益腎散結(jié)復(fù)方及其拆方對阿霉素腎病大鼠腎臟組織的影響研究*

王漱非，王悅彤，李現(xiàn)成，張 楠，趙亞峰，沈 霞，毛加榮，延 佩，王 宇，于小勇，程小紅，屈 凱△

1．陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)；2．陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

大鼠阿霉素腎病(Adriamycin-induced nephropathy，ADN)是通過阿霉素及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，破壞腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致濾過屏障的通透性而引起蛋白尿的一種腎臟病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白尿是慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD) 進(jìn)展至終末期腎臟病(End stage renal disease，ESRD)的主要因素，隨著蛋白尿的不斷增多，最終導(dǎo)致不可逆性的腎小球硬化的發(fā)生。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在防治尿蛋白方面取得了一定的效果，但因其副作用多、依賴性強(qiáng)、價格昂貴等因素，限制了其廣泛應(yīng)用。大量的臨床證據(jù)證實祖國醫(yī)學(xué)對防治CKD具有確切療效，發(fā)現(xiàn)中藥在諸多方面對腎臟病理損害有明顯的保護(hù)作用，能通過多種途徑減輕腎組織病理改變，從而延緩腎臟病的進(jìn)展。

益腎散結(jié)復(fù)方(又名“腎復(fù)康Ⅱ號膠囊”，專利號：ZL201110334097.6)，其由黃芪、山藥、山萸肉、菟絲子、仙靈脾、丹參、金櫻子、熟地等藥物組成，其功效為補脾益腎、活血散結(jié)，該藥物作為陜西省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑臨床應(yīng)用十余年，取得了確切療效[2-6]。本研究采用尾靜脈注射阿霉素建模方法建立阿霉素腎病模型，觀察益腎散結(jié)復(fù)方及其拆方組合對阿霉素腎病大鼠尿蛋白、血清學(xué)指標(biāo)、腎臟組織形態(tài)學(xué)改變等的影響?，F(xiàn)將其結(jié)果報告如下。

材料與方法

1 動 物 健康清潔級SD大鼠70只，雌雄各半，2～3月齡，體重(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2012-003，動物質(zhì)量合格證號：No.0012260。實驗動物按照組別采用分養(yǎng)法，在溫度20℃～25℃，濕度55%～65%實驗室內(nèi)，均給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水和自然晝夜節(jié)律光照。

2 藥物及其制備 按照中醫(yī)病機(jī)和組方原則為依據(jù)進(jìn)行拆方，將益腎散結(jié)復(fù)方按照溫腎益精化瘀組(菟絲子、淫羊藿、丹參、金櫻子、姜黃)、滋陰益腎化瘀組(山茱萸、熟地黃、丹參、金櫻子、姜黃)、益氣化瘀組(黃芪、山藥、丹參、金櫻子、姜黃)的組方原則進(jìn)行拆方實驗研究。按上述分類及用藥比例在陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制備，低溫冰箱保存。陽性對照組藥物：鹽酸貝那普利片，國藥準(zhǔn)字H20030514，北京諾華制藥有限公司。造模藥物：注射用鹽酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)：上海金穗生物科技有限公司提供(批號C4125316-40-9)。HE、PASM、Masson染色試劑，10%甲醛、4%戊二醛、二甲苯、不同梯度乙醇、1%鋨酸、PBS緩沖液、環(huán)氧樹脂：陜西省中醫(yī)醫(yī)院病理實驗室提供。

3 儀器與試劑 飼養(yǎng)籠、代謝鼠籠、梅特勒電子天平(AL104)、大鼠固定器、清潔工作臺、一次性注射器(1 ml、5 ml、10 ml)、灌胃針頭、萊卡腎組織平推式切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、烤片機(jī)、奧林帕斯顯微鏡、日立H-600電子顯微鏡等。

