惡性腫瘤中MNX1反義RNA 1的作用及機制研究進展*

關(guān)滄海， 趙俞喬， 郭 靚， 陳雨竹， 王微娜， 姜興明

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150086）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類廣泛存在于細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)、長度在200 nt 以上、缺少開放閱讀框、不參與或很少參與蛋白質(zhì)編碼、主要從蛋白編碼基因的反義鏈及間隔區(qū)轉(zhuǎn)錄出來的RNA［1-6］。已有大量研究證實，lncRNA涉及調(diào)控多種生物學(xué)功能，比如細胞增殖、凋亡及血管生成［7-9］。表達異常的lncRNA與諸多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10-11］。lncRNA可通過調(diào)節(jié)甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑改變細胞周期和增殖免疫等在諸多腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌的作用［12-15］。MNX1 反義RNA 1（MNX1 antisense RNA 1，MNX1-AS1）是一種新發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的lncRNA。

1 MNX1-AS1概述

MNX1-AS1 全長 5 568 nt，位于 7 號染色體長臂 3區(qū)6 帶（7q36），鄰近MNX1 蛋白編碼基因的5'端，又稱結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本5（colon cancer associated transcript 5，CCAT5）；NR_038835.1 是 MNX1-AS1 唯一的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，含有2 個外顯子。目前研究表明，MNX1-AS1可以借助競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制與miRNA 相互作用，參與靶基因的表達調(diào)控；誘導(dǎo)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，加快腫瘤的生長；促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及激活 AKT/mTOR等多種信號通路來調(diào)控肺腺癌、乳腺癌和肝細胞癌等諸多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2 MNX1-AS1與惡性腫瘤

2.1 肺腺癌 大量研究表明，MNX1-AS1 在肺腺癌組織中表達明顯上調(diào)，高表達MNX1-AS1 患者的瘤體更大，遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生概率更高，并且總生存時間（overall survival，OS）更短，從Cox比例風(fēng)險模型的分析數(shù)據(jù)來看，MNX1-AS1 的定量檢測可以作為肺腺癌患者預(yù)后的獨立判斷因素［16-17］。通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA 下調(diào)MNX1-AS1 表達后能夠顯著抑制A549 和SPC-A1 腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。進一步研究證實 MNX1-AS1和BRF2 的末端序列 CUUUGCA 與miR-527 的種子序列GAAACGU 存在互補；肺腺癌組織中MNX1-AS1與miR-527的表達呈明顯負相關(guān)，而與BRF2 的表達呈正向相關(guān)；預(yù)先反向上調(diào)miR-527或下調(diào)BFR2 的表達都可以逆轉(zhuǎn)MNX1-AS1 過表達所致的促癌作8 用［18］。上述研究結(jié)果提示：異常高表達的MNX1-AS1 對肺腺癌增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的促進是通過ceRNA機制調(diào)控miR-527/BRF2軸來實現(xiàn)的。

2.2 胃癌 對96 例胃癌患者的腫瘤組織和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，MNX1-AS1 在腫瘤組織中異常高表達，MNX1-AS1 的表達水平與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM 分期、長期生存情況以及預(yù)后密切相關(guān)。敲減 MNX1-AS1 后胃癌細胞 AGS和MGC-803 的增殖、侵襲和遷移能力受到抑制，其機制是沉默MNX1-AS1 能夠抑制反映細胞增殖能力的增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、EMT 相關(guān)蛋白神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）以及與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達［19］。此外，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）可以抑制CDK 活性，防止關(guān)鍵CDK 底物的磷酸化，阻滯細胞周期進展，Ma等［20］證實異常高表達的MNX1-AS1可以通過抑制CDKN1A 來促進胃癌的侵襲和遷移。由此可見，MNX1-AS1 對胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控可以通過PCNA、EMT 和細胞周期途徑，然而MNX1-AS1 是否可以借助ceRNA機制促進胃癌有待進一步研究。

