞(equine embryonic fobroblast,EEF)產(chǎn)生iPS細(xì)胞系,此研究為軟骨和腱損傷模型中的自體移植打開了大門[46]。2013年,英國愛丁堡大學(xué)的科研人員首次報(bào)道,馬iPS細(xì)胞系在適當(dāng)?shù)臈l件下,可以分化為具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣特性的電活性細(xì)胞,產(chǎn)生的細(xì)胞具有膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特征,包括能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力,并且發(fā)現(xiàn)馬iPS細(xì)胞表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)記Dnmt3B[47]。另外,此文和同年發(fā)布的另一篇文章都表示,馬iPS細(xì)胞系的自我更新對(duì)LIF具有依賴性[47-48]。2018年,有研究團(tuán)隊(duì)首次對(duì)馬iPS細(xì)胞系進(jìn)行了MicroRNA分析,結(jié)果顯示與成纖維細(xì)胞相比,E-iPS中MicroRNA的表達(dá)水平與人類的較為相似[49]。因誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以從不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生,Pess?a等[50]通過慢病毒系統(tǒng)使用人4TF分別從成年馬成纖維細(xì)胞(eFibros)和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(eBMmsc),脂肪組織間充質(zhì)細(xì)胞(eADmsc)和臍帶組織間充質(zhì)細(xì)胞(eUCmsc)生成馬iPS細(xì)胞。結(jié)果表明,eBMmsc無法生成E-iPSC。產(chǎn)生的所有馬iPS細(xì)胞都表達(dá)多能性相關(guān)基因OCT3/4和NANOG,而且部分可以在體外和體內(nèi)分化為三胚層的細(xì)胞[46-48]。

3 結(jié)語

現(xiàn)如今,大型哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了巨大的應(yīng)用潛力,如遺傳疾病的研究、安全性的測試、異種移植物的來源、優(yōu)秀性狀動(dòng)物繁殖等。然而,胚胎干細(xì)胞因涉及到胚胎及其它的收集難度、衍生物的分化潛能,使得無法建立穩(wěn)定的家畜胚胎干細(xì)胞系。這一局面雖然已被誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的出現(xiàn)打破了,但是由于物種差異和大型哺乳動(dòng)物多能性的定義等難題,還尚未報(bào)道可通過四倍體嵌合實(shí)驗(yàn)這一黃金標(biāo)準(zhǔn)的大型哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞。目前,研究人員們?cè)趪X類和靈長類哺乳動(dòng)物na?ve或primed多能性狀態(tài)的基因網(wǎng)絡(luò)、兩個(gè)狀態(tài)維持和培養(yǎng)條件、甚至對(duì)體內(nèi)胚胎生長發(fā)育及分化機(jī)理的深入研究都將對(duì)建立和優(yōu)化及鑒定其他大型哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞提供新思路和方法[51]。作者認(rèn)為,參考其他哺乳動(dòng)物研究結(jié)果深入了解細(xì)胞不同多能性狀態(tài)內(nèi)外因素的基礎(chǔ)上,結(jié)合所關(guān)注大型哺乳動(dòng)物胚胎生長發(fā)育特點(diǎn),對(duì)可能關(guān)鍵因素的充分驗(yàn)證和試驗(yàn)是突破研究現(xiàn)狀的關(guān)鍵。幸運(yùn)的是,已有越來越多的研究人員致力于家畜多能干細(xì)胞系的建立工作中,相信會(huì)在不久的將來這些問題都會(huì)逐步得到解決。