4 造 模 阿霉素腎病大鼠模型的建立。實驗大鼠于實驗第1天、14天給予尾靜脈注射DOX6mg/只。造模成功后(24 h蛋白尿量≥100 mg/d)灌服相應(yīng)藥物2 ml/只/d，持續(xù)8周。

5 分組及給藥 查隨機(jī)數(shù)字表，從70只大鼠抽取10只為正常對照組大鼠，其余大鼠造阿霉素腎病模型。依據(jù)上述指標(biāo)判斷模型建立后，按體質(zhì)量大小查隨機(jī)數(shù)字表將60只模型大鼠分為6組：溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組、全方組、陽性對照組及模型對照組。于造模成功后的第2天開始分別給予不同治療組對應(yīng)藥物，連續(xù)灌胃8周(參考實驗動物學(xué)給藥劑量確定給藥量，根據(jù)大鼠與人體表面積及基礎(chǔ)代謝率計算所得[6]，大鼠每千克體重給藥量為成人每千克體重給藥量的6倍，用藥量為10 g/kg，即灌胃量10 ml/kg)。陽性對照組給予鹽酸依那普利[鹽酸貝那普利片的規(guī)格為10 mg/片，成人用量為20 mg/60 kg，換算后大鼠每天給藥量為2.05 mg/kg，灌胃量10 ml/(kg·d)]，模型組給予灌服生理鹽水2 ml/只/d，連續(xù)灌胃共8周。

6 樣本采集和指標(biāo)檢測

6.1 24 h尿蛋白定量：尿蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)(Coomassie brilliant blue，CBB)法檢測。送陜西省中醫(yī)醫(yī)院臨床中心實驗室采用Olympus AU2700自動分析尿蛋白濃度，計算24 h尿液及24 h尿蛋白定量。

6.2 血生化指標(biāo)檢測：通過相關(guān)指標(biāo)試劑盒采用Beckman LX20生化分析儀自動分析血清中尿素氮(BUN)、血肌酐(CRE)、膽固醇(Cholesterol)、甘油三酯(Triglycerides)的濃度。

6.3 腎臟組織病理學(xué)變化的觀察：取部分腎臟組織，置4%戊二醛固定，PBS緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，乙醇脫水后，浸透劑浸透,環(huán)氧樹脂包埋浸蠟切片，甲苯胺藍(lán)染色，超薄切片機(jī)切片5 μm，鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)變化。

結(jié) 果

1 益腎散結(jié)復(fù)方及拆方組合對大鼠尿量及尿蛋白定量的影響 與正常對照組比較，模型對照組尿蛋白定量明顯上升(P<0.01),提示阿霉素造模對大鼠腎臟造成了影響，導(dǎo)致尿蛋白排泄增加；用藥后，與模型對照組比較，各治療組大鼠尿蛋白定量均有所下降(P<0.05)。同時，據(jù)數(shù)據(jù)分析，提示益腎散結(jié)全方改善尿蛋白療效優(yōu)于陽性對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠尿蛋白定量情況對比(mg/kg)

注：與模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

2 益腎散結(jié)復(fù)方及拆方組合對大鼠血生化指標(biāo)的影響

2.1 各組大鼠膽固醇情況分析：見表2。與模型組對照，治療組、陽性對照組均有效改善膽固醇水平(P<0.01)；同時，益腎散結(jié)全方組改善膽固醇水平優(yōu)于陽性對照組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠甘油三酯情況分析：見表3。與模型對照組，治療組、陽性對照組均能有效改善甘油三酯水平(P<0.01)；同時，溫腎益精化瘀組、益氣化瘀組、全方組改善甘油三酯水平優(yōu)于陽性對照組(P<0.05)。

表2 各組大鼠膽固醇情況分析(mmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

表3 各組大鼠甘油三酯情況分析(mmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

2.3 各組大鼠血尿素氮情況分析：見表4。與模型組對照，各治療組、陽性對照組均有效降低血尿素氮水平(P<0.01)；同時，全方組改善血尿素氮水平優(yōu)于陽性對照組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠血肌酐情況分析：見表5。與模型組對照，各治療組、陽性對照組均有效降低血肌酐水平(P<0.01)；同時，溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組及全方組改善血肌酐水平優(yōu)于陽性對照組(P<0.05)。