2.3 結(jié)腸癌 結(jié)腸癌中MNX1-AS1 呈異常高表達，并且其表達水平不僅與淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，同時還可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。體外細胞學(xué)實驗的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MNX1-AS1 的結(jié)腸癌細胞 HT29 在 490 nm 波長測得的吸光度值更高，并且進入Transwell 下室的細胞不僅數(shù)目更多，侵入速度也明顯加快。通過生物信息學(xué)技術(shù)以及qRT-PCR 檢測出miR-218-5p 是在MNX1-AS1 被沉默后顯著表達的miRNA，miR-218-5p 下游靶基因SEC61 易位子 α1 亞基（SEC61 translocon alpha 1 subunit，SEC61A1）在結(jié)腸癌明顯高表達。進一步利用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-218-5p 與上述兩者存在靶向作用關(guān)系，并且沉默MNX1-AS1 對結(jié)腸癌的抑癌作用可以被下調(diào)miR-218-5p 或過表達SEC61A1 所逆轉(zhuǎn)。同時，研究人員還預(yù)測出轉(zhuǎn)錄因子E2F1與MNX1-AS1的啟動子區(qū)域結(jié)合，但缺少更進一步的分子細胞學(xué)實驗來證實［21］。另有研究證實，過表達的MNX1-AS1 能夠促進結(jié)腸癌細胞HT29 和SW620 中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的表達，從而調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展［22］。上述研究結(jié)果提示，異常高表達的MNX1-AS1 不僅可以借助miR-218-5p/SEC61A1 軸，還能激活STAT3 信號通路來促進結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲，而MNX1-AS1的上游調(diào)控機制有待后續(xù)的實驗研究。

2.4 肝細胞癌 對81 例肝細胞癌患者的腫瘤組織和臨床數(shù)據(jù)進行定量檢測及分析，觀察到MNX1-AS1在腫瘤組織中的表達明顯上調(diào)并且其表達水平與患者臨床高分期、出現(xiàn)遠端轉(zhuǎn)移及OS 呈顯著負相關(guān)。MTT、劃痕和Transwell 實驗的結(jié)果表明，敲減MNX1-AS1后 Huh7和SMMC-7721 肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力得到增強；裸鼠移植瘤實驗也證實，沉默MNX1-AS1能夠減緩體內(nèi)腫瘤細胞的生長，導(dǎo)致瘤體更小。為進一步研究MNX1-AS1促癌的作用機制，研究人員首先預(yù)測出MNX1-AS1 與COMMD8（COMM domain containing 8）的 3'UTR 序 列 AAGCACAA 和miR-218-5p 的種子序列UUGUGCUU 之間存在互補；抗Ago2的RNA免疫沉淀實驗表明，Ago2更容易與上述三者結(jié)合沉淀，并且在肝細胞癌組織中miR-218-5p與MNX1-AS1、和COMMD8的表達均呈負相關(guān)；轉(zhuǎn)染 sh-MNX1-AS1 對 Huh7和SMMC-7721 細胞增殖和侵襲遷移的抑制作用能被過表達COMMD8 逆轉(zhuǎn)［23］。由此可見，MNX1-AS1能夠作為“分子海綿”內(nèi)源性吸附miR-218-5p，阻斷其與COMMD8 3'UTR 之間的結(jié)合，從而抑制肝細胞癌的惡性生物學(xué)行為。

2.5 食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC） 在ESCC 患者的腫瘤組織中MNX1-AS1 的表達顯著高于癌旁正常組織，MNX1-AS1 高表達組患者的5 年生存率更低。體外細胞學(xué)實驗證實 ，轉(zhuǎn) 染 si-MNX1-AS1 后 ESCC 細 胞 系 KYSE30 和KYSE150的細胞周期被阻滯，并且細胞的增殖、侵襲和遷移也受到抑制。隨后的研究表明，MNX1-AS1和miR-34a 存在靶向結(jié)合位點并且兩者表達呈顯著負相關(guān)；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在ESCC 組織中高表達，并且轉(zhuǎn)染si-MNX1-AS1和miR-34a inhibitor 后 的 KYSE30 細 胞中SIRT1 的表達分別受到抑制和促進［24］。換言之，MNX1-AS1 可以通過 miR-34a/SIRT1 軸對 ESCC 進行調(diào)控。然而上述研究沒有證明miR-34a 和SIRT1 是否存在靶向作用關(guān)系，對于MNX1-AS1 是否借助ceRNA 機制或是其他途徑影響SIRT1 的表達有待后續(xù)研究。此外，胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）是ESCC 發(fā)生發(fā)展過程中的促癌基因。Zheng 等［25］的研究結(jié)果表明，上調(diào) MNX1-AS1 可以促進 ESCC 細胞系 TE-1 中 IGF2 的表達，進而加快ESCC的遷移和侵襲進程。