表4 各組大鼠血尿素氮情況分析(mmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

表5 各組大鼠血肌酐情況分析(μmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

3 電鏡下組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)觀察 見圖1。正常對照組，腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增生，基底膜無明顯增厚，足突節(jié)段性融合；模型組腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕-中度增生，足突廣泛融合；鹽酸貝那普利陽性對照組與溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組比較，系膜細(xì)胞核基質(zhì)增生情況有改善，足突融合程度無明顯變化；與益腎散結(jié)復(fù)方全方組比較，全方組腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增生情況較鹽酸貝那普利陽性對照組改善明顯，且足細(xì)胞僅顯示部分融合，提示全方組修復(fù)能力最強(qiáng)。

A.正常對照組，B.阿霉素模型組，C.鹽酸貝那普利陽性對照組，D.溫腎益精化瘀組

討 論

陜西省中醫(yī)藥研究院腎病研究所程小紅主任醫(yī)師基于多年臨床經(jīng)驗，認(rèn)為各類腎小球疾病的中醫(yī)病理發(fā)展基礎(chǔ)是因腎虛日久導(dǎo)致瘀血阻腎絡(luò)，提出“益腎散結(jié)”的學(xué)術(shù)觀點，組成益腎散結(jié)復(fù)方。課題組基于“益腎散結(jié)”的學(xué)術(shù)觀點及前期研究結(jié)果，按照中醫(yī)病機(jī)和組方原則為依據(jù)進(jìn)行拆方，將益腎散結(jié)復(fù)方按照溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組的組方原則進(jìn)行拆方實驗研究，觀察全方組及拆方組對阿霉素腎病大鼠體質(zhì)量、血脂水平、血糖水平、尿蛋白定量、腎功能及腎臟組織形態(tài)學(xué)改變的影響，進(jìn)一步證實其保護(hù)腎臟的有效性[7-10]。全方中黃芪、山藥健脾益氣以滋養(yǎng)先天，山茱萸補益肝腎，收斂固脫，“壯元氣，秘精”，“功專助陽固陰”共為君藥，菟絲子補腎固精，金櫻子固精縮尿，共為臣藥以助君藥益腎之力；仙靈脾溫腎壯陽為佐藥，姜黃以活血化瘀散結(jié)，散體內(nèi)凝滯之血，為使藥，諸藥相伍，以補脾益腎、活血散結(jié)之功，以此來抑制纖維化的發(fā)展保護(hù)腎功能[11-15]。

本研究選取經(jīng)典的阿霉素腎病模型，采用尾靜脈注射方式，造模后的大鼠與正常組大鼠相比，四足均較青紫，且活動度明顯下降[16]，這些指征均類似于中醫(yī)“腎虛血瘀”證的表現(xiàn)。故從狀態(tài)觀察，初步判斷本模型比較符合益腎散結(jié)復(fù)方所治方證的中醫(yī)證候?qū)W特征。本實驗通過觀察益腎散結(jié)全方及拆方組合對阿霉素腎病模型大鼠血生化、尿蛋白定量、腎臟組織形態(tài)學(xué)改變等的影響，研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，阿霉素腎病造模大鼠生長速度緩慢，出現(xiàn)血脂代謝紊亂、尿蛋白及不同程度的腎功能下降。治療后，陽性對照組、益腎散結(jié)復(fù)方全方組及拆方組均不同程度改善脂代謝紊亂，有效降低蛋白尿，改善腎功能，修復(fù)腎臟組織。進(jìn)一步顯示，全方組在控制蛋白尿、改善腎功能、修復(fù)腎臟損傷方面優(yōu)于陽性對照組。此實驗結(jié)果，為進(jìn)一步開展細(xì)胞實驗奠定基礎(chǔ)。