2.6 乳腺癌 通過qRT-PCR 和統(tǒng)計學(xué)分析36 例乳腺癌腫瘤組織樣本和病理學(xué)數(shù)據(jù)，觀察到MNX1-AS1在乳腺癌組織中異常高表達，其表達水平不僅與組織學(xué)分級、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關(guān)，而且還可以用來評估患者的預(yù)后。細胞學(xué)實驗證實轉(zhuǎn)染siRNA-MNX1-AS1 的 MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞的A值更小，劃痕條帶的間距更寬并且穿透基底膜的細胞數(shù)目更少。為探明MNX1-AS1 通過何種機制促進乳腺癌的增殖和侵襲遷移，Cheng等［26］對過表達 MNX1-AS1 后乳腺癌細胞 AKT/mTOR通路（促進細胞增殖）和EMT途徑的相關(guān)蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn) p-AKT、p-mTOR 及其下游的 CDK4、Bcl-2、cyclin D1和c-Myc明顯高表達，且加快腫瘤侵襲和遷移的間充質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin、Snail和Slug的表達上調(diào)。上述結(jié)果表明，乳腺癌中異常高表達的MNX1-AS1 通過對 AKT/mTOR 信號通路和 EMT 的調(diào)控來促進腫瘤的惡性生物學(xué)行為。

2.7 骨肉瘤 研究表明MNX1-AS1 在骨肉瘤中表達顯著上調(diào)；Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示MNX1-AS1的表達水平與患者的總生存期呈顯著負相關(guān)；單因素和多因素分析表明定量檢測MNX1-AS1 可以對骨肉瘤患者的預(yù)后情況進行判斷。細胞實驗的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siRNA-MNX1-AS1 后骨肉瘤細胞Saos-2 的增殖和侵襲能力受到抑制。研究MNX1-AS1 促癌機制的過程中檢測到吻素1（kisspeptin-1，KISS1）不僅在骨肉瘤組織中顯著低表達，而且與MNX1-AS1 的表達呈負相關(guān)，于是作者得到MNX1-AS1 通過負向調(diào)控KISS1 來增強骨肉瘤的增殖和侵襲的結(jié)論，然而該研究團隊缺少KISS1 相關(guān)表型實驗來進一步證明其在骨肉瘤起到的促癌作用［27］。另有研究證實，骨肉瘤中 N-cadherin和Snail 受 MNX1-AS1 表達的調(diào)控，通過誘導(dǎo)上述兩者高表達來增進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而加速骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展［28］。此外，在骨肉瘤細胞U20S 中檢測出MNX1 的表達顯著上調(diào)并受到MNX1-AS1的正向調(diào)控，然而這種調(diào)控作用是否能夠促進骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展以及何種機制有待深入研究。

2.8 多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM） 對44例GBM 患者的組織和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)進行qRT-PCR 定量檢測及分析：MNX1-AS1 在GBM中的表達顯著高于癌旁正常組織，其表達水平可以作為患者整體生存情況的獨立風(fēng)險因素。體外細胞學(xué)實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染過表達載體上調(diào)MNX1-AS1 后U251 和T98 腫瘤細胞的吸光度增加、遷移和侵襲加快，而上述惡性生物學(xué)行為在沉默MNX1-AS1 的情況下可以被抑制。對MNX1-AS1 促癌作用機制進行深入研究，首先通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測出MNX1-AS1 和miR-4443 存在靶向結(jié)合位點，共轉(zhuǎn)染MNX1-AS1-WT 與miR-4443 mimics 后螢光素酶活性顯著降低；miR-4443在GBM組織和T98細胞中明顯低表達，上調(diào)miR-4443 的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲遷移；沉默MNX1-AS1 對GBM 細胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用明顯強于共轉(zhuǎn)染shRNA-MNX1-AS1和 miR-4443 inhibitor 的腫瘤細胞［29］。因此，MNX1-AS1 對膠質(zhì)母細胞瘤的調(diào)控是通過競爭性結(jié)合miR-4443來實現(xiàn)的。

2.9 其他腫瘤 MNX1-AS1 在卵巢癌呈異常高表達，并且其表達水平與患者淋巴轉(zhuǎn)移、FIGO 分期高及5年生存率差顯著正相關(guān)，MNX1-AS1的定量檢測可以評估和預(yù)測患者的整體生存情況。CCK-8、Transwell 和流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體外源性上調(diào)MNX1-AS1 后更多的卵巢癌細胞（OVCA433 和SKOV-3）進入S 期并且其凋亡發(fā)生受抑制，進而增強卵巢癌的增殖和侵襲遷移能力；沉默MNX1-AS1 后可以得到與上述相反的結(jié)果［30-31］。然而目前卵巢癌中MNX1-AS1的促癌機制還不明確。

宮頸癌中異常高表達的MNX1-AS1 與腫瘤大小、血管侵襲、FIGO 分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。過表達MNX1-AS1 能夠促進E6E7 細胞的增殖，而敲減MNX1-AS1 后測得 HeLa 細胞的A值降低；凋亡實驗和Western blot 的結(jié)果表明，過表達的MNX1-AS1 通過促進Bcl-2、抑制Bax 的表達來抑制凋亡發(fā)生。MAPK 信號通路與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為證明MNX1-AS1 是否通過激活此通路起到促癌作用，研究人員首先在MNX1-AS1 過表達的E6E7 細胞中檢測到MAPK 通路相關(guān)蛋白p-ERK1/2 和p-JNK 呈高表達，隨后利用ERK1/2 和JNK1/2 的抑制劑SCH772984和SP600125證實阻斷MAPK 信號通路能夠逆轉(zhuǎn)過表達的MNX1-AS1 對宮頸癌的促進作用［32］。

MNX1-AS1 在前列腺癌組織中的表達相比于癌旁正常組織存在顯著差異（MNX1-AS1在前列腺癌中異常高表達），MNX1-AS1 高表達組患者的整體生存情況更差。細胞增殖實驗的結(jié)果表明，MNX1-AS1被敲減后DU145 與PC3 細胞的增殖和侵襲遷移顯著增強。針對MNX1-AS1 的促癌機制進一步研究證實，過表達的MNX1-AS1不僅可以誘導(dǎo)PCNA 表達上調(diào)進而提高前列腺癌細胞的增殖能力，還能上調(diào)EMT 相關(guān)蛋白Snail 和N-cadherin 的表達來加速腫瘤的侵襲和遷移［33］。

已有的研究顯示，膀胱癌細胞5637 中MNX1-AS1呈異常高表達；轉(zhuǎn)染sh-MNX1-AS1的腫瘤細胞A值更低，向劃痕中心的遷移速度減緩，且進入G2期的細胞比例降低；抑制MNX1-AS1 表達的移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長速度減慢。隨后的機制研究證實，miR-218-5p與MNX1-AS1及RAB1A之間存在相同的靶向結(jié)合位點，敲減RAB1A能夠抑制5637 細胞的增殖、侵襲和遷移；過表達miR-218-5p或沉默RAB1A都可部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)MNX1-AS1 所致的促癌作用。此外，異常高表達的MNX1-AS1 還可以促進EMT 相關(guān)蛋白的表達，進而提高膀胱癌的遷移和侵襲能力［34］。

3 總結(jié)與展望

得益于基因測序等技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)，同時lncRNA 在腫瘤中的異常表達及其調(diào)控機制也被不斷揭示。lncRNA MNX1-AS1在諸多腫瘤中異常高表達，其表達水平與腫瘤病理生理學(xué)特征及患者的整體生存情況密切相關(guān)。已有的研究結(jié)果顯示，MNX1-AS1 可以通過多種方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在結(jié)腸癌、肝癌和膀胱癌中作為miR-218-5p 的“分子海綿”調(diào)控下游促癌靶基因；在胃癌、乳腺癌和前列腺癌中促進EMT；調(diào)節(jié)胃癌、食管鱗癌和卵巢癌的細胞周期；激活結(jié)腸癌、乳腺癌和宮頸癌的 STAT3、AKT/mTOR 及 MAPK 信號通路，然而相關(guān)的上游分子機制目前還沒有報道。此外，MNX1-AS1 作為MNX1 的天然反義轉(zhuǎn)錄本是否可以通過調(diào)節(jié)MNX1 的轉(zhuǎn)錄、招募相關(guān)蛋白引起組蛋白甲基化以及其他可能的方式來促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還需要進一步探索。